CN108295249A - Sirt1在制备治疗心肌缺血损伤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因的功能与应用领域，公开了一种催化蛋白质赖氨酸残基去乙酰化的组蛋白去乙酰化酶Sirt1在制备治疗心肌缺血损伤的药物中的应用。本发明确定了去乙酰化酶Sirt1对p21去乙酰化作用与心肌细胞细胞周期之间的相互作用，从而首次将Sirt1作为药物靶标在筛选治疗心肌缺血损伤的药物，特别是用于制备促进心肌再生治疗心肌缺血损伤的药物，进而提供一种治疗心肌缺血损伤的药物，即针对Sirt1的腺相关病毒。

Description

Sirt1在制备治疗心肌缺血损伤的药物中的应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，涉及一种催化蛋白质赖氨酸残基去乙酰化的组蛋白去乙酰化酶Sirt1（Sirtuins1，简称Sirt1）的应用，特别涉及Sirt1在制备治疗心肌缺血损伤的药物中的应用。

背景技术

急性心肌梗塞（MI）导致心肌细胞迅速死亡，随后出现心脏功能障碍。据最新统计数字显示，我国每年因急性心肌梗死而死亡的患者达250万人，心梗目前已高居我国死亡原因第二位。通过心肌再生的方法将有助于增加心肌细胞的数量，进而有效改善心肌梗死后心功能。尽管已经有多种类型的干细胞被移植用于治疗心脏损伤，但是关于使用胚胎干细胞组织的伦理问题仍然存在，而且接受者需要终身免疫抑制以防止细胞排斥。最近的研究已经证明，诱导心肌细胞重新进入细胞周期可能是诱导心脏再生的有前途的方法。

p21由细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A）编码产生，可以通过直接抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK），阻遏细胞的增殖。Sirt1是一种组蛋白去乙酰酶，可使蛋白质中的赖氨酸残基去乙酰化，参与包括组织再生、细胞周期调控、DNA修复及肿瘤发生等重要生物学过程。此外，Sirt1本身具有减少心室不良重构，抑制心肌细胞凋亡及减弱心肌梗塞后的心肌细胞肥大的保护心脏的功能。既往研究表明，p21可抑制心肌细胞周期，进而阻遏心肌再生；而去乙酰化酶Sirt1通过对p21的去乙酰化作用可减少p21表达丰度并消除p21诱导产生的细胞周期阻滞。然而，目前尚不清楚Sirt1对 p21去乙酰化作用是否能够在心肌细胞中调控细胞周期进而影响心肌再生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种催化蛋白质赖氨酸残基去乙酰化的组蛋白去乙酰化酶Sirt1（Sirtuins1，简称Sirt1）的应用。

本发明所述的应用是Sirt1在制备治疗心肌缺血损伤的药物中的应用。

进一步，本发明所述的应用是Sirt1在制备促进心肌再生治疗心肌缺血损伤的药物中的应用。

根据本发明所述的应用的进一步特征，所述治疗心肌缺血损伤的药物是针对Sirt1的腺相关病毒。

刺激终末分化的心肌细胞重新进入细胞周期可能是促进心肌再生治疗心肌缺血性损伤的重要方法，但目前因心肌细胞细胞周期调控机制不明确而缺乏有效的治疗手段。本发明确定了去乙酰化酶Sirt1对 p21去乙酰化作用与心肌细胞细胞周期之间的相互作用，从而首次将Sirt1作为药物靶标在筛选治疗心肌缺血损伤的药物，特别是用于制备促进心肌再生治疗心肌缺血损伤的药物，进而提供一种治疗心肌缺血损伤的药物，即针对Sirt1的腺相关病毒。

