CN108290056A - 短合成肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

在此提供一种用以治疗和/或预防干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病或症状的合成肽，以及包含所述合成肽的组合物。再者，本发明内容亦提供一种治疗和/或预防干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤的方法，通过施用含有一治疗有效量的合成肽的组合物至需要治疗的个体。

Description

短合成肽及其用途
技术领域
本发明是关于发现一种短合成肽，以及其用以治疗和/或预防干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状的用途。
背景技术
干眼症通常是由于泪液产生过程异常所导致的眼疾，例如，泪液分泌量减少、泪液过度蒸发，亦或是泪膜中的泪液黏蛋白异常或脂质成分覆盖正常眼睛表面。干眼症的典型症状包含干涩、粗糙感、刺痛感、长时间阅读困难、灼热感，甚至会因泪液不足而分泌过多的泪水或过度湿润。在严重的病例中，患者异常畏光，眼部剧烈疼痛，且感觉视力逐渐下降。干眼症传统治疗方法主要对症治疗，而非从病因着手。举例而言，人工泪液或眼润滑液为常见的处置方式。虽然人工泪液能够提供暂时舒缓的效果，但其仅能缓和所述症状。再者，人工泪液所含的防腐剂实质上会使这些症状更为严重，甚至杀死角膜细胞。至今仍然缺乏有效解决干眼症所有问题的治疗方法。
牛皮癣病征为病灶处呈粉色或红色，且被银屑所覆盖。这些病灶主要位于手肘和膝盖、头皮和生殖器区域。所述症状的显著特征是表皮层加速再生，使得表皮层增厚。一般表皮层每25-30天进行再生，而牛皮癣皮肤约3-4天即进行再生。在此速率下，会影响皮肤色泽，导致色素沉着过多或过少。牛皮癣持续时期也有很多变化，患者可能终其一生都有牛皮癣病灶，或是病灶仅短期间存在。过去本领域人士已尝试使用多种方式来治疗牛皮癣，第一种是施用含有水杨酸(作为活性成分)的局部制剂治疗所述症状。然而，水杨酸具有刺激性，通常会使病症恶化。另一种常用局部制剂的活性成分为皮质类固醇，例如氢皮质酮(hydrocortisone)。所述皮质类固醇能够显著抑制牛皮癣。然而，该成分亦会产生多种副作用，例如，局部萎缩和全身性吸收。此外，中断使用时亦有复发的风险。在其它不同的治疗方法中，亦曾有人尝试以照射紫外光的方式进行治疗，但成功的机率有限。合并紫外光和煤焦油制剂(coal tar preparations)治疗比单独施用紫外光更为有效。然而，部分患者施用煤焦油制剂却会导致症状更为恶化。其它全身性疗法包括抑制细胞活性，以及维他命A和维他命C疗法；但这些治疗的效益仍存有许多疑虑。至今仍无成功治愈牛皮癣的治疗方法，目前的治疗方法仍无法有效治愈牛皮癣且可能伴随副作用产生。
多发性骨髓瘤是单株浆细胞的恶性增殖。尽管近期在发展治疗多发性骨髓瘤的新型抗癌药物上已有进展，但仍无法治愈该疾病，且其为西方国家中第二常见被诊断出的血液恶性肿瘤。因此，本领域亟需开发出具有抗多发性骨髓瘤的新颖治疗剂。
有鉴于此，本领域亟需一种改良的医药品和/或方法，以治疗和/或预干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关的疾病和/或症状。
发明内容
一般而言，本发明内容关于开发治疗干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状的新颖化合物和/或的方法。
再者，本发明内容第一方面是提供一种短合成肽，其能够治疗干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状。所述短合成肽由氨基酸序列X1ITYX2RLKX3(SEQ ID NO.1)所组成，其中，
X1、X2和X3分别是任一氨基酸残基；
X3是左旋(L-form)或右旋氨基酸(D-form)，而其它该氨基酸残基皆为左旋氨基酸，且
所述合成肽氨基酸序列的N端经乙酰化，且合成肽氨基酸序列的C端经酰胺化。
依据一较佳的实施方式，所述合成肽具有SEQ ID NO.2(以下称为9-mer)的氨基酸序列。依据其它较佳的实施方式，所述合成肽的氨基酸序列是SEQ ID NO.3、4、5或6任一种氨基酸序列。在一实施例中，所述合成肽具有SEQ ID NO.3(以下称为9-mer Da)的氨基酸序列。在其它实施例中，所述合成肽具有SEQ ID NO.7(以下称为9-mer Va)的氨基酸序列。在又一实施方式中，所述合成肽具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列(以下称为9-mer Fa)。
在又一实施例中，所述9-mer合成肽的N端上游处更包含3个额外的氨基酸残基，因而产生一SEQ ID NO.12的连续肽(以下称为“12-mer”)。
在又一实施例中，SEQ ID NO.1的X3是左旋或右旋氨基酸，其它氨基酸残基皆是左旋氨基酸。在其它实施例中，所述9-mer中的苯丙氨酸(F)是右旋氨基酸(以下称为9-merDF)。
本发明内容第二方面是关于一种用以治疗与干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关的疾病和/或症状的医药品和/或组合物。所述医药品或组合物包含一有效量的上述合成肽，以及一药学上可接受载体。
