CN108303548A - 一种改进c反应蛋白检测结果一致性的定标方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改进C反应蛋白检测结果一致性的定标方法。本发明提供了一种C反应蛋白校准品，是按照包括如下步骤的方法制备的：收集不同个体的离体血清，混合后得到2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液，定值后得到如下2种浓度的C反应蛋白校准品：1)高值样本：C反应蛋白浓度定值结果为109.9±9.1mg/L的血清溶液；2)低值样本：C反应蛋白浓度定值结果为27.1±2.3mg/L的血清溶液。实验证明，本发明研制的CRP专用校准品，适用于临床常规的CRP检测试剂的校准。本发明的校准方法能到提高个体患者CRP检测结果的一致性和可比性，具有很好的应用前景，值得推广。

Description

一种改进C反应蛋白检测结果一致性的定标方法

技术领域

本发明涉及临床检测领域，具体涉及一种改进C反应蛋白检测结果一致性的定标方法。

背景技术

C反应蛋白(CRP)是肝脏合成的一种急性炎症正时相反应蛋白。正常人血中的CRP浓度很低，在机体突遇紧张、组织创伤和各种炎症刺激时合成快速增加，并从肝细胞中分泌入血液，在感染发生后12-18小时即可检测到高水平的CRP。在感染发生后的12-14天升高的CRP可降至基线水平。因此多年来—直是评价炎症性疾病的指标之一，并且升高幅度与感染的程度呈相关。CRP作为诊断细菌感染的重要标志物之一，已广泛应用于临床。CRP还是一个评估心脏病发生率、复发率、死亡率的临床重要指标。近年来的研究发现，炎症在动脉粥样硬化及肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。鉴于血清CRP的重要作用，其测量的准确性受到了广泛的关注。目前国际溯源联合会(JCTLM)正在着手推进CRP的溯源与标准化工作，国内这方面的工作研究较少。

检测CRP的常用方法多种多样，其中包括散射比浊法、透射比浊法，放射免疫测定、化学发光法、ELISA法及床旁CRP检测(POCT)等。目前临床实验室测定血清中CRP的方法主要是免疫浊度法，包括乳胶增强透射比浊法和速率散射比浊法，这两种方法主要用于自动化分析***，速率散射比浊法多用于免疫检测领域的封闭检测***，乳胶增强透射比浊法多用于生化检测领域的开放检测***。

当前国内CRP的检测结果一致化现状不很理想，各实验室采用的CRP检测***较多，结果间差异较大,不同实验室检测***CV％差别较大。***临床检检中心发布的2016年CRP第二次室间质评数据表明，同一个浓度测定不同组均值差异很大(23.64～28.63mg/L)，不同的检测方法实验室间精密度重现性差异较大(CV％5.42％～12.35％)，其中有三家实验室采用了化学发光法对这一浓度的测定值高达10389.33mg/L，CV％也达到了172.85％，国外Roberts等人研究也证明不同检测***对同一浓度样本的检测数值差别较大。

实现检验结果一致性的重要途径是检测方法的标准化，其关键是保证检测结果的溯源性。为了实现CRP检测的标准化，1987年，WHO研制出第一种CRP国际标准物质WHO IS85/506，它是一个纯物质，浓度为98mg/L。1989年，国际临床化学学会(IFCC)血浆蛋白委员会(C-PP)开始研制通用参考物质。该参考物质包含15种血清蛋白，其中包括CRP。1993年，通过欧洲共同体标准物质局(European Community Bureau of Reference，BCR)认证发布了这种通用参考物质命名为CRM 470，其中为CRP定值时采用国际标准物质WHO IS 85/506进行校准。之后正式命名为ERM DA-470。在发布了ERM-DA470之后，体外诊断试剂厂商们开始使用该标准物质为他们的校准品赋值，各个实验室之间的室间测量结果差异明显变小。

随着ERM-DA470的枯竭，参考物质与测量研究所(IRMM)***际临床化学协会(IFCC)开始研制新的标准物质，于2008年正式发布了该物质，命名为ERM-DA470k。该物质在制备前进行了预试验。预试验数据显示加入纯化CRP，冻干和复溶会导致CRP在方法间定值不同，出现约20％的差异。最终新参考物质ERM-DA470k/IFCC中并未加入CRP的定值。2009年，IRMM联合IFCC研制出ERM-DA472/IFCC。ERM-DA472/IFCC与ERM-DA470k/IFCC使用相同的血清池，鉴于冻干会影响CRP检测结果，ERM-DA472/IFCC对血清直接进行液态冷冻。2011年，他们又研制出ERM-DA474/IFCC。研制过程与ERM-DA472/IFCC大致相同。目前ERM-DA474/IFCC广泛用于厂商CRP诊断试剂校准品的量值溯源。

目前国内没有人血清基质的CRP标准物质，由于国际标准物质价格昂贵，运输周期长，运输条件无法保证等原因，不能用于室间质量评价机构的正确度验证，同时也不能满足我国日益增多的民族企业对CRP高阶标准物质的需要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种C反应蛋白校准品以及一种改进C反应蛋白检测结果一致性的定标方法。

本发明所提供的C反应蛋白校准品，是按照包括如下步骤的方法制备得到的：收集不同个体的离体血清，混合后得到2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液，再分别对所述2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液中的每种血清溶液进行定值，得到如下2种浓度的C反应蛋白校准品：

