CN108291254B - 用于检测单核苷酸多态性的试剂盒和方法 - Google Patents

用于检测单核苷酸多态性的试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于检测单核苷酸多态性的试剂盒和方法，更特别地，涉及通过使用等位基因特异性双向引物延伸方法检测单核苷酸多态性的试剂盒和方法。

Description

用于检测单核苷酸多态性的试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及用于检测DNA的试剂盒和方法，更具体地涉及用于检测单核苷酸多态性的试剂盒和方法。
背景技术
由于完成了人类基因组(genome)图，已经提出可以更广泛地实现疾病的预测，疾病的诊断和预后以及对药物响应的预测。近年来，已经揭示了多种基因的功能。由于已经鉴定了多种基因的功能，所以例如可以通过分析人体中某基因的突变来预测发生疾病的风险程度，由此可以预先预防疾病。此外，通过对在活生物体中造成感染的感染原(例如病毒)的基因突变分析，可以分析对某治疗药物具有抗性的病毒。通过上述基因型分析，可以预测感染原对特定治疗药物的响应，例如抗性响应，由此可以开发针对个体患者的个性化治疗方法。当将新的PCR技术应用于作为这样的个性化医疗和伴随诊断之核心技术的单核苷酸多态性(SNP；single nucleotide polymorphism)分析以分析SNP时，可以解决例如在根据患者的基因型的个性化医疗和用于确定药物效力的伴随诊断中现有PCR和NGS(下一代测序(Next Generation Sequencing))的局限性、对昂贵分析***的需求以及在分析之前消耗大量时间的问题。特别地，现有的PCR(例如基于AS-PCR)等具有诸如难以分析杂合(heterotype)点突变的局限性，而使用TaqMan探针等的实时PCR具有由于光源和荧光物质的局限性而使得分析通道(channel)受限并且难以开发即时检验(point-of-care-testing，POCT)装置的缺点。下一代测序(NGS)需要高分析成本、昂贵的***和复杂的过程，耗时而且还不能应用于POCT。
发明内容
技术课题
为了解决包括上述问题在内的多种问题而完成了本发明，本发明的目的在于提供用于检测单核苷酸多态性的新试剂盒和方法，其易于开发成为即时检验(POCT)装置。然而，应该理解的是，该目的仅仅是说明性的，并且本发明的范围不限于上述目的。
解决课题的手段
根据本发明的一个方面，提供了用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i)单核苷酸多态性特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的等位基因有特异性的核苷酸；
ii)用于扩增所述靶核酸的反向引物；以及
iii)延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及标签寡核苷酸。
根据本发明的另一方面，提供了用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i)单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第一等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第一等位基因有特异性的核苷酸；
ii)单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第二等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第二等位基因有特异性的核苷酸；
iii)用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；以及
iv)延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物、单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及包含a)所述第一标签寡核苷酸和b)所述第二标签寡核苷酸中的任一者的标签寡核苷酸。
根据本发明的又一方面，提供了用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i)野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；
ii)突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；
iii)用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；
iv)第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸；以及第一标签寡核苷酸；以及
v)第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分；以及第二标签寡核苷酸。
根据本发明的又一方面，提供了用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i)野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；
ii)突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；
iii)用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；
iv)第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸；以及第一标签寡核苷酸；
v)第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分；以及第二标签寡核苷酸；以及
vi)包含来自所述第一延伸多核苷酸和所述第二延伸多核苷酸的共有序列的延伸产物-扩增正向引物。
根据本发明的又一个方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)向包含待扩增的靶核酸样品、dNTP混合物、热稳定的DNA聚合酶和反应缓冲液的反应溶液中添加以下：a)单核苷酸多态性特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的等位基因有特异性的核苷酸；b)用于扩增所述靶核酸的反向引物；c)延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及标签寡核苷酸；以及d)包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列的延伸产物-扩增正向引物；以及
ii)进行PCR。
根据本发明的又一个方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)向包含待扩增的靶核酸样品、dNTP混合物、热稳定的DNA聚合酶和反应缓冲液的反应溶液中添加以下：a)单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第一等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第一等位基因有特异性的核苷酸；b)单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第二等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第二等位基因有特异性的核苷酸；c)用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；d)延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物、单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及包含1)所述第一标签寡核苷酸和2)所述第二标签寡核苷酸中的任一者的标签寡核苷酸；以及e)包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列的延伸产物-扩增正向引物；以及