依据某些较佳的实施方式，所述合成肽具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列(9-mer)。依据其它较佳的实施方式，所述合成肽具有以下SEQ ID NO.3、7、11或12任一的氨基酸序列。在一实施例中，所述合成肽具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列(以下称为9-mer Da)。在其它实施例中，所述合成肽具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列(以下称为9-mer Va)。在又一其它实施例中，所述合成肽具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列(以下称为9-mer Fa)。
在又一实施例中，所述9-mer合成肽更包含3个额外的氨基酸残基，位于其N端上游处，因而产生一SEQ ID NO.12的连续肽(以下称为12-mer)。
本发明医药品或组合物治疗与血管增生相关的疾病和/或症状是干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤。
依据某些实施方式，本发明医药品或组合物适用于治疗眼部疾病，例如干眼症。
依据某些实施方式，本发明医药品或组合物适用于治疗皮肤炎，特别是牛皮癣。
依据某些实施方式，本发明医药品或组合物适用于***，特别是多发性骨髓瘤。
本发明内容的医药品或组合物，可经由下列方式施用至所述个体：血管传递(intravascular delivery)(例如，注射(injection)或灌注(infusion))、经口(oral)、肠内(enteral)、直肠(rectal)、肺(pulmonary(例如，吸入(inhalation))、经鼻(nasal)、局部施用(topical)(包含经皮(transdermal)、经颊(buccal)以及舌下(sublingual))、膀胱内(intravesical)、玻璃体内(intravitreal)、腹膜内(intraperitoneal)、***(vaginal)、经脑传递(brain delivery)(例如，脑室注射(intracerebroventricular)和颅内注射(intracerebral))、经CNS传递(例如，鞘内(intrathccal)、椎旁(perispinal)和椎内(intra-spinal))或肠外(parenteral)(例如，皮下(subcutaneous)、肌肉内(intramuscular)、静脉内(intravenous)和皮内(intradermal))、黏膜给药(transmucosaladministration)，或通过移植(implant)或其它习知的给药途径施用。
本发明内容第三方面是关于一种治疗患有干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状个体的方法。本发明内容第三方面是有关于一种治疗患有发炎相关症状、病征或疾病个体的方法。所述方法包含以下步骤：施用本发明内容任一实施方式所示的医药品或组合物至所述个体，以改善或减缓干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状。
在上述所有的实施方式，所述个体是人类。
在较佳的实施方式中，本发明合成肽施用至个体的量为0.01-100毫克/公斤。
在参阅下文实施方式后，本领域技术人员当可轻易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
附图说明
本发明或申请案含至少一彩图。依据请求和支付必要费用后，承办单位应提供附有彩图的专利或专利申请公开本的副本。为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
图1是依据本发明内容一实施方式所绘示9-mer肽及其经丙氨酸取代类似物对于RPMI8226细胞活性的影响；
图2是依据本发明内容另一实施方式所绘示9-mer肽及其经右旋氨基酸取代类似物对于RPMI8226细胞活性的影响；
图3依据本发明内容另一实施方式所绘示利用荧光染色测定9-mer肽对于干燥诱导的角膜表面损伤的影响，图框(A)是用以评估角膜损伤的角膜荧光染色影像；图框(B)是平均角膜荧光染色分数，其显示角膜受损的程度，其中*P<0.0002v.s.第0天；
图4依据本发明内容一实施方式所绘示利用酚红线试验测定9-mer肽对于泪液生成的影响；
图5依据本发明内容一实施方式绘示9-mer肽对于人类多发性骨髓瘤的影响，图框(A)是经台酚蓝染色的RPMI8226和U266细胞的相位差照片；图框(B)是依据图框(A)定量结果所绘示的柱形图，数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示(三次独立试验)，*P<0.005v.s.经溶剂处理的细胞；
图6依据本发明内容一实施方式绘示9-mer肽诱导RPMI8226细胞凋亡的结果，其中图框(A)是Annexin V v.s.碘化丙啶的轮廓图(三次独立分析)，图框(B)是依据图框(A)定量结果所绘示的柱形图，其中数据以凋亡细胞百分比平均值±标准差表示，*P<0.002v.s.经溶剂处理的细胞；