1)高值样本：C反应蛋白浓度定值结果为109.9±9.1mg/L的血清溶液；

2)低值样本：C反应蛋白浓度定值结果为27.1±2.3mg/L的血清溶液。

其中，所述血清为外观澄清透明，除外黄疸、溶血、脂血及乳糜等异常性状，除外HIV、甲肝、乙肝、丙肝等病毒感染性的人血清。

其中，所述“对所述2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液中的每种血清溶液进行定值”的方法包括如下步骤：采用C反应蛋白国际标准物质进行量值传递的方式对候选C反应蛋白标准物质进行定值。

进一步地，所述“对所述2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液中的每种血清溶液进行定值”的方法具体可包括如下步骤：

(a1)将所述C反应蛋白国际标准物质进行稀释，得到系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液，并计算获得各稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度。

(a2)采用N个C反应蛋白定量检测***分别测定步骤(a1)中获得的各稀释溶液中C反应蛋白的浓度。

(a3)针对所述N个C反应蛋白定量检测***中的每个C反应蛋白定量检测***，均采用步骤(a1)获得的各稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度和步骤(a2)中获得的各稀释溶液中C反应蛋白的测定浓度进行线性拟合，得到C反应蛋白定值标准曲线；即N个C反应蛋白定量检测***得到N个C反应蛋白定值标准曲线。

(a4)采用所述N个C反应蛋白定量检测***分别测定所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度。

(a5)针对所述N个C反应蛋白定量检测***中的每个C反应蛋白定量检测***，均将步骤(a4)获得的所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的测定浓度代入到步骤(a3)获得的相应的C反应蛋白定值标准曲线的方程，从而获得所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度。

即将步骤(a4)中某一C反应蛋白定量检测***测得的所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度值代入到步骤(a3)中获得的该C反应蛋白定量检测***对应的C反应蛋白定值标准曲线的方程，从而获得所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度值，该浓度值即为该C反应蛋白定量检测***对所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度的定值结果。针对N个C反应蛋白定量检测***会得到N个定值结果。

其中，所述C反应蛋白定值标准曲线的横坐标(X)为理论浓度，纵坐标(Y)为测定浓度。步骤(5)中是将所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的测定浓度代入所述C反应蛋白定值标准曲线方程的Y值，计算得到的X值为所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度。

(a6)将步骤(a5)获得的针对所述N个C反应蛋白定量检测***的全部所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度进行求平均处理，所得均值即为所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白浓度的最终定值结果。

该方法中的所述N可为2以上的自然数，具体如N为3-20的自然数，更加具体的，N为10。

更进一步地，所述(a1)具体可按照包括如下步骤的方法实现：

(A)配制系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液：将稀释液和所述C反应蛋白国际标准物质按照不同体积比混合，从而获得系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液；在配制每份所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的过程中，均对组成所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的所述稀释液和所述C反应蛋白国际标准物质分别进行称重。

(B)系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度测定：分别测量步骤(A)中配制的系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的各自的密度。

(C)获得系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度：按照如下公式计算所述系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中的每份稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度，

式中，C1表示所述C反应蛋白国际标准物质中C反应蛋白的浓度；ρ1表示所述C反应蛋白国际标准物质的密度；M1表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中所述C反应蛋白国际标准物质的质量；C2表示所述稀释液中C反应蛋白的浓度；ρ2表示所述稀释液的密度；M2表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中所述稀释液的质量；ρ3表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度；C表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的理论浓度。

更加具体地，步骤(B)中，可按照包括如下步骤的方法测定所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度：

(b1)称出容器和加样枪枪头的质量，记为m1；

(b2)用(b1)中的所述加样枪枪头吸取体积为常数v的待测样本，然后置于(b1)的所述容器中(之前包括“擦去所述加样枪枪头外面粘附的所述待测样本”的步骤)，并整体称重，记为m2；

(b3)按照如下公式计算所述待测样本的密度：ρ_待测＝(m2-m1)/v。

其中，步骤(b1)和(b2)根据需要可进行3-5次重复。相应的，步骤(b3)中的公式等号右边的参数m1和m2取3-5次重复的平均值。

在本发明中，所述C反应蛋白国际标准物质具体选用的是ERM-DA474/IFCC。

在本发明中，步骤(a1)中，将所述C反应蛋白国际标准物质进行稀释时，采用的稀释液具体为低值血清；所述低值血清更加具体的为含有浓度为0.27mg/L的C反应蛋白的血清(浓度0.27mg/L是经超敏方法测定的)。

所述血清为外观澄清透明，除外黄疸、溶血、脂血及乳糜等异常性状，除外HIV、甲肝、乙肝、丙肝等病毒感染性的人血清。

其中，所述C反应蛋白定量检测***在正式试验前均须通过精密度、正确度、***线性、携带污染等一系列的测量***的性能验证。性能验证通过后，一周内进行正式定值实验。

前文所述C反应蛋白校准品在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(i)校准C反应蛋白检测试剂；

(ii)提高多***对个体患者CRP检测结果的一致性和/或可比性。

这里的“***”包括用于定量检测C反应蛋白的仪器和所使用的试剂。如临床实验室C反应蛋白检测***。

本发明所提供的改进C反应蛋白检测结果一致性的定标方法，具体可包括如下步骤：

(c1)准备N份不同浓度的C反应蛋白校准品溶液：一份是前文所述的C反应蛋白校准品中的所述高值样本，一份是前文所述的C反应蛋白校准品中的所述低值样本，另外N-2份是由所述高值样本和所述低值样本按照不同体积比混合而成的系列混合样本，并计算获得各混合样本中C反应蛋白的理论浓度；

