CN108300794A

CN108300794A - 一种与仔猪八字腿性状相关的分子标记

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Publication number: CN108300794A
Application number: CN201810356639.1A
Authority: CN
Inventors: 张淑君; 许苏童; 郝兴杰; 王凯; 张敏; 阮捷; 肖世泽; 杨华威; 刘师利; 殷晓雪; 王振骅
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2018-07-20
Anticipated expiration: 2038-04-19
Also published as: CN108300794B

Abstract

本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及仔猪八字腿性状相关的分子标记。该标记从猪HOMER1基因中筛选得到，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在该序列357位碱基处的R是A或G，该等位基因突变导致HOMER1基因多态性。本发明的筛选方法包括：从猪耳组织中提取基因组DNA、设计引物、PCR扩增、对PCR产物进行克隆、测序、序列比较分析、SNP检测、高通量测序分型和利用所得的标记与仔猪八字腿相关性进行分析。本发明公开了猪HOMER1基因内含子4的SNP分型检测技术，发现A357G多态位点与仔猪八字腿呈性状显著相关。本发明为猪标记辅助选择提供了新的遗传标记资源。

Description

一种与仔猪八字腿性状相关的分子标记

技术领域

发明属于猪的标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与仔猪八字腿性状相关的分子标记。所述的分子标记分离来自HOMER1基因的内含子4区域(即该基因的部分核苷酸序列)。本发明还包括该遗传标记在猪标记辅助选择相关分析中的应用。

背景技术

遗传性仔猪八字腿，属于多基因遗传病，发病率为0.7％^[1]。临床表现为新生仔猪后腿外翻，少数病情严重前腿也会受到影响^[2]。该病导致仔猪站立不稳，严重影响到仔猪的行动能力及生长发育，发病的仔猪50％死于饥饿或被压，对生产造成了一定的影响^[3]。造成仔猪八字腿的因素有遗传、环境和疾病等因素。利用分子标记辅助选择(Marker AssistedSelection，MAS)技术，通过对仔猪八字腿相关基因或连锁的遗传标记的选择，实现对控制性状的选择，进而应用于淘汰携带导致八字腿的相关基因的个体，选育无遗传缺陷的优良种猪，对猪品种的遗传改良具有重要的意义。

分子育种的研究和应用在迅速发展，研究筛选到一些与猪遗传病相关的功能基因和遗传位点。猪神经性耳聋是常染色体遗传病，L.Chen等在荣昌猪中发现MITF的启动子的突变可以导致感觉神经听力损失^[4]。Stinckens等发现猪MSTN基因启动子上的g.447A>G突变破坏转录因子MEF3的结合位点可以导致猪肌肉肥大^[5]。

此前，有关猪HOMER1基因的功能尚未报道。HOMER1(homer scaffold protein 1，homer支架蛋白1)主要分布在哺乳动物神经元的突触后密集区，与亲代谢型谷氨酸盐相互作用。HOMER家族蛋白可以通过Ca²⁺/NFAT信号通路调节肌管的分化及胚胎期后肢的发育在肌肉组织中，Ca²⁺可以通过Ca²⁺/NFAT信号通路调节基因的表达^[6]。HOMER1可与TRPC1通道结合，而TRPC1又与肌肉营养障碍的病理学原因有关；基因敲除HOMER1的小鼠表现为TRPC1通道的失调，Ca²⁺流入肌管增加，肌纤维的横断面积减少，骨骼肌力下降^[7]。

发明内容

本发明的目的是筛选一种与仔猪八字腿遗传病相关的遗传标记。通过克隆猪HOMER1基因的内含子4序列，运用直接测序法寻找SNP位点，并通过高通量测序检测基因型。分析该突变位点与仔猪八字腿的相关性。从而为选育无遗传疾病的猪而建立新的标记辅助选择位点。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人所在的课题组前期研究主要是通过全基因组关联分析(Genome-wideassociation study,GWAS)筛选出了仔猪八字腿候选基因HOMER1。本发明获得了猪HOMER1基因内含子4中序列片段(即HOMER1基因的部分核苷酸序列)，该片段长度为819bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，通过NCBI网站对上述序列进行blast对比，在该扩增片段内发现一处核苷酸多态性(SNP)位点，该位点如图2所示。这一处突变位点具体在该序列第357位。申请人将在本说明书中涉及到该突变的位点命名为A357G。