图7是依据本发明内容一实施方式所示9-mer肽对于IMQ诱导牛皮癣样皮肤炎和脱屑形成的影响的小鼠照片，其中图框(A)是处理6天后小鼠背部皮肤的表现型态，每一张照片皆为高功率亮视野照相机(high-powered light-field camera)所拍摄的，图框(B)，于第6天，利用微米量测器测量小鼠右耳的厚度，以耳平均厚度(mm)表示经IMQ诱导的皮肤炎，#P<0.0001v.s.为处理的正常小鼠，*P<0.0001v.s.IMQ/载体处理小鼠；
图8依据本发明内容一实施方式绘示9-mer肽对于IMQ诱导角质细胞增殖的影响；图框(A)是IMQ处理小鼠(有/无添加9-mer肽)背部皮肤切片经H&E染色后所拍摄的照片，图框(B)，9-mer肽或其类似物对于取自于IMQ处理小鼠的皮肤切片上皮厚度(μm)的影响，其中*P<0.0005v.s.IMQ对照组；以及
图9依据本发明内容一实施方式所示利用测定表皮中BrdU-阳性细胞数量评估9-mer肽及其类似物对于IMQ诱导角质细胞增殖的影响，图框(A)是IMQ处理后6天细胞增殖的组织学分析；图框(B)是表皮中BrdU-阳性细胞的定量结果，所述标志指数(％)的计算方式是每一高功率视野(200x HPF)下标志细胞的数量，数据以每组10-16HPF表示，其中*P<0.0001v.s.IMQ对照组。
具体实施方式
为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
1.定义
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。
在此处“肽”(肽)一词是指氨基酸残基所组成的聚合物。“合成肽”(synthetic肽)一词则代表此肽并未包含存在于自然界的完整蛋白质分子。此种肽之所以是“合成的”，表示其乃是由人类利用技术手段所得，譬如化学合成、重组遗传技术或将整个抗原切段。于本说明书中，任何氨基酸残基于一肽中的位置是由该肽的N端起算。当未具体指出氨基酸为右旋或左旋氨基酸，所述氨基酸可以是左旋氨基酸或者是右旋氨基酸，除非上下文明示所述氨基酸为特定异构物。本文中氨基酸的符号与本领域技术人员所使用的氨基酸缩写相同。
在此，蛋白质/肽氨基酸序列的些微变异皆为本发明权利范围所涵盖。举例来说，变异的氨基酸序列至少保留70％、71％、72％、73％、75％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％以及99％的相似度。本发明合成肽可经由修饰以改变肽特征且不影响其生理活性。举例而言，某些氨基酸经改变和/或删除后，不会影响本发明内容所述肽的生理活性(即，干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状的功效)。具体而言，氨基酸的保守性置换是可被预期的。所述保守性置换是指氨基酸侧链被同一类的氨基酸所取代。一般而言，编码的氨基酸分类如下：(1)酸性氨基酸＝天门冬氨酸(天门冬氨酸)、谷氨酸(glutamate)；(2)碱性氨基酸＝赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)、组氨酸(histidine)；(3)非极性氨基酸＝丙氨酸(alanine)、缬氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、异亮氨酸(isoleucine)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)、色氨酸(tryptophan)；以及(4)未带电极性氨基酸＝甘氨酸(glycine)、天冬酰胺(asparagine)、谷氨酰胺、半胱氨酸(cysteine)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、酪氨酸(tyrosine)。在较佳的实施例中、所述氨基酸的分类为:丝氨酸(S)和苏氨酸(T)为脂肪族羟基族(aliphatic-hydroxy family)；天冬酰胺(N)以及谷氨酰胺为含酰胺族(amide-containing family)；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)以及异亮氨酸(I)为脂肪族(aliphatic family)；以及苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)为芳香族(aromaticfamily)。举例而言，可以预期的是以异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)取代亮氨酸(L)、以谷氨酸(E)取代天冬氨酸(D)、以丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)、或以一结构相似的氨基酸取代一氨基酸，此一置换不会对氨基酸分子的结合或其特性产生重大影响，特别是所述置换并未包含氨基酸的框架区域(framework site)。可通过分析肽衍生物的专一性活性，确定氨基酸的修饰是否改变一功能性肽。所属技术领域中具有通常知识者可制备蛋白质/肽的片段或类似物。较佳的片段或衍生物的氨端或羧端出现于功能区域附近。在一实施例中，本发明合成肽中的一个氨基酸残基(例如，天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)或苯丙氨酸(F))被非极性氨基酸残基保守性置换(例如，被丙氨酸(A)置换)。在其它实施例中，本发明合成肽中的一氨基酸残基被其右旋氨基酸残基保守性置换，例如，左旋精氨酸(R)和左旋苯丙氨酸(F)分别被相对应的右旋氨基酸残基所取代。