ii)进行PCR。
根据本发明的又一个方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)向包含待扩增的靶核酸样品、dNTP混合物、热稳定的DNA聚合酶和反应缓冲液的反应溶液中添加以下：a)野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；b)突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；c)用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；d)第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸；以及第一标签寡核苷酸；e)第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分；以及第二标签寡核苷酸；f)包含选自所述第一延伸多核苷酸的核酸序列的第一延伸产物-扩增正向引物；以及g)包含选自所述第二延伸多核苷酸的核酸序列的第二延伸产物-扩增正向引物；以及
ii)进行PCR。
根据本发明的又一个方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)使用以下来进行靶核酸的等位基因特异性PCR：
单核苷酸多态性特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的等位基因有特异性的核苷酸；以及
用于扩增所述靶核酸的反向引物；以及
ii)通过使用延伸引物对所述等位基因特异性PCR的产物进行引物延伸，所述延伸引物包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及标签寡核苷酸。
根据本发明的又一个方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)使用以下来进行单核苷酸多态性等位基因特异性PCR：
单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第一等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第一等位基因有特异性的核苷酸；
单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第二等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第二等位基因有特异性的核苷酸；
用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；以及
ii)通过使用延伸引物对所述单核苷酸多态性等位基因特异性PCR的产物的进行引物延伸，所述延伸引物包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物、单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及包含a)所述第一标签寡核苷酸和b)所述第二标签寡核苷酸中的任一者的标签寡核苷酸。
根据本发明的又一个方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)使用以下来进行靶核酸的单核苷酸多态性等位基因特异性PCR：
野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；
突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；以及
用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；以及
ii)通过使用以下对所述单核苷酸多态性特异性PCR的产物进行引物延伸：
第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸；以及第一标签寡核苷酸；以及
第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分；以及第二标签寡核苷酸。有利效果
根据本发明的一个实施方案，可以以准确和快速的方式检测某个基因中单核苷酸多态性的存在或不存在和种类。因此，根据本发明实施方案的用于检测单核苷酸多态性的试剂盒和方法可以非常有利地用于伴随诊断(companion diagnostics)，以提供关于包括癌症的多种疾病的诊断，特别是对特定药物的响应的存在或不存在以及选择替代药物方面的重要信息。当然，本发明的范围不受上述效果的限制。
附图简述
图1示意性说明了待通过根据本发明的一个实施方案的单核苷酸多态性检测试剂盒和用于扩增单核苷酸多态性的多种引物进行扩增的单核苷酸多态性。
图2示意性说明了通过根据本发明的一个实施方案的单核苷酸多态性检测试剂盒进行的等位基因特异性核酸扩增反应。
图3示意性说明了根据本发明的一个实施方案的等位基因特异性不对称引物延伸反应和等位基因特异性不对称引物延伸反应的产物的扩增。
图4示意性说明了待通过根据本发明的一个实施方案的单核苷酸多态性检测试剂盒和用于扩增单核苷酸多态性的多种引物进行扩增的单核苷酸多态性。
图5示意性说明了通过根据本发明的一个实施方案的单核苷酸多态性检测试剂盒进行的等位基因特异性核酸扩增反应。
图6示意性说明了根据本发明的一个实施方案的等位基因特异性双向引物延伸反应，其在图5所示的等位基因特异性核酸扩增反应之后使用等位基因特异性延伸引物进行。
图7示意性说明了核酸扩增反应，其中通过PCR扩增等位基因特异性双向引物延伸反应的产物。
图8是说明常规等位基因特异性PCR(AS-PCR)的产物和根据本发明的一个实施方案的等位基因特异性双向引物扩增的产物或者通过进一步扩增上述产物获得的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果的示意图。
图9是显示根据本发明的一个实施方案进行的等位基因特异性PCR的结果的照片。
图10是显示根据本发明的一个实施方案进行的等位基因特异性双向引物延伸PCR的结果的照片。
图11是显示根据本发明的一个实施方案进行的多重等位基因特异性PCR(上图)和多重等位基因特异性双向引物延伸PCR(下图)的结果的照片
具体实施方式
术语定义
在下文中，将定义本文使用的术语。
如本文所用，术语“核苷酸(nucleotide)”是指由碱基、戊糖和磷酸构成的核酸的单体单元。对于DNA，碱基是腺嘌呤(adenine)、鸟嘌呤(guanine)、胞嘧啶(cytosine)和胸腺嘧啶(thymine)，对于RNA，尿嘧啶代替胸腺嘧啶。对于DNA，戊糖是2'-脱氧核糖(2'-deoxyribose)，对于RNA，戊糖是核糖(ribose)。
如本文所用，术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”通常是指核苷酸单体单元的聚合物，其是由13至25个核苷酸构成的短单链核酸分子。在一些情况下，该术语可以指由少于13个核苷酸构成的核酸分子，包括6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、11聚体和12聚体，或者超过25个核苷酸。
如本文所用，术语“多核苷酸(polynucleotide)”通常指核苷酸单元的聚合物，其长于上文定义的寡核苷酸，但也可与术语“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸包括单链和双链核酸分子。
如本文所用，术语“有义链”是指双链DNA分子的一条单链，其以与读出目的基因的方向相同的方向取向，术语“反义链”是指与有义链互补的另一条单链。然而，无论基因读出的方向如何，核酸序列首先已知的链也可以定义为“有义链”，而与其互补的链可以定义为“反义链”。