(c2)采用步骤(c1)中准备好的N份不同浓度的C反应蛋白校准品溶液对C反应蛋白定量检测***进行校准(即设定基准，某个信号对应的所谓“真值”)，然后检测待测血清样本中C反应蛋白的浓度。

步骤(c1)中，在配制所述系列混合样本的过程中，针对所述系列混合样本中的每个混合样本，均对组成所述混合样本的所述低值样本和所述高值样本分别进行称重，并测定所述混合样本的密度，然后根据所述混合样本密度，以及组成该混合样本的所述低值样本和所述高值样本的质量和计算得到该混合样本的体积，进而计算得到各混合样本中C反应蛋白的理论浓度。

本发明利用IFCC/ERM DA-474进行量值溯源，研制了2水平人血清基质的CRP候选标准物质，该候选标准物质的定值及不确定度分别为109.9±9.1mg/L和27.1±2.3mg/L。本发明制备的专用校准品来源于新鲜冰冻混合人血清，因而具有良好的互换性。当前的文献表明采用互换性校准品，检测人混合血清时，各实验室的检测结果的一致性明显提高。我们采用以上专用校准品，检测能代表临床实际检测状况的单个患者个体血清盘，结果表明校准之后***间的一致化程度明显提高***间的变异系数变为7.03％，满足生物生变异导出的CV最优要求。比例***偏差和固定***偏差都有明显下降，相关性有明显提高。校准后3个检测***的准确性也有显著提高。总之，本发明研制的CRP专用校准品，适用于临床常规的CRP检测试剂的校准。本发明的校准方法能到提高个体患者CRP检测结果的一致性和可比性，具有很好的应用前景，值得推广。

附图说明

图1为增强透射比浊法定值标准曲线(8***)。

图2为速率散射比浊法定值标准曲线(2***)。

图3为高浓度(L1)样本CRP正确度验证结果。

图4为低浓度(L2)样本CRP正确度验证结果。

图5为2015年CRP正确度验证调查评价结果。其中，靶值为(27.1，109.9)mg/L；评价标准为允许偏差(1/2TEa)12.5％；图中的“米”字形符号是标识靶值坐标。

图6为德赛与其他***专用校准品校准前后的相关性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、C反应蛋白校准品的制备、定值及验证

本实施例获得的C反应蛋白校准品的大致制备流程为：收集不同个体的离体血清，混合后得到2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液，再分别对所述2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液中的每种血清溶液进行定值，得到如下2种浓度的C反应蛋白校准品：

1)高值样本：C反应蛋白浓度定值结果为109.9±9.1mg/L的血清溶液；

2)低值样本：C反应蛋白浓度定值结果为27.1±2.3mg/L的血清溶液。

一、材料与方法

1.候选标准物质制备材料和方法

1.1.材料

1.1.1.血清

收集于北京某三甲医院检验科(2016年6月-2016年8月)。遵照国际标准化组织(ISO)指南35及世界卫生组织(WHO)关于制备标准物质血清原料的收集指南，收集健康体检者及住院病人血清置于50ml聚乙烯密闭离心管中，外观澄清透明，除外黄疸、溶血、脂血及乳糜等异常性状，除外HIV、甲肝、乙肝、丙肝等病毒感染性的人血清，不加任何添加物或防腐剂。分别收集CRP高(80.1-200mg/L)和低(10.1-80mg/L)两个浓度)范围的患者血清，每个浓度范围共收集约800ml。

1.1.2.收集管

50ml具螺旋帽聚乙烯洁净塑料管，用于收集血清。1ml具螺旋帽聚乙烯管，环氧乙烷消毒后作为血清分装管。

1.1.3.贝克曼Immage800全自动免疫分析仪(SN:9372)以及配套的试剂定标品，批号是M310472。伯乐液体蛋白两个浓度水平的室内质控品，批号是52482-52483，以上试剂、定标品及质控品均在有效期范围内使用。

1.1.4.过滤装置，滤膜孔径大小分别为0.45μm、0.20μm等。配有真空抽吸泵(美国HENGAO公司)。

2.1.方法

2.1.1.候选标准物质的配制和过滤分装

将收集好的两个浓度范围的血清，每个浓度范围血清约800ml。从-80℃冰箱取出两个浓度范围的所有血清，置于室温融化。然后将分别将两个范围融化后的血清，充分混匀后，取出约0.5ml。使用Beckman Immage800全自动免疫分析仪分别初步测定。混合后高、低两个不同CRP浓度水平大致如下：

水平1(L1)为800ml CRP高值样本，为503例血清样本混合而成，不添加任何物质，采用贝克曼Immage800分析仪检测结果CRP浓度约为110.0mg/L。

水平2(L2)为817ml CRP低值样本，为524例血清样本混合而成，不添加任何物质，采用贝克曼Immage800分析仪检测结果CRP浓度约为25.3mg/L。

将两个浓度混合血清的过滤和分装步骤委托给“北京康彻斯坦生物技术有限公司”进行处理，血清的过滤和分装严格按公认的标准化操作规程(SOP)的要求进行；每管1ml，密封；制备出高、低两个浓度的标准物质分别为754支和743支，分别用不同颜色的管帽区分，分别是绿帽(高水平L1)、白帽(低水平L2)。将这些候选标准物质均放在冷冻盒中，放入-80℃冰箱中保存，每日监测记录冰箱温度情况。