所述“治疗(treatment)”一词是指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置，藉以达到所欲的药学和/或生理学效果；例如，延缓或抑制癌细胞生长或减轻角膜表面损伤(即，干眼症)或皮肤损伤(即，牛皮癣)。上述的效果是指能够部分或完全地治愈或预防个体出现所述疾病的症状。所述“治疗(Treatment)”包含预防、治疗或减缓一哺乳类的疾病，尤其是人类。所述治疗包含：(1)预防(如，预防用药)、治疗或减缓一个体的疾病或症状，其中所述个体可能患有疾病但尚未被诊断；(2)抑制一疾病(即，降低疾病发展)；或(3)治愈一疾病(即，减少与所述疾病相关的症状)。
所述“施用(administered)(administering)(administraion)”一词是指将本发明的制剂(即，肽或组合物)提供给个体。所述传递方式包含，但不限于，静脉内、肌肉内、腹膜内、动脉内、颅内、结膜内或皮下传递方式。在某些实施方式中，本发明合成肽和/或其类似物可配制成直接施用于皮肤的软膏或乳液。在又一实施方式中，本发明的合成肽和/或其类似物可配置成粉状，施用前与适合的载体混合(如，缓冲溶液)，例如，静脉注射。
在此处，“有效量(effective amount)”一词是指一成分的用量足以招致欲求的反应或效果，即，能有效治疗疾病。以治疗干眼症为例，一制剂(如，化合物、合成肽、编码治疗肽的核酸)，其能用以降低、预防、延缓或治愈干眼症的相关症状。相似地，以治疗牛皮癣为例，一制剂(如，化合物、合成肽、编码治疗肽的核酸)，其能用以降低、预防、延缓或治愈牛皮癣皮肤相关症状。有效量不必然能够治愈一疾病或症状，但能延缓、阻碍或预防疾病或症状的发生，或延缓疾病或症状相关的病征。所述治疗有效量可分成一、二或更多剂量于单一施用剂量型式，且可于一指定期间内施用一次、二次或更多次。
所述“个体(subject)”或“患者(patient)”一词可交互使用，且在此是指可接受本发明内容的合成肽和/或方法的动物(包含，人类)。所述“哺乳类(mammal)”一词涵盖哺乳纲的所有成员，包含：人类、灵长类动物、家畜和农畜。举例而言，所述家畜或农畜可以是兔子、猪、羊和牛。所述哺乳类亦可涵盖动物园或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类(如，小鼠和大鼠)。除非另有指明，“个体”或“患者”一般包含雄性与雌性。再者，所述“个体”或“患者”包含可从本发明内容的治疗方法得到良好治疗效果的动物。举例而言，所述“个体”或“患者”包含，但不限于，人类、大鼠、小鼠、天竹鼠、猪、猴子、猪、羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。在一实例中，所述患者为人类。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所限定的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而变化。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一端点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。
2.较佳实施方式的详细说明
本发明内容部分基于发现短合成肽能够治疗和/或预防个体干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病或症状的发展。再者，本发明提供一种用以治疗和/或预防干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状的方法和组合物，其中所述组合物包含在此新发现的合成肽。
2.1本发明合成肽
本发明内容短合成肽是由所述氨基酸序列X1ITYX2RLKX3(SEQ ID NO.1)所组成，其中，
X1、X2和X3分别是任一氨基酸残基；
R及X3分别是左旋或右旋氨基酸，而其它氨基酸残基皆为左旋氨基酸；且
所述合成肽氨基酸序列的N端经乙酰化，且合成肽氨基酸序列的C端经酰胺化。
依据一较佳实施方式，所述本发明内容合成肽具有氨基酸序列DITYVRLKF(SEQ IDNO.2；9-mer)。
依据其它实施方式，所述9-mer合成肽具有一保留性置换，得到一类似物，其具有SEQ ID NO.3、7或11中任一氨基酸序列。
依据其它较佳实施方式，所述9-mer合成肽更包含3个额外的氨基酸残基，位于其N端上游处，因而产生一SEQ ID NO.12的连续肽(以下称为12-mer)。
在又一实施例中，所述9-mer合成肽可包含至少一右旋氨基酸残基，因而产生其右旋类似物。
本发明合成肽如表1所示
表1：本发明合成肽
以上序列中粗体字表示该氨基酸是右旋氨基酸