如本文所用，术语“PCR(聚合酶链式反应(polymerase chain reaction))”或“核酸扩增反应”是指使用热稳定性DNA聚合酶扩增某种靶核酸分子的反应。PCR使用除DNA聚合酶外还含有能够与靶核酸特异性杂交的寡核苷酸引物(正向和反向引物)、脱氧核苷酸混合物(dNTP mixture)、二价离子如Mg2+等的反应缓冲液进行。由PCR反应产生的DNA分子在本文中被称为“扩增产物”。
如本文所用，术语“引物延伸(primer extension)”是指非链式反应，其中具有有限长度的模板核酸使用DNA聚合酶和与其互补的引物延伸，并且其在模板核酸的5'端处终止。由引物延伸产生的DNA分子在本文中被称为“延伸产物”。
如本文所用，术语“引物(primer)”是指与模板DNA互补杂交并且用于启动PCR反应或引物延伸的寡核苷酸或多核苷酸。使用选自与读取待扩增核酸分子的方向以相同方向取向的有义链的正向引物(或有义引物)和选自与有义链互补的反义链的反向引物(或反义引物)进行PCR反应。引物延伸通常使用单一延伸引物进行。
如本文所用，术语“标签(tag)”是指连接到等位基因特异性引物的5'端以便特异性区分某单核苷酸多态性的寡核苷酸。标签根据相应的单核苷酸多态性核苷酸而具有特定的核酸序列。核酸可被设计成与待扩增的靶模板核酸和除延伸引物之外的其他引物没有同源性，因此可被设计为使非特异性扩增最小化。
如本文所用，术语“单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)”是指反映DNA核苷酸序列中单个核苷酸(A、T、G或C)的单一差异的遗传变化或变异。一般而言，SNP定义为出现在群体中以至少1％的频率存在的两个或更多个等位基因(allele)的基因组基因座。等位基因频率为至少5％的多态性被归类为常见多态性(commonpolymorphism)，等位基因频率为1至5％的多态性被归类为罕见多态性(rarepolymorphism)。
如本文所用，术语“等位基因”是指可存在于染色体上相同遗传基因座(geneticlocus)的基因序列的一系列两种或更多种不同形式中的任何一种。有时，其他等位基因可能导致其他可观察到的表型性状。然而，大多数基因突变几乎不引起可观察的突变。如本文所用，“单核苷酸多态性的第一等位基因”和“单核苷酸多态性的第二等位基因”是指多个等位基因，其通过SNP位点处的碱基变异发生并以任意顺序进行区分。当第一等位基因和第二等位基因中的任何一个是主要等位基因(高频等位基因或野生型等位基因)时，另一个可为次要等位基因(低频等位基因或突变体等位基因)。
如本文所用，术语“等位基因特异性双向引物延伸(allele-specificbidirectional primer extension，ASBPE)”意指能够检测SNP突变的存在或不存在和种类的等位基因特异性双向引物延伸反应。通过用包含选自延伸反应中使用的延伸引物的核酸序列的引物对来扩增由延伸反应延伸的核酸分子，可以检测SNP突变的存在或不存在和种类。
发明详细说明
根据本发明的一个方面，提供了用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i)单核苷酸多态性特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的等位基因有特异性的核苷酸；
ii)用于扩增所述靶核酸的反向引物；以及
iii)延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及标签寡核苷酸。
用于检测单核苷酸多态性的试剂盒可进一步包含iv)包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列的延伸产物-扩增正向引物。
在用于检测单核苷酸多态性的试剂盒中，所述单核苷酸多态性可以是野生型或突变体。
根据本发明的另一方面，提供了用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i)单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第一等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第一等位基因有特异性的核苷酸；
ii)单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和所述第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第二等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第二等位基因有特异性的核苷酸；
iii)用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；以及
iv)延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物、单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及包含a)所述第一标签寡核苷酸和b)所述第二标签寡核苷酸中的任一者的标签寡核苷酸。
用于检测单核苷酸多态性的试剂盒可进一步包含v)包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列的延伸产物-扩增正向引物。
延伸多核苷酸的长度可以为20至200nt、30至150nt、或40至100nt。
在用于检测单核苷酸多态性的试剂盒中，第一等位基因可以是野生型，并且第二等位基因可以是突变体。或者，第一等位基因可以是突变体，并且第二等位基因可以是野生型。
根据本发明的另一方面，提供了用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i)野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；
ii)突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；
iii)用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；
iv)第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸；以及第一标签寡核苷酸；以及
v)第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分；以及第二标签寡核苷酸。
用于检测单核苷酸多态性的试剂盒可进一步包含：vi)包含选自所述第一延伸多核苷酸的核酸序列的第一延伸产物-扩增正向引物；以及vii)包含选自所述第二延伸多核苷酸的核酸序列的第二延伸产物-扩增正向引物。
第一延伸多核苷酸和第二延伸多核苷酸可以具有不同的长度，使得电泳后的大小可以彼此区分。例如，当第一延伸多核苷酸的长度为20至50nt时，第二延伸多核苷酸的长度可以为70至200nt。
根据本发明的又一方面，提供了用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i)野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；
ii)突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；
iii)用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；
iv)第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸；以及第一标签寡核苷酸；
v)第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分；以及第二标签寡核苷酸；以及