2.多***联合定值实验的材料、方法和实验步骤

2.1.材料

2.1.1.检测***

根据2015～2016年度***及北京市血清学CRP室间质评的数据资料，从CRP测定占主流测量仪器和品牌试剂中选择2家实验室的共10个CRP血清学检测***来作为CRP候选标物的定值***，具体包括：

北京朝阳医院检验科的4个透射比浊法和1个散射比浊法共5个检测***(表1)：

A.西门子ADVIA 2400全自动生化仪配德国西门子原厂试剂、校准品及质控品；

B.西门子ADVIA 2400全自动生化仪配德国德赛试剂、校准品及质控品；

C.西门子ADVIA 2400全自动生化仪配国产利德曼试剂、校准品及质控品；

D.西门子ADIVA 2400全自动生化仪配德国罗氏试剂、校准品及质控品；

E.贝克曼Immage800全自动免疫分析仪配原厂试剂、校准品及伯乐质控品。

北京潞河医院检验科的4个透射比浊法和1个散射比浊法共5个测定***(表2)：

F.贝克曼AU5821全自动生化仪配贝克曼原厂试剂、校准品及质控品；

G.贝克曼AU5821全自动生化仪配北京九强试剂、校准品及质控品；

H.贝克曼AU5821全自动生化仪配日本积水试剂、校准品及质控品；

I.贝克曼AU5821全自动生化仪配宁波美康试剂、校准品及质控品；

J.西门子BNⅡ全自动免疫分析仪配原厂试剂、校准品及质控品。

表1北京朝阳医院检验科5个检测***试剂、校准品、质控品批号及货号

表2北京潞河医院检验科5个检测***试剂、校准品、质控品批号及货号

2.1.2.检测材料及样本

2.1.2.1.试剂：所有测定***的试剂和校准品及室内质控品均在有效期内使用。

2.1.2.2.样本及耗材：经过均匀性、稳定性检测良好的高、低两个浓度的候选CRP标准物质分装好的样品，每支1毫升(步骤1制备)；购买自IFCC的ERM-DA474国际标准物质，批号为：003095；稀释液为CRP低值混合人体检验后血清(后简称低值血清)，经超敏方法检测为0.27mg/L。经校准且有效期范围内的分析天平、加样枪以及烧杯、枪头等辅料。

2.2.方法

2.2.1.原理：经过一系列的预试验的总结，最终决定采用北京市三级医院中的两家检验科实验室的10个定值***对候选标物CRP高、低两个浓度的候选标物进行联合定值，利用IFCC的ERM-DA474国际标准物质进行量值传递。重量法称取低值血清和国际标准物质ERM-DA474，用低值血清准确配制一系列已知浓度的ERM-DA474的标准工作液，并用此法对高值候选标物进行稀释配制高值标物工作液，分别使用已通过性能验证的10个检测***对同一批配置ERM-DA474标准工作液和候选标准物质的样本进行检测。用ERM-DA474标准工作液的CRP实际检测浓度与相应理论值绘制标准曲线。通过标准曲线，经计算得到高、低两个浓度的候选标物样本中的血清CRP浓度。

2.3.实验步骤

2.3.1.测量***定值前准备

a)熟练使用仪器；并在实验当天约原厂技术支持人员一名全程陪同指导并参与检测，最大程度减少测量误差及突发状况。

b)性能验证：所有参与联合定值的检测***在正式试验前均须通过精密度、正确度、***线性、携带污染等一系列的测量***的性能验证。性能验证通过后，一周内进行正式定值实验。

2.3.2.国际标准物质的稀释

根据IFCC的ERM-DA474国际标准物质说明书。每瓶ERM-DA474血清CRP浓度为41.2±2.5mg/L。取ERM-DA474冰冻人血清标准物质6支，严格按照说明书进行复溶和混合。混匀后用加样枪取样，用低值血清(CRP浓度为0.27mg/L)作为稀释液，用分析天平称量法测重量，精确配制工作曲线分析溶液；最终用称重法将ERM-DA474稀释成4个浓度水平,具体配制如表3所示，标记为W1-W4，-80℃冻存备用。

表3称重法稀释ERM-DA474国际标准物质

注：1.共用ERM-DA474国际标物4940μl，实际理论浓度包括密度计算；2.W1-W4每种总配2400μl，均分为4支，每支600μl，放-80℃冻存备用，每日每实验室取一份检测。

表3中实际理论浓度具体计算方法如下：

第一步，用低值血清(CRP浓度为0.27mg/L)作为稀释液，将ERM-DA474稀释为表1中的W1-W4共计四份稀释溶液，期间用分析天平称量法准确测量出配制W1-W4四份稀释溶液时所用的稀释液和ERM-DA474的具体重量；

第二步，W1-W4四份稀释溶液的密度测量

(1)采用鉴定合格的天平，先称出小瓶和加样枪枪头的质量，记为m1。

(2)采用无菌橡胶手套，从小瓶中小心拿出加样枪枪头。

(3)采用经校准的加样枪，准确吸取200μl待测样本，然后擦去加样枪枪头外表面的液体后，将装待测样本的加样枪枪头置于小瓶中，整体称重，记质量为m2。

(4)如此反复称量3次，并作详细记录。

(5)根据液体的密度计算公式为ρ＝(m2-m1)/v1，其中，v1为200μl，求得密度的平均值。

(6)按照(1)～(5)的步骤，算出W1-W4四份稀释溶液的密度。

第三步，W1-W4四份稀释溶液的理论浓度计算

根据作为稀释液的低值血清中CRP的浓度(0.27mg/L)，以及ERM-DA474中CRP的浓度(41.2±2.5mg/L)，计算W1-W4四份稀释溶液的理论浓度。如对于某管W1稀释溶液，ERM-DA474的浓度为C1g/L，密度为ρ1，称取的质量为M1，低值血清的浓度为C2g/L，密度为ρ2，称取的质量为M2，某管本身的密度为ρ3，利用公式得到W1的理论浓度：