依据较佳实施方式，SEQ ID NO.1的异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)和赖氨酸(K)残基不可被其它氨基酸残基取代，不然所述合成肽会失去其对于干眼症、牛皮癣和/或多发性骨髓瘤的生物活性。再者，SEQ ID NO.1的X1、X2、X3分别是任一氨基酸残基。在一实施方式中，X1是丙氨酸(A)、X2是缬氨酸(V)、X3是苯丙氨酸(F)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列(以下称为9-mer Da)。在其它实施方式中，X1是天门冬氨酸、X2是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列(以下称为9-merVa)。在其它的实施方式中，X1是天门冬氨酸、X2是缬氨酸(V)、X3是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列(以下称为9-mer Fa)。
依据其它实施方式，所述9-mer合成肽具有至少一右旋氨基酸残基，特别是位于第9个氨基酸残基位置上，因而产生如表1所示的9-mer右旋类似物。在一具体实施例中，所述9-mer合成肽中的苯丙氨酸(F)是右旋氨基酸，而其它氨基酸残基皆为左旋氨基酸。
本发明合成肽可通过先前技术中任一标准肽合成方法来制造。在一实施方式中，本发明合成肽是依据操作手册以固相肽合成器(ABI433A肽合成器；Applied BiosystemsInc.；Life Technologies Corp.；Foster City,CA,USA)进行合成。
另外，本发明的合成肽可利用重组技术来制备。举例而言，可利用重组技术将可编码本发明肽的核酸序列嵌入至一表达载体中，且其中所述核酸序列是以可操作方式与一调控序列连结，以在宿主细胞内表达本发明肽。接着，可将所述载体送入一合适的宿主细胞内表达本发明肽。经表达的重组肽可以通过硫酸铵沉淀法和管柱分划色层分析法(fractionation column chromatography)纯化，并依据本发明内容各实施例所示方法进行活性测试。
上述核酸或多核苷酸可利用已知的生物降解聚合物微粒或微囊传递装置传送。另外，亦可利用常规方法以脂质体包复核酸，以供宿主吸收所述核酸。所述多核苷酸可单独加载或与其它组织专一性抗体共同加载至所述传递载体中。此外，可制备一分子接合物(molecular conjugate)，其是由质体或其它载体以静电或共价力连结聚-L-赖氨酸。此外，本发明亦可利用已知的组织专一性转录调节组件(tissue-specific transcriptionalregulatory elementst)，进行组织专一性标定。也可在不使用传递载体的情形下将“裸DNA(naked DNA)”传递至肌肉内、皮内或皮下的位置，以进行胞内表达(in vivo expression)。
本发明合成肽的N端或C端可以进行修饰。举例而言，N端修饰包含，但不限于，N-醣基化、N-烷基化和N-乙酰化氨基酸。一终端修饰包含聚乙烯二醇化(pegylation)。在一实例中，C端修饰为一C端酰胺化氨基酸。在可任选的实施方式中，一或多个肽键结可以被一非肽链所取代，个别的氨基酸基团的修饰，可通过试剂处理，以与特定的侧链或终端残基反应。
所述合成肽可经由化学修饰，于多个不同的部位，加入不同的官能基。官能基可以被添加至所述合成肽的终端。在某些实施方式中，所述官能基能改善肽一或多个特性的活性，例如，改善合成肽的稳定性、效能或选择性；改善所述合成肽通过细胞膜和/或组织屏障的穿透效率；改善组织定位能力；降低毒性或清除率；以及改善抵抗细胞泵的排除，以及其它类似的活性。在非限制的实施例中，适当的官能基能用以传递肽黏附至细胞上。举例来说，降低肽的亲水性，以及增加其亲脂性，这些可任选地官能基于活体内裂解较佳，例如在胞内以水解或酶分解的方式裂解皆可。水解保护基包含酯、碳酸酯以及氨基甲酸酯保护基。胺保护基包含烷氧基以及芳氧羰基。羧酸保护基包含脂族(aliphatic)、苯基(benzylic)和芳酯(aryl esters)。在某些可任选的实施方式中，于本发明合成肽的天冬氨酸(D)的侧链的羧酸基是被保护的；较佳为，通过甲基、乙基、苯基或经取代的苯酯基。
可以保守性或非保守性置换方式，以“拟肽有机基团(peptidomimetic organicmoiety)”取代本发明合成肽中任一氨基酸残基。在可任选的较佳实例中，所述拟肽有机基团与取代的氨基酸于必要的部位具有类似的立体空间、电子或构型特性，且被视为保守性置换。可任选地以拟肽来抑制酶造成肽降解或其它降解过程。在可任选和较佳的实例中，所述肽可通过有机合成技术产生。在非限制的实施例中，合适的拟肽包含酰胺的同电子排列体(isosteres of amide bonds)、3-氨-2-丙二酮-6-羧酸(3-amino-2-propenidone-6-carboxylic acid)、羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸乙酯(hydroxyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboxylate)，以及组氨酸异喹啉羧酸(histidineisoquinolone carboxylic acid)
可非必要地对本发明合成肽的任一部分进行化学修饰，例如，添加官能基。所述修饰可于合成本发明肽的过程中进行。在非限制的实施例中，所述修饰的类型包含，但不限于，羧甲基化(carboxymethylation)、酰化(acylation)、磷酸化(phosphorylation)、糖基化(glycosylation)或脂酰化(fatty acylation)。醚键可任选地用以结合丝氨酸(S)或苏氨酸(T)羟基至一糖类的羟基。酰胺键可任选地用以结合谷氨酸或天门冬氨酸的羧基至一糖类的胺基。缩醛或酮键结可任选地形成于氨基酸与碳水化合物之间。