本发明选择八字腿猪和健康猪为试验材料，从猪耳组织中提取基因组DNA，根据Ensemble数据库公布的猪HOMER1基因序列(基因登录号见实施例1所述)设计引物对，该引物的序列如下所示：

正向引物：5’-TGTTCTATAAAGGCACCACC-3’，

反向引物：5’-TCAATCTGGAAGACATGAGC-3’；

上述引物对可对SEQ ID NO:1所述的遗传标记和对HOMER1基因片段(该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)进行分型。

利用该引物对进行PCR扩增、PCR产物的纯化、克隆测序和序列对比分析。

筛选得到一种与仔猪八字腿性状相关的分子标记，该遗传标记的核苷酸序列如下所示(括号内为突变位点，即357-357bp的等位基因突变)

TGTTCTATAAAGGCACCACCAACACTAAATTAGTGAGTATCGAACCATTTTCCTGGGGGACATACAGGGTAGATTCCTGTGAGCCTCTGGTCACATTTTCATCAGCCAATCAATAAATAACCTTGTTTGATGTGTGTTTCTATTTAAAGACACCTTATTTAATATATATTGTTGATTCATTACCATTGACCTCATGGCCAAAAGCACTGTATGTAACTCATGGCTGAAGGAAGCTTATATAACGTTTTTTCCCCTTGAGGCACATCACCGACTTCTTACACCTGGGAACAGACAGCGCTCAGCACTATGCTTGGGGCCCATGTGAAGCAGTGAAAGCACCAACAAAAAGCACAAACR(A/G)TGCAAAAACCATGGTCTGAATTGATTGCAAACAGGACACTTGTTCATACCAAGAGAGCTGATATAAGAAGGCAGTGTTGCCTTGATCAATCTCTGGTGGACATGTGCATTTTAGGTCGCTGGAAAAGACCAAGCAAATACCTCAAGTATGGATTTGGAGGTTACAAATGCATTTTATTGAGTAAGCAAATTCGCAAATATAGCATCTTCTCAAATAATAAGGATTGACAGTAATTGTTTTAAAGAAGCTTGTGATTGAATACTTAAGAGTAGTCAAGTTTGAAAGTAAGTTTCCCTTACTTTCAAGTATGTGGGAGTTTTTGGTTGAGTGGAATCATCCTCATGGTTTTCATGTTCTGTTGTCCAGTGGAATAAAATTGGCTGCTTTCAGTCTCTCGTTTTGTTTTCTTCCCTCCAGGGAACAACCCATCTTCAGCACTCGAGCTCATGTCTTCCAGATTGA

上述序列中357位碱基处的R是A或G，该突变导致HOMER1基因多态性。

申请人提供了一种筛选仔猪八字腿性状相关的分子标记方法，所述的方法包括以下步骤：

从猪(例如：大白猪、长白猪、杜洛克、大白-长白二元杂交猪)耳组织中提取基因组DNA，根据猪HOMER1基因的基因组序列设计引物，该引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3所示，利用所述的引物对在猪基因组DNA中进行PCR扩增，通过直接测序法，得到导致HOMER1基因多态性的核苷酸序列。再利用高通量测序对样本进行分型，HOMER1基因部分核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，在序列表SEQ ID：1所示碱基的第357bp处A/G突变(序列表中的357bp处的序列是突变后的序列“G”)。

利用该突变位点作为遗传标记对仔猪八字腿进行相关分析。

本发明提供了检测上述序列一个变异的基因型分型方法。

进一步，本发明提供了利用高通量测序法确定不同基因型个体与仔猪八字腿之间关联分析。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是猪HOMER1基因的部分核苷酸序列，即作为本发明的遗传标记的核苷酸序列。在该序列的357位碱基处发生由“A”突变为“G”的等位基因突变。