vi)包含来自所述第一延伸多核苷酸和所述第二延伸多核苷酸的共有序列的延伸产物-扩增正向引物。
用于检测单核苷酸多态性的试剂盒可以进一步包含反应缓冲液、dNTP混合物和热稳定的DNA聚合酶。
在本发明的另一方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)向包含待扩增的靶核酸样品、dNTP混合物、热稳定的DNA聚合酶和反应缓冲液的反应溶液中添加以下：a)单核苷酸多态性特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的等位基因有特异性的核苷酸；b)用于扩增所述靶核酸的反向引物；c)延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及标签寡核苷酸；以及d)包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列的延伸产物-扩增正向引物；以及
ii)进行PCR。
在本发明的另一方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)向包含待扩增的靶核酸样品、dNTP混合物、热稳定的DNA聚合酶和反应缓冲液的反应溶液中添加以下：a)单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第一等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第一等位基因有特异性的核苷酸；b)单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第二等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第二等位基因有特异性的核苷酸；c)用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；d)延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物、单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及包含1)所述第一标签寡核苷酸和2)所述第二标签寡核苷酸中的任一者的标签寡核苷酸；以及e)包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列的延伸产物-扩增正向引物；以及
ii)进行PCR。
在本发明的另一方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)向包含待扩增的靶核酸样品、dNTP混合物、热稳定的DNA聚合酶和反应缓冲液的反应溶液中添加以下：a)野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；b)突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；c)用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；d)第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸；以及第一标签寡核苷酸；e)第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、野生型等位基因特异性正向引物、突变体等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分；以及第二标签寡核苷酸；f)包含选自所述第一延伸多核苷酸的核酸序列的第一延伸产物-扩增正向引物；以及g)包含选自所述第二延伸多核苷酸的核酸序列的第二延伸产物-扩增正向引物；以及
ii)进行PCR。
在用于检测单核苷酸多态性的方法中，进行所述PCR的步骤通过具有退火温度梯度的多个反应来进行，以建立最佳杂交条件。
在本发明的另一方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)使用以下来进行靶核酸的等位基因特异性PCR：
单核苷酸多态性特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的等位基因有特异性的核苷酸；以及
用于扩增所述靶核酸的反向引物；以及
ii)通过使用延伸引物对所述等位基因特异性PCR的产物进行引物延伸，所述延伸引物包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及标签寡核苷酸。
用于检测单核苷酸多态性的方法可以进一步包括iii)通过使用包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列的延伸产物-扩增正向引物和反向引物进行PCR以扩增所述引物延伸的产物。
在本发明的另一方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)使用以下来进行单核苷酸多态性等位基因特异性PCR：
单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第一等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第一等位基因有特异性的核苷酸；
单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第二等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第二等位基因有特异性的核苷酸；以及
用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；以及
ii)通过使用延伸引物对所述单核苷酸多态性等位基因特异性PCR的产物的进行引物延伸，所述延伸引物包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物、单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物和反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸；以及包含a)所述第一标签寡核苷酸和b)所述第二标签寡核苷酸中的任一者的标签寡核苷酸。
用于检测单核苷酸多态性的方法可以进一步包括iii)通过使用包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列的延伸产物-扩增正向引物和反向引物进行PCR以扩增所述引物延伸的产物。
在本发明的另一方面，提供了检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i)使用以下来进行靶核酸的单核苷酸多态性特异性PCR：
野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；
突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和所述第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；以及
用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；以及
ii)通过使用以下对所述单核苷酸多态性特异性PCR的产物进行引物延伸：
第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述野生型等位基因特异性正向引物、所述突变体等位基因特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸；以及第一标签寡核苷酸；以及
第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述野生型等位基因特异性正向引物、所述突变体等位基因特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分；以及第二标签寡核苷酸。