2.2用以治疗和/或预防干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状的组合物
本发明合成肽适用于治疗患有与干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状的个体；或者是预防个体发展与干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状。
再者，本发明内容另一方面提供包含本发明合成肽的医药品，其用以治疗干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状。
在一实施方式中，所述医药品是用以***，特别是多发性骨髓瘤，于治疗后肿瘤的体积、生长速率和/或转移降低或减少。
在其它实施方式中，所述医药品是用以治疗眼部疾病，特别是干眼症。
在又一实施方式中，所述医药品是用以治疗皮肤疾病，尤其是牛皮癣。
所述医药品的制备，可将所属技术领域中已知的药学可接受载体、赋形剂或安定剂与适量的本发明的合成肽混合制成一组合物。在特定的实施方式中，所述合成肽选自于上述任一肽，包含但不限于，9-mer、9-mer Da、9-mer Va、9-mer Fa、9-mer DF、12-mer及其组合。
所述医药品或组合物中本发明肽的含量随着使用的肽而有所不同。所述组合物中的肽含量约为0.001％至10％(重量％)；例如，约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0％。在一较佳的实施方式中，所述肽的含量约为0.001％至5％(重量％)；例如，约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0％。
所属技术领域中已知有多种药学可接受载体、赋形剂或安定剂能够适用于本发明的合成肽，包含但不限于，非毒性惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封剂或配方助剂。一般的药学可接受载体可以是水、或生理食盐水。举例而言，药学可接受载体包含，但不限于，糖类，例如，乳糖、葡萄糖或蔗糖；淀粉，例如，玉米淀粉；纤维素及其衍生物，例如，羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)、乙基纤维素(ethyl cellulose)和醋酸纤维素(cellulose acetate)；黄蓍胶粉末(powdered tragacanth)；麦芽(malt)；明胶(gelatin)；滑石(talc)；赋形剂，例如，可可脂(cocoa butter)和栓剂蜡(suppository waxes)；油类，例如，花生油(peanut oil)、棉籽油(cottonseed oil)、红花油(safflower oil)、芝麻油(sesame oil)、橄榄油(olive oil)、玉米油(corn oil)和大豆油(soybean oil)；二醇类(glycols)，例如，丙二醇(propylene glycol)；酯类(esters)，例如，油酸乙酯(ethyloleate)和月桂酸乙酯(ethyl laurate)；琼脂(agar)；缓冲剂(buffering agents)，例如，氢氧化镁(magnesium hydroxide)和氢氧化铝(aluminum hydroxide)；藻酸(alginicacid)；以及其它制剂，例如，非毒性润滑剂(non-toxic lubricants)(如，月桂基硫酸钠(lauryl sulfate)、硬脂酸镁(magnesium stearate)、着色剂(coloring agent)、释放剂(releasing agents)、调味剂(flavoring agents)、防腐剂(preservative)以及抗氧化剂(antioxidants)。所述组合物可包含抗生素或抗霉菌剂。
本发明内容的医药品或组合物的施用途径包括：经由血管传递(例如，注射或灌注)、经口、肠内、直肠、肺(例如，吸入)、经鼻、局部施用(包含经皮，经颊以及舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、***、经脑传递(例如，脑室注射和颅内注射)、经CNS传递(例如，鞘内、椎旁和椎内)或肠外(例如，皮下、肌肉内、静脉内和皮内)、黏膜给药或通过移植或其它公知的给药途径。
适用于口服的药学组合物，可以是离散剂型，包含但不限于，丸剂、片剂、锭剂、硬式或软式胶囊；或制成一分散粉末或颗粒；或制成一溶液或悬浮液，例如，溶液或悬浮液。举例而言，水溶性或油性悬浮液、乳剂、糖浆、酏剂或肠内配方。所述组合物可以制成单一剂量或多剂量剂型，例如，密封瓶或安瓿，以冻干条件并添加无菌液体载体(例如，水或食盐水)储存。
适用于肠外途径施用的药学组合物可以被制成液体或非液体无菌注射剂型，通过混合或分散本发明合成肽与一无菌溶液，例如，林格氏溶液、食盐水、1,3-丁二醇以及乙醇等。在可任选地实施例中，非挥发油、脂肪酸、合成单一或双甘油酯皆可作为溶剂。所述组合物可通过过滤器过滤使之无菌。