通过免疫荧光等方法证实，乙酰化的p21使心肌细胞周期发生阻滞。此外，通过免疫共沉淀、免疫印迹等方法发现Sirt1可在心肌细胞中催化p21的去乙酰化。同时，在体外以过表达Sirt1的腺病毒转染小鼠原代心肌细胞，结果显示过表达Sirt1可以增加心肌细胞增殖。然后，以Sirt1腺相关病毒感染C57小鼠为实验对象，通过结扎左冠状动脉前降支建立小鼠心肌梗死模型，结果表明与空病毒组相比，Sirt1腺相关病毒感染C57小鼠心肌细胞增殖明显增多，细胞凋亡明显减轻，心梗面积明显减少，心室重构和心功能明显改善。最后，在转染了过表达的乙酰化p21的心肌细胞中，过表达Sirt1进行营救实验，证实p21去乙酰化参与了Sirt1诱导的心肌细胞的增殖。这些结果提示Sirt1催化 p21去乙酰化，具有促进心肌再生，减少心室不良重构，改善心肌梗塞后的心脏功能作用，而利用腺相关病毒过表达Sirt1具有促进心肌再生治疗心肌缺血性损伤的作用，为研究治疗心肌缺血性损伤的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。

附图说明

图1A显示在心肌细胞中存在乙酰化p21。

图1B显示p21去乙酰化在体外促进心肌细胞增殖。

图2显示Sirt1催化p21去乙酰化。

图3显示过表达Sirt1促进心肌细胞增殖。

图4A-4F显示过表达Sirt1可以改善心肌梗死后成年小鼠心脏的心脏功能。其中，图4A显示左室舒张末期内径，图4B显示左室收缩末期内径，图4C显示左室短轴缩短率，图4D显示左室射血分数用，图4E显示Masson染色心肌梗死面积，图4F梗死后心肌细胞凋亡。

图5显示Sirt1催化p21去乙酰化，促进心肌细胞增殖。

具体实施方式

以下结合所附的附图详细地描述本发明所涉及的应用的具体实验验证。

1.实验目的

探索在心肌细胞中Sirt1是否可以催化p21去乙酰化，解除p21对心肌细胞细胞周期的抑制作用，进而促进心肌细胞增殖。

2.实验动物及饲养

实验动物：C57BL/6J胎鼠（胎龄为16.5天）、新生小鼠（1天龄）、成年小鼠（28天龄）。由南方医科大学实验动物中心提供。本实验所有的动物实验均获得南方医科大学实验动物委员会的批准，所有的操作均严格按照美国国立卫生院 （NIH）“the guide for the care anduse of Laboratory animals”的规定执行。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在南方医科大学南方医院动物实验中心（SPF级）。小鼠专用饲料由广东省实验动物中心提供。

饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12小时，自由饮水摄食。

3.实验方法

（1）探索p21在心肌细胞表达中是否发生乙酰化以及乙酰化的p21是否引起心肌细胞周期阻滞。

通过免疫共沉淀的方法检测乙酰化p21在心肌细胞的表述情况。在1天龄小鼠心肌细胞中分别转染p21质粒（p21-WT）、乙酰化p21质粒（p21-KQ）、去乙酰化p21质粒（p21-KR）以过表达p21、乙酰化p21、去乙酰化p21，用EdU免疫荧光检测心肌细胞增殖情况。

（2）探索Sirt1是否催化p21去乙酰化。

通过免疫共沉淀、免疫印迹方法，检测Sirt1是否与p21相互作用，催化p21发生去乙酰化。

（3）探索过表达Sirt1对心肌细胞的影响。

用过表达Sirt1的腺病毒（Ad-Sirt1）转染1天龄小鼠心肌细胞，通过免疫荧光检测EdU的染色率，用以观察心肌细胞的增殖情况。

（4）探索过表达Sirt1是否影响心肌梗死后心脏功能的恢复。

采用左冠状动脉前降支结扎的方法建立小鼠心梗模型，模型建立成功的标志为：直视下可见左前降支供应区域心肌变为苍白及心电图 ST 段抬高。分别在梗死7天、14天、21天及28天用2维超声检测以左室收缩/舒张末期内径、左室短轴缩短率及左室射血分数为指标观察左心室功能变化，梗死第28天以Masson染色检测心肌梗死面积、TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况。

（5）探索Sirt1催化p21去乙酰化是否促进心肌细胞的增殖。

在1天龄小鼠心肌细胞中分别转染仅含p21质粒（p21-WT）、过表达乙酰化的p21（p21-KQ）质粒及过表达乙酰化的p21（p21-KQ）质粒+过表达Sirt1的腺病毒（Ad-Sirt1），通过免疫荧光检测EdU的染色率，用以观察不同组别心肌细胞增殖情况。