用于检测单核苷酸多态性的方法可以进一步包括iii)通过使用包含选自所述第一延伸多核苷酸的核酸序列的第一延伸产物-扩增正向引物、包含选自所述第二延伸多核苷酸的核酸序列的第二延伸产物-扩增正向引物和所述反向引物进行PCR以扩增所述引物延伸的产物。
在用于检测单核苷酸多态性的方法中，i)和ii)可以通过单个反应器中的单个步骤进行，并且i)至iii)可以通过单个反应器中的单个步骤进行。
在用于检测单核苷酸多态性的方法中，所述单核苷酸多态性特异性PCR可以通过具有退火温度梯度的多个反应来进行，以建立最佳杂交条件。
用于检测单核苷酸多态性的方法可以进一步包括将引物延伸的产物或引物延伸产物的PCR扩增产物加载在凝胶上，对加载的产物进行电泳，然后分析产物的带型。
或者，用于扩增引物延伸产物的PCR可通过常规PCR或实时PCR进行。除了一对引物之外，还可以使用分别特异性结合第一延伸多核苷酸和第二延伸多核苷酸的TaqMan探针进行实时PCR，或者可以使用荧光嵌入螯合物(fluorescent interchelate)如SyBr Green进行实时PCR。在这种情况下，可以根据荧光的种类具体检测延伸产物。
在该方法中，用于扩增引物延伸产物的PCR可通过具有退火温度梯度的多个反应进行，以建立最佳杂交条件。
除非本文另有说明，否则从5'端至3'端读取由多个寡核苷酸和/或多核苷酸组成的核酸分子。
在下文中，将参照附图更详细地描述根据本发明的一个实施方案的试剂盒和方法。
图1是说明待使用根据本发明的一个实施方案的单核苷酸多态性检测试剂盒和用于其扩增的多种引物来检测单核苷酸多态性的示意图；图2是说明使用根据本发明的一个实施方案的单核苷酸多态性检测试剂盒进行的等位基因特异性扩增反应的示意图；而图3是说明等位基因特异性不对称引物延伸反应和扩增等位基因特异性不对称引物延伸反应产物的反应的示意图。如图1所示，可以设想在基因组中的特定基因的特定单核苷酸多态性位点中存在野生型等位基因和突变体等位基因的杂合子。如图1所示，当野生型等位基因中存在C/G碱基对并且突变体等位基因中存在C>A(互补链一侧存在G>T)突变时，可以使用常规等位基因特异性PCR方法、引物和等位基因特异性荧光探针进行实时PCR来检测SNP的存在或不存在。这种方法具有低成本效益，因为其使用昂贵的荧光探针和昂贵的实时PCR***。另一方面，本发明的一个实施方案与常规的等位基因特异性PCR(AS-PCR)类似，因为其使用等位基因特异性引物110和120。然而，在本发明的一个实施方案中，待扩增的靶核酸中不存在的特异性识别标签112和122附接在等位基因特异性引物的5'端，使得可以检测SNP的存在或不存在和类型，而不需要使用荧光探针或实时PCR。野生型等位基因特异性正向引物110的3'端和突变体等位基因特异性正向引物120的3'端分别是存在于单核苷酸多态性中的野生型和突变体核苷酸。因此，野生型等位基因特异性正向引物110可以选择性地仅扩增野生型等位基因，并且突变体等位基因特异性正向引物120可以选择性地仅扩增突变体等位基因(图2)。在这种情况下，通用反向引物130能够扩增野生型等位基因和突变体等位基因两者。同时，在常规AS-PCR中，仅使用野生型等位基因特异性引物或突变体等位基因特异性引物通过单个反应进行PCR，并且由于这个原因，PCR反应应分开进行以区分样品是否具有野生型单核苷酸多态性或突变体单核苷酸多态性。根据常规AS-PCR，不能通过单个反应确认单核苷酸多态性位点是纯合子还是杂合子。如图2和图3所示，根据本发明实施方案的试剂盒可以进一步包含延伸引物160，其具有在其3'端的标签寡核苷酸和在其5'端的延伸寡核苷酸。标签寡核苷酸是两种等位基因特异性正向引物110和120中任何一个的识别核酸序列。在图1中，标签寡核苷酸112是在野生型等位基因特异性引物110的5'端的识别核酸序列。标签寡核苷酸不与包含待扩增的靶核酸的基因组DNA和通用反向引物互补。提供延伸寡核苷酸161用于延伸通过AS-PCR扩增的PCR产物的长度。当在延伸引物160的标签寡核苷酸与等位基因特异性PCR反应产物中的野生型等位基因扩增产物的反义链141的标签寡核苷酸互补序列之间互补结合之后进行引物延伸时，进行等位基因特异性双向引物延伸(ASBPE)(参见图3的顶部)。在等位基因特异性双向引物延伸完成后，可以立即通过琼脂糖凝胶电泳确认延伸产物。当使用选自延伸寡核苷酸161的5'端的核酸序列的延伸产物扩增正向引物200扩增延伸产物并且使用用于等位基因特异性扩增的反向引物扩增延伸产物时，可以通过ASBPE产物的扩增更可靠地检测等位基因特异性延伸产物。在通过单独ASBPE反应进行检测的情况和通过ASBPE反应和延伸产物扩增进行检测的情况下，通过适当控制所使用引物的浓度可以建立最佳检测条件。
图9示出了如图1至3中所示根据本发明实施方案的方法通过特异性扩增杂合的单核苷酸多态性位点获得的实验结果。如图9所示，通过等位基因特异性PCR(AS-PCR)(115bp)扩增野生型等位基因，并且通过本发明的等位基因特异性双向引物延伸PCR(115+117bp)扩增突变体等位基因。然而，应理解，可以通过等位基因特异性PCR(AS-PCR)扩增突变体等位基因，并且通过本发明(115+117bp)扩增野生型等位基因。
图4至图7示出了本发明的另一个实施方案。图4与图1的区别在于延伸引物不仅应用于野生型等位基因，而且应用于突变体等位基因，因此使用两种延伸引物。因此，在图4所示的实施方案中，在等位基因特异性PCR后，通过等位基因特异性双向引物延伸PCR扩增野生型和突变体等位基因二者。图5是说明等位基因特异性PCR过程的示意图；图6是说明等位基因特异性双向引物延伸过程的示意图；而图7是说明用于等位基因特异性双向引物延伸产物的PCR过程的示意图。图8示意性地显示在通过AS-PCR和根据本发明一个实施方案的等位基因特异性双向引物延伸PCR扩增野生型和突变体等位基因之后，当进行琼脂糖凝胶电泳时预期获得的条带图谱。
如图4中所示，野生型等位基因特异性正向引物110的5'端和突变体等位基因特异性正向引物120的5'端是不存在于待扩增的靶核酸中的核酸序列，并且分别作为野生型等位基因特异性扩增产物和突变体等位基因特异性扩增产物的特异性标签。为了便于解释，将包含在野生型等位基因特异性正向引物中的标签定义为第一标签寡核苷酸112，并且将包含在突变体等位基因特异性正向引物中的标签定义为第二标签寡核苷酸122。如果目的单核苷酸多态性位点中存在多个突变，则可以向正向引物添加第三标签寡核苷酸(未示出)和/或第四标签寡核苷酸(未示出)。为了便于解释和区分，将包含第三标签寡核苷酸的突变体等位基因特异性正向引物定义为第二突变体等位基因特异性正向引物(未示出)，并且将包含第四标签核苷酸的突变体等位基因特异性正向引物定义为第三突变体等位基因特异性正向引物(未示出)。如图5所示，使用分别包含第一标签寡核苷酸112和第二标签寡核苷酸122的野生型等位基因特异性正向引物110和突变体等位基因特异性正向引物120以及通用反向引物130通过PCR反应产生野生型等位基因扩增产物140和突变体等位基因扩增产物150。该步骤中的两种PCR产物彼此不能区分，因为它们具有相同的大小，并且它们在电泳凝胶上的条带彼此重叠。第一标签寡核苷酸112和第二标签寡核苷酸122分别用作用于引物延伸的第一延伸引物的3'端序列和第二延伸引物的3'端序列。因此，如图6所示，通过变性成为单链的野生型扩增产物的反义链141与位于第一延伸引物160的3'端的第一标签寡核苷酸112特异性杂交，而突变体等位基因扩增产物的反义链151与位于第二延伸引物170的3'端的第二标签寡核苷酸122特异性杂交，从而分别产生第一延伸产物180和第二延伸产物190。在这种情况下，由于第一延伸引物160和第二延伸引物170具有不同的长度，所以第一延伸产物180和第二延伸产物190可以通过使用凝胶电泳分析其条带图谱来彼此区分。本发明人将这种等位基因特异性引物延伸命名为等位基因特异性双向引物延伸(ASBPE)。单核苷酸多态性可以仅通过ASBPE检测。然而，当模板核酸分子的浓度低时，仅通过引物延伸可能难以检测等位基因特异性核酸分子。在这种情况下，如图4所示，通过使用由选自第一延伸引物和第二延伸引物的特定核酸序列构建的延伸产物扩增正向引物200和上述通用反向引物130扩增第一延伸产物和第二延伸产物，可以实现更可靠地检测单核苷酸多态性。在这种情况下使用的延伸产物扩增正向引物200可以使用第一延伸引物和第二延伸引物中共同存在的序列构建，并且还可以使用彼此不同的特定核酸序列构建。在说明本发明的一个实施方案的图4和7中，仅示出了使用第一延伸引物160和第二延伸引物170中共同存在的序列构建的延伸产物扩增正向引物200。