适用于局部和皮肤途径施用的药学组合物，可以被制成软膏(ointments)、糊剂(pastes)、乳霜(creams)、乳液(lotions)、凝胶(gels)、贴片(patches)或喷雾剂(sprays)等剂型。眼部剂型、耳滴剂和眼滴剂皆属于本发明涵盖范畴。依据某些实施方式，本发明的组合物可局部施用至眼部。随着患者疾病的严重程度和类型不同，本发明合成肽的施用至患者的剂量为约1微克/公斤体重至约100毫克/公斤体重(如，0.1-50毫克/公斤体重)例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1,000微克/公斤；或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100毫克/公斤。每日或每周的施用剂量为约1毫克/公斤至约20毫克/公斤或更高。，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50毫克/公斤。为达到上述任一局部施用的目的，每日施用一次至数次(如，每日施用4、6、8或更多次)。
药学组合物可以制成适用于肺部施用的剂型，例如，粉尘(dusts)或气雾(mists)，譬如可利用压力定量(pressurized metered dose)装置来产生气溶胶、气雾或粉尘。
本发明所提供的组合物可以是一试剂盒。可以理解的是本发明所述试剂盒作为一产品，其包含本发明合成肽和/或其它治疗性化合物，经包装而形成所述组合物，以利组合物的运送、储存和同时或连续施用。因此，本发明试剂盒可包含一或多个含本发明的合成肽的安瓿，以将本发明肽制成单一剂量或多剂量形式。所述试剂盒更包含一载体，用以溶解本发明所述合成肽；例如，水溶液介质物，即生理食盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖和氯化钠。水溶性介质，如，乙醇、聚乙二醇(polyethylene glycol)、丙基乙二醇(propylethylene glycol)。若有必要，非水溶性载体亦可适用本发明。本试剂盒的其它对象为一包装盒，用以包装本发明的各组成物。适用于本发明的包装盒的材料可以是玻璃、塑料(聚乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯极其类似物)、瓶子、小罐子、纸、束袋或其类似物。
本发明试剂盒可更包含说明书，其中记载本发明各种配方的施用方式(如，同时施用、连续施用、个别施用)。因此，本发明的试剂盒可更包含如何施用(如，同时施用、连续施用、个别施用)本发明中不同成分的说明书。所述说明书可以是纸张或为可被读取的电子媒介物，例如，电子储存媒体(磁盘、磁带或其类似物)、光学媒体(CD-ROM，DVD)及其类似物。所述媒体可额外或非必要的附加网络页面，以提供上述说明信息。
2.3治疗和/或预防与干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状的方法
如上所述，本发明所公开的内容能有效治疗和/或预防与干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状。
因此，本发明是关于一种治疗和/或预防与干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状的方法，其包含施用一包含本发明的合成肽的一医药品或组合物至一有需要的个体，其中所述合成肽是由7个连续氨基酸残基所组成，其序列为X1ITYX2RLKX3(SEQ IDNO.1)，其中，
X1、X2和X3分别是任一氨基酸残基；
X3是左旋(L-form)或右旋氨基酸(D-form)，而其它氨基酸残基皆为左旋氨基酸；以及
一药学上可接受载体。
当施用本发明医药品和/或组合物至所述个体，能够减缓或减轻与所述干眼症，牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状相关的病征。
在特定的实施方式中，所述合成肽选自于上述任一肽，包含但不限于，9-mer、9-mer Da、9-mer Va、9-mer Fa、9-mer DF、12-mer及其组合。
依据一实施方式，本发明是关于一种***的方法，特别是多发性骨髓瘤，其包含施用本发明的医药品或组合物至有需要的个体。
依据其它实施方式，本发明是关于一种治疗眼部疾病的方法，特别是干眼症，其包含施用本发明的医药品或组合物至有需要的个体。
依据其它实施方式，本发明是关于一种治疗牛皮癣的方法，其包含施用本发明的医药品或组合物至有需要的个体。
本方法包含施用本发明的医药品或组合物至有需要的个体的步骤。
在可任选的实施方式中，本发明方法更包含施用一有效量的制剂至所述个体，其中该药剂为治疗干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关疾病和/或症状的药剂，其选自于：抗发炎剂、抗癌剂和抗生素。