序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3是扩增HOMER1基因的引物对的序列，该引物对也是检测本发明遗传标记的引物对。

图1：本发明的技术流程图。

图2：猪HOMER1基因的部分核苷酸序列及其突变位点示意图。附图标记说明：在SEQID NO:1所示的核苷酸序列的357位碱基处的R(A/G)是等位基因突变，该突变导致HOMER1基因多态性。

图3：本发明对HOMER1基因的直接测序检测结果。附图标记说明：据测序结果可知，该序列的第357位碱基处存在一个A/G等位基因的突变。

具体实施方式

实施例1：猪HOMER1基因内含子4区域的DNA片段的获得及SNP检测方法的建立

本实施例选择八字腿猪(品种为大白猪、长白猪、杜洛克、大白-长白二元杂交猪)和健康猪(品种为大白猪、长白猪、杜洛克、大白-长白二元杂交猪)，根据猪HOMER1基因组报道的序列(登陆号Gene ID：10051070)，设计如下所述的引物对：

正向引物：TGTTCTATAAAGGCACCACC，

反向引物：TCAATCTGGAAGACATGAGC；

用上述引物对在“猪”基因组DNA中进行PCR扩增。

PCR反应体系和PCR反应条件见表1和表2。

PCR反应体系：

表1 PCR反应体系

PCR反应条件：

表2 PCR反应程序

对所得的PCR产物进行纯化和克隆后进行序列测定，测序工作委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成。具体序列如下所述(该序列就是本发明的遗传标记的序列，即SEQ ID NO:1是的序列)：

TGTTCTATAAAGGCACCACCAACACTAAATTAGTGAGTATCGAACCATTTTCCTGGGGGACATACAGGGTAGATTCCTGTGAGCCTCTGGTCACATTTTCATCAGCCAATCAATAAATAACCTTGTTTGATGTGTGTTTCTATTTAAAGACACCTTATTTAATATATATTGTTGATTCATTACCATTGACCTCATGGCCAAAAGCACTGTATGTAACTCATGGCTGAAGGAAGCTTATATAACGTTTTTTCCCCTTGAGGCACATCACCGACTTCTTACACCTGGGAACAGACAGCGCTCAGCACTATGCTTGGGGCCCATGTGAAGCAGTGAAAGCACCAACAAAAAGCACAAACR(A/G)TGCAAAAACCATGGTCTGAATTGATTGCAAACAGGACACTTGTTCATACCAAGAGAGCTGATATAAGAAGGCAGTGTTGCCTTGATCAATCTCTGGTGGACATGTGCATTTTAGGTCGCTGGAAAAGACCAAGCAAATACCTCAAGTATGGATTTGGAGGTTACAAATGCATTTTATTGAGTAAGCAAATTCGCAAATATAGCATCTTCTCAAATAATAAGGATTGACAGTAATTGTTTTAAAGAAGCTTGTGATTGAATACTTAAGAGTAGTCAAGTTTGAAAGTAAGTTTCCCTTACTTTCAAGTATGTGGGAGTTTTTGGTTGAGTGGAATCATCCTCATGGTTTTCATGTTCTGTTGTCCAGTGGAATAAAATTGGCTGCTTTCAGTCTCTCGTTTTGTTTTCTTCCCTCCAGGGAACAACCCATCTTCAGCACTCGAGCTCATGTCTTCCAGATTGA，

经blast对比分析，发现在该序列中在第357位碱基处存在一个等位基因，即A/G基因的突变。该突变引起HOMER1基因多态性。

实施例2：本发明的分子标记与仔猪八字腿的相关性分析及应用

为了确定猪HOMER1基因内含子4中启动子区域内的SNP与仔猪八字腿性状是否相关，选择八字腿猪(样本数为72头)以及正常猪(样本数为110头)为试验材料。采用高通量测序法进行多态性检测，并分析猪HOMER1基因内含子区域不同基因型与仔猪八字腿性状的相关性。