图10显示了根据上述实施方案进行的实际实验的结果。如图10所示，在纯合子或杂合子UGT1A1*28上进行本发明的等位基因特异性双向引物延伸PCR。结果，通过野生型等位基因特异性正向引物及其延伸引物仅检测到野生型等位基因(181bp)，而通过突变体等位基因特异性正向引物及其延伸引物仅检测到突变体等位基因(231bp)。另外，在杂合UGT1A1*28中，两个等位基因都被检测到。
图11示出了根据本发明实施例进行多重PCR以同时检测多个等位基因的结果。通过根据本发明实施例的等位基因特异性双向引物延伸PCR扩增UGT1A1*6和UGT1A1*28。结果，两种等位基因都可以检测到，同时其准确区分了野生型和突变体。
实施例
在下文中，将参考非限制性实施例描述本发明。然而，应该理解，这些实施例仅用于说明的目的，并不意图限制本发明的范围。因此，本领域技术人员根据本发明的详细描述和实施例可以容易地想到的哪些内容被解释为落入本发明的范围内。
实施例1：靶核酸分子的等位基因特异性扩增
在本发明中，为了检查是否可以通过如上所述的等位基因特异性双向引物延伸来快速确定单核苷酸多态性(SNP)的存在或不存在和类型，首先进行检查来确定是否可以使用已知具有SNP的BCR-ABL基因作为模板进行等位基因特异性PCR。
特别地，为了检测对应于由SEQ ID NO:1表示的模板DNA(人c-abl癌基因(oncogene))的第318位核苷酸的SNP(C>T)，使用作为等位基因特异性引物的由SEQ ID NO:2表示的C-特异性引物和SEQ ID NO:3表示的T-特异性引物以及由SEQ ID NO:4表示的反向引物通过等位基因特异性PCR产生115bp的扩增产物。在这种情况下，两个正向引物均具有引入到3'端的第3个核苷酸的故意错配(C>A)。已知这种错配使得等位基因特异性引物的扩增更稳定地进行(Liu等.Plant Methods 2012,8:34,2012)。另外，为了优化引物的退火温度，在顺序地控制多个反应物的退火温度的同时进行温度梯度PCR。PCR反应进行三次。所使用的PCR反应溶液的组成和PCR反应条件分别示于表1和表2。
表1：等位基因特异性PCR反应溶液的组成
Figure GDA0001678621860000211
Figure GDA0001678621860000221
表2：等位基因特异性PCR反应的条件
Figure GDA0001678621860000222
温度梯度AS-PCR的结果表明C-特异性正向引物和T-特异性正向引物分别形成野生型和突变体等位基因特异性扩增产物(参见图9)。因此，表明根据本发明实施方案的等位基因特异性引物正确地运行。同时，为了检查最佳退火温度，使用多种退火温度进行温度梯度PCR。结果，可以看出约57℃的退火温度对于野生型和突变体等位基因两者都是最佳的。
实施例2：延伸引物的构建
本发明人制备了待用于等位基因特异性PCR之后的等位基因特异性双向引物延伸的延伸引物。特别地，使用与人基因组DNA具有低序列同源性的由SEQ ID NO:5表示的pBR322质粒(Promega,USA)作为模板，并且使用由SEQ ID NO:6表示的正向引物和由SEQ IDNO:7表示的反向引物进行扩增，从而产生117bp扩增产物。在此，正向引物由存在于pBR322质粒中的同源序列和附接在同源序列的5'端并与下面将要描述的第二标签寡核苷酸互补的第二标签互补寡核苷酸(SEQ ID NO:8)构成。
实施例3：构建含标签的引物和使用其的ASBPE反应
在本发明中，在AS-PCR中的正向引物的5'端设计与人基因组中的任何序列具有低同源性并因此不显示假阳性结果的具有特异性核酸序列的标签寡核苷酸，并且使用具有所设计的标签寡核苷酸的正向引物进行等位基因特异性PCR。在本发明所属技术领域中，标签寡核苷酸也被称为ZIP编码序列。ZIP编码序列是具有基因组DNA的核苷酸序列中不存在的序列的核苷酸寡聚物，是为了不与基因组DNA非特异性杂交而设计的序列。本发明所属技术领域的任何技术人员将容易理解，除了以下实施例中使用的ZIP编码序列之外，还可以使用本领域已知的多种编码序列对引物进行修饰(参见Slentz-Kesler等,Genome Res.,10:549-557,2010)。
特别地，在本发明中，通过将在实施例1中使用的突变体等位基因特异性正向引物(SEQ ID NO:3)的5'端附接到与由SEQ ID NO:8表示的第二标签互补寡核苷酸互补并且能够鉴定突变体等位基因的由SEQ ID NO:10表示有特异性标签寡核苷酸(第二标签寡核苷酸)来构建突变体等位基因特异性引物(SEQ ID NO:9)。使用实施例1中构建的野生型等位基因特异性正向引物，如上所述构建的突变体等位基因特异性引物，用于构建实施例2中的延伸引物的SEQ ID NO:7的反向引物(反向引物充当用于扩增该PCR中的延伸产物的正向引物)和实施例1中使用的通用反向引物，使用与实施例1中所述相同的方式进行PCR，只是将退火温度设定为57℃。结果，如图9所示，检测到以下两个片段：使用野生型等位基因特异性正向引物和通用反向引物通过等位基因特异性PCR扩增的115bp片段；和根据本发明实施方案通过等位基因特异性双向引物延伸产生的232bp片段。
实施例4：UGT1A1基因的SNP分析
在本发明中，使用根据本发明的实施方案的ASBPE试剂盒分析UGT1A1*28的基因型，其为已知与抗癌药伊立替康的副作用相关的UDP葡糖醛酸基转移酶家族1成员A1(UGT1A1)的SNP。
特别地，使用用于UGT1A1*28的野生型等位基因特异性正向引物(SEQ ID NO:11)和突变体等位基因特异性正向引物(SEQ OD NO:12)以及用于UGT1A1*28的反向引物(SEQID NO:13)，进行等位基因特异性PCR。
接下来，使用用于野生型等位基因的野生型等位基因特异性延伸引物(SEQ IDNO:14)和用于突变体等位基因的突变体等位基因特异性延伸引物(SEQ ID NO:15)进行引物延伸。
最后，使用通用延伸产物扩增正向引物(SEQ ID NO:16)和反向引物(SEQ ID NO:13)进行野生型等位基因延伸产物和突变体等位基因延伸产物的扩增。
然而，上述三个反应不是顺序进行的，而是在下面的条件下通过单个反应器中的单个步骤进行。
表3：等位基因特异性ASBPE-PCR反应条件
Figure GDA0001678621860000241
结果，如图10所示，可以使用根据本发明实施方案的ASBPE试剂盒来扩增突变体等位基因，并且可以使用AS-PCR来扩增野生型等位基因，而两种等位基因可以彼此清楚地区分。
实施例5：UGT1A1基因的SNP的多重分析
此外，在本发明中，为了检查是否可以通过根据本发明实施方案的ASBPE试剂盒进行能够同时检测两个等位基因的基因型的多重分析，使用单独或作为混合物的UGT1A1*6和UGT1A1*28的野生型基因组DNA以单一方式或多重方式进行等位基因特异性PCR，并且使用单独或作为混合物的UGT1A1*6和UGT1A1*28的突变体基因组DNA以多重方式进行使用根据本发明的实施方案的ASBPE试剂盒的PCR。