2.3.3.CRP候选标准物质的血清样品的制备

水平2(L2)候选标物理论值(约25mg/L)在工作曲线线性范围内，因此不需要稀释，U2即是L2候选标准物质；水平1(L1)候选标物理论值(约110mg/L)超出在工作曲线线性范围，考虑到高值候选标物的实际使用和赋值的准确性，故将L1标物用低值血清稀释成两个浓度即U3和U4后，再进行赋值，U3和U4与ERM-DA474的稀释液(W1-W4)的配制采用同一低值血清(0.27mg/L)，具体配制见表4，U2-U4每种共配制18000μl，每种均分为12支，每支1500μl，放-80℃冻存备用。

表4称重法稀释候选标准物质

注：U2为L2，未被稀释；U3和U4为L1按体积比1：4和1：3稀释配制，用称重法计算(具体参见前文“表3中实际理论浓度具体计算方法”进行)。

2.3.4.所有定值样本的密度测定

由于CRP的准确赋值计算过程中需要各种工作液的密度，所以在配置完成分装冻存前用称重法准确测定各种工作液密度：公式：p＝m/v，吸200μl，分析天平称重测量后计算，每份测定三次，取均值计算，具体见表5。

表5称重法测定样本密度

2.3.5.CRP候选标物定值实验

2.3.5.1.室内质控

定值分别在两家实验室10个已经通过性能验证的测量***上进行，并在通过性能验证后一周内完成所有测定，所有***在测定当天保养、定标，然后两个水平的室内质控均在2SD范围以内，再进行样品测定。

2.3.5.2.测量操作

在多***联合定值中，每个实验室均分两天进行，每天测定前将事先分装好的待测样本逐一从-80℃冰箱中取出，实验室间采用冰袋运送，一小时内送达定值实验室，放置室温待完全复融后开始检测。两家实验室10个测量***，每天每个实验室取W1-W4各1支，U2-U4各3支，室温下复融。每个实验室每个检测***W1-W4每支连续测3次/天，U2-U4每支每个***测定6次*3支＝18次/天。每天测定前每个测量***室内质控均达到规定标准后(即质量控制合格，仪器可以正常工作)，依次对W1-W4，U2-U3开始测定，测定过程中注意室内温湿度的稳定，在所有***测定过程中、后期各加做室内质控和***精密度性能验证中的检测样本，从而保证测定***的稳定。

2.3.5.3.定值的统计方法

用直线拟合的方法给候选标准物质定值。用国际标准物质稀释后的理论浓度和实际测定浓度，每个***做出一条直线。将候选标物样本测出的实际数值的均值代入直线方程，得出X值，即为候选标准物质工作液的浓度，通过运算后得出每一个测定***对L1、L2候选标物的准确的定值数据，然后把10个***的定值结果取均值得出最终候选标准物质的浓度。

2.3.5.4.不确定度的统计方法

根据ISO指南35文件，总不确定度由候选标准物质的定值测量、均匀性、长期稳定性和测量工具如分析天平等引入的不确定度合成，计算公式： 其中式中u2ver为测量不确定度，它包括了标准曲线、测定重复性和ERM-DA474的不确定度；u2bb为不均匀性引入的不确定度；u2lts为长期稳定性引入的不确定度，u2grav为分析天平等测量工具引入的不确定度。国际标准物质ERM-DA474的说明书给出的扩展不确定度是2.5mg/L，所以在计算中应加以考虑。分析运算包括A类和B类不确定度，本次实验中除A类外，还考虑了分析天平的B类不确定度。

3.候选标准物质正确度验证

3.1.实验室及检测***

3.1.1.实验室

北京地区42家医疗机构临床实验室。

3.1.2.检测***

常规CRP血清学免疫检测***或生化检测***，如日立、西门子、Roche，Beckman系列分析仪及其可以配套的试剂、校准品及质控品。

3.2.正确度验证的方法

3.2.1.分发样本

两个浓度水平CRP候选标准物质，每个浓度水平各2支，分发至北京地区42家临床实验室。

3.2.2.测定方法

分别于2日测定(间隔2日)，每天测定1支，测定当天将样本在室温放置30分钟，待其完全融化，平衡至室温后，轻轻上下颠倒10次混匀，避免产生气泡。每支样本CRP在每家实验室现有CRP血清学检测***连续测定3次，测定前保证检测***稳定且室内质控达标(即质量控制合格，仪器可以正常工作)。

3.2.3.运输

运输过程中将样本放置于有冰袋的保温容器中，以保证样本处于冰冻状态。若样本不能及时检测，应存放在2-8℃冰箱冷藏，一周内必须完成检测，且将数据上报至北京市临检中心邮箱。

3.2.4.剔除离群值

用合适的方法剔除离群值，即国家标准《GBT 4883-2008数据的统计处理和解释正态样本离群值的判断和处理》中推荐的Grubbs法。

3.2.5.数据处理

用Excel 2007软件计算每个实验室6次结果均值和标准偏差，以赋值结果为靶值，以***临床检验中心1/2允许总误差(1/2TEa)为允许限，绘制正确度验证示意图；对42家实验室的均值结果采用国家标准(GBT 4883-2008)剔除离群值，采用SPSS17.0对数据就行正态性检验，最后将所有方法的均值(x1)和标准差(sd1，相当于U1)与标准物质认定值(x2)和不确定度(U2)，采用效能函数验证定值的准确性。