4. 实验结果

（1）P21在心肌细胞中可被乙酰化，而p21乙酰化后可对心肌细胞细胞周期产生抑制作用，进而抑制心肌细胞增殖。

通过免疫共沉淀方法证实，p21在28天龄小鼠心肌细胞的表达量是1天龄小鼠的1.57倍（*p<0.05，n=3），28天龄小鼠心肌细胞中乙酰化的p21是1天龄小鼠的2.01倍（*p<0.05，n=3），参见图1A。

在1天龄小鼠心肌细胞中，分别转染仅含p21质粒（p21-WT）、过表达去乙酰化的p21（p21-KR）及乙酰化的p21（p21-KQ）质粒，然后通过免疫荧光染色检测EdU的染色率，以观察心肌细胞的增殖情况，结果显示p21-WT、p21-KR、p21-KQ三组EdU的染色率分别为3.93%、8.74%、2.38%（*p<0.05，n=4），参见图1B。

结合图1A-1B结果，表明P21在心肌细胞中可被乙酰化，而p21乙酰化后可对心肌细胞细胞周期产生抑制作用。

（2）Sirt1 催化p21去乙酰化。

分别注射过表达Sirt1的腺病毒载体（Ad-Sirt1）及空载体腺病毒（Ad-NC）至小鼠心脏以过表达Sit1，转染10天后，通过免疫共沉淀、免疫印迹的方法证实过表达Sirt1不仅降低p21的表达量，并且降低p21乙酰化水平，以上结果表明Sirt1催化 p21去乙酰化，参见图2（*p<0.05，n=4）。

（3）过表达Sirt1促进心肌细胞增殖。

在1天龄小鼠心肌细胞中注射过表达Sirt1的腺病毒（Ad-Sirt1），通过免疫荧光染色检测EdU的染色率，用以观察心肌细胞的增殖情况，结果显示过表达Sirt1增加了心肌细胞的EdU阳性率，促进心肌细胞增殖，参见图3（*p<0.05, n=4）。

（4）过表达Sirt1可以改善心肌梗死后成年小鼠心脏的心脏功能。

用冠脉左前降支结扎的方法建立小鼠心梗模型，在心梗边缘区注射腺相关病毒（AAV-Sirt1 or AAV-NC），分别在梗死7天、14天、21天及28天用2维超声检测以左室收缩/舒张末期内经、左室短轴缩短率及左室射血分数为指标观察左心室功能变化，梗死第28天用Masson染色检测心肌梗死面积、TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况，结果提示过表达Sirt1可以改善心肌梗死后成年小鼠心脏的心脏功能，参见图4A-4F（*p<0.05，n=4）。

（5）Sirt1催化p21去乙酰化，进而促进的心肌细胞增殖。

在1天龄小鼠心肌细胞中分别转染仅含p21质粒（p21-WT）、过表达乙酰化的p21（p21-KQ）质粒及过表达乙酰化的p21（p21-KQ）质粒+ 过表达Sirt1的腺病毒（Ad-Sirt1），通过免疫荧光检测EdU的染色率，用以观察不同组别心肌细胞增殖情况，结果提示p21-WT、p21-KQ、p21-KQ+ Ad-Sirt1的EdU染色率分别为3.98%、2.21%、8.09%，提示Sirt1催化p21去乙酰化，可以促进心肌细胞增殖，参见图5（*p<0.05，n=4）。

以上实验结果表明，Sirt1催化p21去乙酰化，解除了p21对心肌细胞周期的抑制作用，进而促进心肌细胞增殖，利用腺相关病毒过表达Sirt1具有促进心肌再生治疗心肌缺血性损伤的作用。

Claims (3)

1.Sirt1在制备治疗心肌缺血损伤的药物中的应用。

2. Sirt1在制备促进心肌再生治疗心肌缺血损伤的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述治疗心肌缺血损伤的药物是针对Sirt1的腺相关病毒。