特别地，制备单独或作为混合物的UGT1A1*6野生型基因组DNA和UGT1A1*28野生型基因组DNA，然后使用基因组DNA作为模板，在上表3所示条件下使用每种野生型等位基因特异性正向引物(SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:11)和每种反向引物(SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:13)进行等位基因特异性PCR。结果，如图11的顶部所示，也可以通过AS-PCR特异性扩增UGT1A1*6野生型基因组DNA和UGT1A1*28野生型基因组DNA。另外，在本发明中，制备单独或作为混合物的UGT1A1*6突变型基因组DNA和UGT1A1*28突变体基因组DNA，然后使用基因组DNA作为模板，在表3中所示的条件下使用每种突变体等位基因特异性正向引物(SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:12)，通用反向引物(SEQ ID NO:13)，每种UGT1A1*6突变体特异性和UGT1A1*28突变体特异性延伸引物(SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:15)，以及包含存在于UGT1A1*6和UGT1A1*28各自的突变特异性延伸引物的5'端的共有序列的延伸产物扩增正向引物(SEQ ID NO:16)进行等位基因特异性双向引物延伸PCR(ASBPE-PCR)。
结果，如图11所示，根据本发明实施方案的等位基因特异性双向引物延伸PCR试剂盒可以以单一形式或多重形式两种情况清楚地检测UGT1A1*6和UGT1A1*28各自的突变体等位基因。此外，这些结果是通过由等位基因特异性PCR、等位基因特异性双向引物延伸和延伸产物的PCR扩增构成的单一PCR过程获得，并且这些结果证明根据本发明实施方案的方法和试剂盒可用于在与常规AS-PCR相同的时间段内以多重形式区分野生型等位基因和突变体等位基因，并且也可用于同时检测多种SNP。
因此，根据本发明实施方案的等位基因特异性双向引物延伸可以用于准确有效地确定特定靶核酸分子中特定位置处SNP的存在或不存在和种类。此外，根据本发明的实施方案的方法是非常具有成本效益，因为其可以通过单个管中的单个反应来进行，并且其可以在简单凝胶电泳之后通过分析条带图案以容易和便宜的方式进行，而不需要使用昂贵的装置。
尽管已经参照实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，这些实施方案仅仅是示例性的，并且多种修改和其他等同实施方案是可能的。因此，本发明的真实技术范围应由所附权利要求的技术精神限定。工业实用性
根据本发明的实施方案的方法和试剂盒可用于检测多种动物和植物(特别是人)中的SNP，并且还可以用于基于检测结果来诊断疾病和预测药物响应性。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1-20是根据本发明实施方案的方法和试剂盒中所用引物的核酸序列。
Figure IDA0001678621870000011
Figure IDA0001678621870000021
Figure IDA0001678621870000031
Figure IDA0001678621870000041
Figure IDA0001678621870000051
Figure IDA0001678621870000061

Claims (19)

1.用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i）单核苷酸多态性特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的等位基因有特异性的核苷酸；
ii）用于扩增所述靶核酸的反向引物；以及
iii）延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述单核苷酸多态性特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸，其中所述延伸多核苷酸被提供成通过引物延伸反应来延伸PCR产物的长度；以及所述标签寡核苷酸；并且
其中所述延伸多核苷酸的长度为20至200 nt。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包含iv）包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列的延伸产物-扩增正向引物。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述单核苷酸多态性是野生型或突变体。
4.用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i）单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第一等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第一等位基因有特异性的核苷酸；
ii）单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和所述第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第二等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第二等位基因有特异性的核苷酸；
iii）用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；以及
iv）延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物、所述单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸，其中所述延伸多核苷酸被提供成通过引物延伸反应来延伸PCR产物的长度；以及包含a）所述第一标签寡核苷酸和b）所述第二标签寡核苷酸中的任一者的标签寡核苷酸；并且
其中所述延伸多核苷酸的长度为20至200 nt。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其还包含含有选自所述延伸多核苷酸的核酸序列的延伸产物-扩增正向引物。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述第一等位基因是野生型，并且所述第二等位基因是突变体。
7.用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i）野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；
ii）突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和所述第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；
iii）用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；
iv）第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述野生型等位基因特异性正向引物、所述突变体等位基因特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸，其中所述第一延伸多核苷酸被提供成通过引物延伸反应来延伸第一PCR产物的长度；以及所述第一标签寡核苷酸；以及
v）第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述野生型等位基因特异性正向引物、所述突变体等位基因特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分，其中所述第二延伸多核苷酸被提供成通过引物延伸反应来延伸第二PCR产物的长度；以及所述第二标签寡核苷酸；并且
其中所述第一延伸多核苷酸的长度为20至50 nt，并且所述第二延伸多核苷酸的长度为70至200 nt。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其还包含：vi）包含选自所述第一延伸多核苷酸的核酸序列的第一延伸产物-扩增正向引物；以及vii）包含选自所述第二延伸多核苷酸的核酸序列的第二延伸产物-扩增正向引物。