3.2.6.室间调查统计方法

偏倚(％)＝(医院临床实验室结果-定值)/定值×100％

二、结果

1.多***定值结果

1.1.10个检测***定值标准曲线

如图1和图2所示。由图可见：各***的线性关系好，候选标准物质的定值在标准曲线的定值范围内。

1.2.CRP候选标准物质10***定值结果

CRP候选标准物质10***定值结果如表6所示。由表可见：各检测***的均值很接近，U2，U3和U4分别为26.24～27.64mg/L，21.45～22.53mg/L，27.41～28.6mg/L。

表6 CRP候选标准物质10***定值结果

1.3.CRP候选标准物质多***定值结果

候选标物最终定值为10***定值的均值，定值过程中的不确定度分量取10个***总不确定度的均值。具体结果过见表7。由表可见：两水平候选标准物质的定值及不确定度分别为109.9±9.1mg/L和27.1±2.3mg/L。

表7 CRP候选标准物质多***定值结果

水平	定值浓度(mg/L)	定值不确定度Uc(mg/L)	定值相对不确定度Uc％
				L1	109.9	9.1	8.25
L2	27.1	2.3	8.58

1.4.总不确定的评估及最终定值结果

具体结果见表8。由表可见：CRP候选标准物质的不确定度拟合了定值过程，均匀性，稳定性和天平称量的误差，并进行了扩展(扩展因子k＝2)，两水平最终的不确定度分别为9.1mg/L和2.3mg/L。

表8 CRP候选标准物质总不确定度评估及最终定值结果

综上，CRP冰冻混合人血清候选标准物质经过ERM-DA474国际标准物质量值传递，经2家实验室，10个主流检测***联合定值，最终定值结果为：水平1(L1)：109.9±9.1mg/L；水平2(L2)：27.1±2.3mg/L，不确定度水平与国际标准物质ERM-DA474相当。

2.正确度验证结果

2.1.正确度验证

CRP候选标准物质样本共分发北京市46家实验室，42家实验室回报结果，其中三级医院30家，二级医院12家。

2.2.CRP候选标准物质水平1(L1)正确度验证结果经处理

42个L1回报结果中，总体均值为114.19mg/L，标准差为19.10，中位值：109.58,最大值为162.07mg/L，最小值为70.1mg/L。根据Grubbs法，所有结果有1个离群值(33.37mg/L)，剔除后的结果见图3，CRP项目室间质量评价允许偏差为±25％，上下限为±12.5％(1/2TEa)。从图3中可以看出高于上限有8家实验室，低于下限有3家实验室，北京市有73.8％的实验室L1测定结果合格。

2.3.CRP候选标准物质水平2(L2)正确度验证结果经处理

42个L2回报结果中，所有方法均值为26.51mg/L，标准差为3.23，中位值：25.65,最大值为33.90mg/L，最小值为20.02mg/L。根据Grubbs法，所有结果无离群值。如图4所示。CRP项目室间质量评价允许偏差为±25％，上下限为±12.5％(1/2TEa)。从图4可以看出，高于上限有5家实验室，低于下限有5家实验室，北京市有76.1％的实验室L2测定结果合格。

经SPSS 17.0Kolmogorov-Smirnov Z检验，实验室回报的L1和L2数据成正态分布，效能函数分别为0.18和0.20，均小于1。

2.4.临床实验室正确度验证结果评价示例

以某家医院为例，其使用贝克曼Immage800全自动免疫分析仪测定CRP样本，本次发放的2个水平样本检测结果均值与定值偏倚分别为5.49％、-2.45％，可以认为其测量结果在允许偏倚≤±12.5％的评价标准下，该常规测量***CRP测量结果正确，结果见表9。

表9北京某医院CRP正确度评价结果

样本批号	均值	靶值	偏倚％	标准差	变异系数％	仪器	方法
								2015L1	109.67	109.9	5.49	0.99	3.85	贝克曼	速率散射比浊法
2015L2	25.67	27.1	-2.45	3.33	3.03	贝克曼	速率散射比浊法

2.5.2015年CRP正确度验证调查评价结果的U顿图见图5。在可接受限内的实验室为30家，占所有回报结果的实验室的比例为71.4％。从图中可以看到位于左下角和右上角的点分别存在和负偏倚和正偏倚，但是图中位于方框外左上方的一点则存在低值过低，高值过高的问题，可能与方法学本身的原因或实验室的操作不当有关。

实施例2、改进C反应蛋白检测结果一致性的定标方法的建立

一、材料方法

1.血清盘收集

从2017年6月19日到6月23日在首都医科大学附属潞河医院收集CRP高中低不同浓度的21例患者验后血清(浓度范围7.1～123.0mg/L，贝克曼5821日本积水试剂)各500μl，冻于-80C，从血清的采集到冻存完成不超过30小时。收集过程中排除了溶血，黄疸和脂血的样本。