对猪HOMER1基因内含子4区域的A357G多态性位点进行检测，在这个群体中检测到了3种基因型，并利用卡方检验分析这个SNP位点在八字腿猪和健康猪中分布频率是否存在差异，结果如表3所示：

表3健康猪和八字腿猪中A357G等位基因频率分布差异

表3说明：ns，P>0.05；^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001，N代表正常猪，A代表八字腿猪。

由表3可以看出在八字腿猪中这A357G多态性位点的突变型等位基因频率均大于野生型等位基因的频率。并且A357G位点的在八字腿猪和健康猪中分布频率具有极显著差异(P<0.001)，这说明A357G位点与仔猪八字腿性状相关，故SEQ ID NO:1所述的序列可以作为仔猪八字腿的遗传标记。

主要参考文献

[1]Thurley D C,Gilbert F R,Done J T.Congenital splayleg of piglets:myofibrillar hypoplasia[J].Veterinary Record,1967,80(9):302‐304.

[2]Curvers P,Ducatelle R,Vandekerckhove P,De C W,Calus A,HoorensJ.Morphometricevaluation of myofibrillar hypoplasia in splayleg piglets[J].Dtsch Tierarztl Wochenschr,1989,96(4):189‐191.

[3]Dobson K J.Congenital splayleg of piglets[J].Australian VeterinaryJournal,1968,44(1):26.

[4]Chen L,Guo,W.,Wang,J.,Wang,S.,Hu,X.,Li,N.Hereditary sensorineuralhearing loss in Chinese Rongchang pigs result form promoter mutations in Mitf[J].International Society of Animal Genetics:Abstract P2009,2012,

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differing in muscularity[J].Animal genetics,2008,39(6):586.

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序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种与仔猪八字腿性状相关的分子标记

<141> 2018-04-17

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 819

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(819)

<220>

<221> mutation

<222> (357)..(357)

<400> 1

tgttctataa aggcaccacc aacactaaat tagtgagtat cgaaccattt tcctggggga 60

catacagggt agattcctgt gagcctctgg tcacattttc atcagccaat caataaataa 120

ccttgtttga tgtgtgtttc tatttaaaga caccttattt aatatatatt gttgattcat 180

taccattgac ctcatggcca aaagcactgt atgtaactca tggctgaagg aagcttatat 240

aacgtttttt ccccttgagg cacatcaccg acttcttaca cctgggaaca gacagcgctc 300

agcactatgc ttggggccca tgtgaagcag tgaaagcacc aacaaaaagc acaaacgtgc 360

aaaaaccatg gtctgaattg attgcaaaca ggacacttgt tcataccaag agagctgata 420

taagaaggca gtgttgcctt gatcaatctc tggtggacat gtgcatttta ggtcgctgga 480

aaagaccaag caaatacctc aagtatggat ttggaggtta caaatgcatt ttattgagta 540

agcaaattcg caaatatagc atcttctcaa ataataagga ttgacagtaa ttgttttaaa 600

gaagcttgtg attgaatact taagagtagt caagtttgaa agtaagtttc ccttactttc 660

aagtatgtgg gagtttttgg ttgagtggaa tcatcctcat ggttttcatg ttctgttgtc 720

cagtggaata aaattggctg ctttcagtct ctcgttttgt tttcttccct ccagggaaca 780

acccatcttc agcactcgag ctcatgtctt ccagattga 819

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 2

tgttctataa aggcaccacc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 3

tcaatctgga agacatgagc 20

Claims

1.一种与仔猪八字腿性状相关的分子标记，其特征在于它的核苷酸序列如下所示：

2.一种扩增如权利要求1所述的遗传标记和对HOMER1基因片段进行分型的引物对，其核苷酸序列如下所述：

正向引物：TGTTCTATAAAGGCACCACC，

反向引物：TCAATCTGGAAGACATGAGC。

3.权利要求1所述的遗传标记在仔猪标记辅助选择相关分析中的应用。