9.用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，其包含：
i）野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；
ii）突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和所述第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；
iii）用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；
iv）第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述野生型等位基因特异性正向引物、所述突变体等位基因特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸，其中所述第一延伸多核苷酸被提供成通过引物延伸反应来延伸第一PCR产物的长度；以及所述第一标签寡核苷酸；
v）第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述野生型等位基因特异性正向引物、所述突变体等位基因特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分；以及所述第二标签寡核苷酸，其中所述第二延伸多核苷酸被提供成通过引物延伸反应来延伸第二PCR产物的长度；以及
vi）包含来自所述第一延伸多核苷酸和所述第二延伸多核苷酸的共有序列的延伸产物-扩增正向引物；并且
其中所述第一延伸多核苷酸的长度为20至50 nt，并且所述第二延伸多核苷酸的长度为70至200 nt。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的试剂盒，其还包含反应缓冲液、dNTP混合物和热稳定的DNA聚合酶。
11.不用于疾病诊断目的的检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i）使用以下来进行靶核酸的等位基因特异性PCR：
单核苷酸多态性特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的等位基因有特异性的核苷酸；以及
用于扩增所述靶核酸的反向引物；以及
ii）通过使用延伸引物对所述等位基因特异性PCR的产物进行引物延伸，所述延伸引物包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述单核苷酸多态性特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸，其中所述延伸多核苷酸被提供成通过引物延伸反应来延伸PCR产物的长度；以及所述标签寡核苷酸；并且
其中所述延伸多核苷酸的长度为20至200 nt。
12.根据权利要求11所述的方法，其还包括iii）通过使用延伸产物-扩增正向引物和所述反向引物进行PCR以扩增所述引物延伸的产物，所述延伸产物-扩增正向引物包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列。
13.不用于疾病诊断目的的检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i）使用以下来进行单核苷酸多态性等位基因特异性PCR：
单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第一等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第一等位基因有特异性的核苷酸；
单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和所述第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及单核苷酸多态性第二等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的所述第二等位基因有特异性的核苷酸；以及
用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；以及
ii）通过使用延伸引物对所述单核苷酸多态性等位基因特异性PCR的产物进行引物延伸，所述延伸引物包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述单核苷酸多态性第一等位基因特异性正向引物、所述单核苷酸多态性第二等位基因特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的延伸多核苷酸，其中所述延伸多核苷酸被提供成通过引物延伸反应来延伸PCR产物的长度；以及包含a）所述第一标签寡核苷酸和b）所述第二标签寡核苷酸中的任一者的标签寡核苷酸；并且
其中所述延伸多核苷酸的长度为20至200 nt。
14.根据权利要求13所述的方法，其还包括iii）通过使用延伸产物-扩增正向引物和反向引物进行PCR以扩增所述引物延伸的产物，所述延伸产物-扩增正向引物包含选自所述延伸多核苷酸的核酸序列。
15.不用于疾病诊断目的的检测单核苷酸多态性的方法，其包括：
i）使用以下来进行靶核酸的单核苷酸多态性特异性PCR：
野生型等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸杂交的5'端第一标签寡核苷酸；以及野生型等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的野生型等位基因有特异性的核苷酸；
突变体等位基因特异性正向引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸和所述第一标签寡核苷酸杂交的5'端第二标签寡核苷酸；以及突变体等位基因特异性寡核苷酸，其能够与所述靶核酸特异性杂交，并且在其3'端具有对于所述单核苷酸多态性的突变体等位基因有特异性的核苷酸；以及
用于扩增所述靶核酸的通用反向引物；以及
ii）通过使用以下对所述单核苷酸多态性特异性PCR的产物进行引物延伸：
第一延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述野生型等位基因特异性正向引物、所述突变体等位基因特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的第一延伸多核苷酸，其中所述第一延伸多核苷酸被提供成通过引物延伸反应来延伸第一PCR产物的长度；以及所述第一标签寡核苷酸；以及
第二延伸引物，其包含：在PCR条件下不与所述靶核酸、所述野生型等位基因特异性正向引物、所述突变体等位基因特异性正向引物和所述反向引物中的任一个杂交的第二延伸多核苷酸，其中所述第二延伸多核苷酸被提供成通过引物延伸反应来延伸第二PCR产物的长度，所述第二延伸多核苷酸的长度在凝胶电泳中与所述第一延伸多核苷酸的长度可区分；以及所述第二标签寡核苷酸；并且
其中所述第一延伸多核苷酸的长度为20至50 nt，并且所述第二延伸多核苷酸的长度为70至200 nt。
16.根据权利要求15所述的方法，其还包括iii）通过使用包含选自所述第一延伸多核苷酸的核酸序列的第一延伸产物-扩增正向引物、包含选自所述第二延伸多核苷酸的核酸序列的第二延伸产物-扩增正向引物以及所述反向引物进行PCR以扩增所述引物延伸的产物。
17.根据权利要求11、13和15中任一项所述的方法，其中i）和ii）通过单个反应器中的单个步骤进行。
18.根据权利要求12、14和16中任一项所述的方法，其中i）至iii）通过单个反应器中的单个步骤进行。
19.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述单核苷酸多态性特异性PCR通过具有退火温度梯度的多个反应来进行，以建立最佳杂交条件。
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