2.检测***

在首都医科大学附属北京朝阳医院检验科选用4个透射比浊法检测***：

A.西门子ADVIA 2400全自动生化仪配德国西门子原厂试剂、校准品及质控品；

B.西门子ADVIA 2400全自动生化仪配北京利德曼试剂、校准品及质控品；

C.西门子ADVIA 2400全自动生化仪配德国罗氏试剂、校准品及质控品；

D.西门子ADVIA 2400全自动生化仪配德国德赛试剂、校准品及质控品。

3.实验方案

3.1专用校准品的配制

按照称重法将实施例1制备的C反应蛋白校准品中的低值样本(L：27.1mg/L)和高值样本(H：109.9mg/L)27.1按照体积比L，4L+1H，3L+2H，1L+4H，H配成总体积为500μl的校准点1-5，按照称重法计算其理论浓度如表10。

表10各校准点的配制及浓度

表10中理论浓度具体计算方法如下：

第一步，将实施例1制备的C反应蛋白校准品中的低值样本(L：27.1mg/L)和高值样本(H：109.9mg/L)按照体积比L，4L+1H，3L+2H，1L+4H，H配成总体积为500μl的校准点1-5，期间用分析天平称量法准确测量出配制各溶液时所用的低值样本(L：27.1mg/L)和高值样本(H：109.9mg/L)的具体重量；

第二步，各溶液的密度测量

(1)采用鉴定合格的天平，先称出小瓶和加样枪枪头的质量，记为m1。

(2)采用无菌橡胶手套，从小瓶中小心拿出加样枪枪头。

(3)采用经校准的加样枪，准确吸取200μl待测样本，然后擦去加样枪枪头外表面的液体后，将装待测样本的加样枪枪头置于小瓶中，整体称重，记质量为m2。

(4)如此反复称量3次，并作详细记录。

(5)根据液体的密度计算公式为ρ＝(m2-m1)/v1，其中，v1为200μl，求得密度的平均值。

(6)按照(1)～(5)的步骤，算出各溶液的密度。

第三步，各溶液的理论浓度计算

根据低值样本(L：27.1mg/L)和高值样本(H：109.9mg/L)中CRP的浓度，计算各溶液的理论浓度。如对于某管溶液，高值样本中CRP的浓度为C1g/L，密度为ρ1，称取的质量为M1，低值血清中CRP的浓度为C2g/L，密度为ρ2，称取的质量为M2，某管本身的密度为ρ3，利用公式得到该管的理论浓度：

3.2检测和统计方法

首先，A、B、C和D***的试剂厂商采用各自的校准品校准仪器，然后检测各自的质控品。质控品在控后(即质量控制合格，仪器可以正常工作)，分别检测21个患者血清2次，计算4个***的平均变异系数(CV1)，国际标准物质ERM-DA474/IFCC仅采用A，B和C***检测2次。

然后，采用以上配制的CRP专用校准品对4个***分别校准后，重新检测21个患者样本2次，计算评价变异系数(CV2)，国际标准物质ERM-DA474/IFCC仅采用A,B和C***检测2次。

最后将专用校准品校准前后的CV1和CV2分别与基于生物学变异度导出的最优变异系数CV(CV＝0.25*CV_I，CV_I为个体内生物学变异度)相比较，判断一致化改进效果。同时计算专用校准品校准前后的ERM-DA474/IFCC与认证值(41.2mg/L)的偏倚，判断校准后偏倚是否在其不确定度(2.5mg/L)范围内。

二、实验结果

校准前德赛、利德曼、西门子和罗氏试剂间的平均变异系数(CV)为18.64％(表11)，以德赛为比较检测***，其他检测***作为评价***，所得的斜率范围为0.90-1.09(表13，图6)，相关系数为0.996-0.998；以ERM-DA474/IFCC作为正确度验证物质时，3个***2次检测均值的相对偏差为7.46～-26.86％绝对偏差为3.08～-11.07mg/L，均超出了ERM-DA474/IFCC的不确定度(2.5mg/L)范围之外(表14)。

校准后德赛、利德曼、西门子和罗氏试剂间的平均变异系数(CV)为7.03％(表12)，小于基于生物学变异度导出的CV(CV＝10.6％)。以德赛为比较检测***，其他检测***作为评价***，所得的斜率范围为0.93-0.96(表13，图6)，相关系数为0.997-0.999；以ERM-DA474/IFCC作为正确度验证物质时，3个***2次检测均值的相对偏差为2.31～-7.21％，绝对偏差为0.95～-2.97mg/L，除罗氏试剂的检测***外，其他各***ERM-DA474/IFCC的不确定度(2.5mg/L)范围之内(表14)。

表11专用校准品校准前4***的可比性

表12专用校准品校准后4***的可比性

表13德赛与其他***校准前后的可比性与相关性

表14校准前后各***检测ERM-DA474/IFCC的准确性

检验结果的准确可比能为患者疾病诊断和治疗监测提供科学依据。CRP是临床常用的判断感染和炎症的标志物，对于鉴定细菌或病毒感染有其重要意义。CRP的标准化工作可以追溯到20世纪80年代。目前各厂商的试剂和校准品均声称溯源到国际标准物质ERM-DA474/IFCC。本发明制备了2浓度水平的CRP专用校准品，并采用了10个临床常用的CRP检测***，将ERM-DA474/IFCC的值转移到专用校准品，即获得了专用校准品的定值。

本发明制备的专用校准品来源于新鲜冰冻混合人血清，因而具有良好的互换性。当前的文献表明采用互换性校准品，检测人混合血清时，各实验室的检测结果的一致性明显提高。本发明采用以上专用校准品，检测能代表临床实际检测状况的单个患者个体血清盘，结果表明校准之后***间的一致化程度明显提高***间的变异系数变为7.03％，满足生物生变异导出的CV最优要求。比例***偏差和固定***偏差都有明显下降，相关性有明显提高。校准后3个检测***的准确性也有显著提高，除罗氏检测***外，利德曼和西门子的检测的偏差小于ERM-DA474/IFCC的定值不确定度。

总之，本发明研制的CRP专用校准品，适用于临床常规的CRP检测试剂的校准。本发明的校准方法能到提高个体患者CRP检测结果的一致性和可比性，具有很好的应用前景，值得推广。

Claims (10)

1.一种C反应蛋白校准品，是按照包括如下步骤的方法制备得到的：收集不同个体的离体血清，混合后得到2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液，再分别对所述2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液中的每种血清溶液进行定值，得到如下2种浓度的C反应蛋白校准品：

1)高值样本：C反应蛋白浓度定值结果为109.9±9.1mg/L的血清溶液；

2)低值样本：C反应蛋白浓度定值结果为27.1±2.3mg/L的血清溶液。

2.根据权利要求1所述的C反应蛋白校准品，其特征在于：所述“对所述2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液中的每种血清溶液进行定值”的方法包括如下步骤：采用C反应蛋白国际标准物质进行量值传递的方式对候选C反应蛋白标准物质进行定值。

3.根据权利要求2所述的C反应蛋白校准品，其特征在于：所述“对所述2种不同C反应蛋白浓度的血清溶液中的每种血清溶液进行定值”的方法包括如下步骤：

(a1)将所述C反应蛋白国际标准物质进行稀释，得到系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液，并计算获得各稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度；

(a2)采用N个C反应蛋白定量检测***分别测定步骤(a1)中获得的各稀释溶液中C反应蛋白的浓度；

(a3)针对所述N个C反应蛋白定量检测***中的每个C反应蛋白定量检测***，均采用步骤(a1)获得的各稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度和步骤(a2)中获得的各稀释溶液中C反应蛋白的测定浓度进行线性拟合，得到C反应蛋白定值标准曲线；

(a4)采用所述N个C反应蛋白定量检测***分别测定所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度；

(a5)针对所述N个C反应蛋白定量检测***中的每个C反应蛋白定量检测***，均将步骤(a4)获得的所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的测定浓度代入到步骤(a3)获得的相应的C反应蛋白定值标准曲线的方程，从而获得所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度；

(a6)将步骤(a5)获得的针对所述N个C反应蛋白定量检测***的全部所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度进行求平均处理，所得均值即为所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白浓度的最终定值结果；

所述N为2以上的自然数。

4.根据权利要求3所述的C反应蛋白校准品，其特征在于：所述(a1)是按照包括如下步骤的方法实现的：

(A)配制系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液：将稀释液和所述C反应蛋白国际标准物质按照不同体积比混合，从而获得系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液；在配制每份所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的过程中，均对组成所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的所述稀释液和所述C反应蛋白国际标准物质分别进行称重；

(B)系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度测定：分别测量步骤(A)中配制的系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的各自的密度；

(C)获得系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度：按照如下公式计算所述系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中的每份稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度，

式中，C1表示所述C反应蛋白国际标准物质中C反应蛋白的浓度；ρ1表示所述C反应蛋白国际标准物质的密度；M1表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中所述C反应蛋白国际标准物质的质量；C2表示所述稀释液中C反应蛋白的浓度；ρ2表示所述稀释液的密度；M2表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中所述稀释液的质量；ρ3表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度；C表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的理论浓度。

5.根据权利要求4所述的C反应蛋白校准品，其特征在于：步骤(B)中，是按照包括如下步骤的方法测定所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度的：

(b1)称出容器和加样枪枪头的质量，记为m1；

(b2)用(b1)中的所述加样枪枪头吸取体积为常数v的待测样本，然后置于(b1)的所述容器中，并整体称重，记为m2；

(b3)按照如下公式计算所述待测样本的密度：ρ_待测＝(m2-m1)/v。

6.根据权利要求5所述的C反应蛋白校准品，其特征在于：步骤(b1)和(b2)进行3-5次重复，步骤(b3)中的公式等号右边的参数m1和m2取3-5次重复的平均值。

7.根据权利要求2-6中任一所述的C反应蛋白校准品，其特征在于：所述C反应蛋白国际标准物质为ERM-DA474/IFCC。

8.根据权利要求3-7中任一所述的C反应蛋白校准品，其特征在于：步骤(a1)中，将所述C反应蛋白国际标准物质进行稀释时，采用的稀释液为低值血清；所述低值血清为含有浓度为0.27mg/L的C反应蛋白的血清。

9.权利要求1-8中任一所述的C反应蛋白校准品在如下任一中的应用：

(i)校准C反应蛋白检测试剂；

(ii)提高多***对个体患者CRP检测结果的一致性和/或可比性。

10.一种改进C反应蛋白检测结果一致性的定标方法，包括如下步骤：

(c1)准备N份不同浓度的C反应蛋白校准品溶液：一份是权利要求1-8中任一所述的C反应蛋白校准品中的所述高值样本，一份是权利要求1-8中任一所述的C反应蛋白校准品中的所述低值样本，另外N-2份是由所述高值样本和所述低值样本按照不同体积比混合而成的系列混合样本，并计算获得各混合样本中C反应蛋白的理论浓度；

(c2)采用步骤(c1)中准备好的N份不同浓度的C反应蛋白校准品溶液对C反应蛋白定量检测***进行校准，然后检测待测血清样本中C反应蛋白的浓度；

所述N为3以上的自然数。