在某些实施例中，所述抗发炎药剂为环孢素(cyclosporine)。所述抗癌药剂可以是烷化剂(alkylating agent)、抗微管剂(anti-microtubule agent)、拓朴异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)或细胞抑制剂(cytotoxic agent)。所述抗生素选自：阿米卡星(amikacin)、健他霉素(gentamycin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、链霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin)、替考拉宁(teicoplanin)、万古霉素(vancomycin)、亚兹索霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、桃霉素(troleandomycin)、阿莫西林(amoxicillin)、安比西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、卡本西林(carbenicillin)、氯坐西林(cloxacillin)、二氯坐西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、奈夫西林(nafcillin)、盘尼西林(penicillin)、必倍西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillin)、枯草杆菌素(bacitracin)、柯利霉素(colistin)、多霉素B(polymyxin B)、塞普沙辛(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左旋氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、磺胺米隆(mafenide)、乙酰磺胺(sulfacetamide)、磺胺甲二唑(sulfamethizole)、磺胺塞拉金(sulfasalazine)、异坐磺胺(sulfisoxazole)、曲美普林(trimethoprim)、复方新诺明(cotrimoxazole)、地美环素(demeclocycline)、脱氧羟四环素(doxycycline)、米诺四环素(minocycline)、氧四环素(oxytetracycline)和四环素(tetracycline)所组成的群组中。
在本发明任一实施方式中，适用治疗的个体为人类。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些实施方式，以利本领域技术人员实施本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。
实施例
材料和方法
材料
RPMI1640培养基、胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、抗生素-抗真菌剂溶液购自Invitrogen(Carlsbad,CA)。羧甲基纤维素钠(Carboxymethylcellulosesodium,CMC)、二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和5-溴-2'-脱氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine,BrdU)皆购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(简称MTT)购自Merck(产品目录编号：1.11714.0001)。抗-BrdU抗体购自GeneTex(San Antonio,Tex,USA)。本实验例所合成的合成肽12-mer(KAFDITYVRLKF)、9-mer(DITYVRLKF)、8-mer(ITYVRLFK)、丙氨酸置换肽和右旋肽，其NH2端经乙酰化，且COOH端经酰胺化修饰，以改善其稳定性，并以质谱仪定性(纯度：>90％)。从GenScript(Piscataway,NJ)订购所有肽，且这些肽以GenScript(Piscataway,NJ,USA)合成，其中每一肽的NH2端及COOH端分别经乙酰化和胺基化修饰，以改善其稳定性，接着以质谱仪定性(纯度：>95％)。
细胞培养
以复合培养基(RPMI1640)(添加10％(vol/vol)热失活胎牛血清(Invitrogen)、50微克/毫升盘尼西林、50微克/毫升链霉素(streptomycin)和2mM左旋谷氨酰胺)培养多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226或U266，培养于37℃，5％CO2大气环境下。
MTT分析
将RPMI8226细胞或U266细胞培养于无血清RPMI1640培养基，培养24小时，接着将细胞接种于48孔培养盘(3×105细胞/孔)，以及以0.5毫升新鲜无血清RPMI1640培养基(含20μΜ肽)继续培养24小时。利用MTT分析测定细胞存活率。
添加50微升MTT储存液(5毫克MTT溶于1毫升无菌PBS)至每一培养孔中。另外，添加50微升MTT储存溶液至500微升培养基中，作为阴性对照组。将培养盘置于37℃，培养4小时。分别从每个样本中取450微升分液至新的48孔培养盘，添加100微升DMSO，利用移液管混合，于37℃下，反应20分钟，并在570nm波长下测定吸光值。
台酚蓝排除法
所述细胞利用血球计数器并利用显微镜检测，检测方式是将0.1毫升台酚蓝储存液(0.4％台酚蓝溶液溶于等渗盐缓冲液，pH 7.2)添加至1毫升细胞悬浮液中，并将其加入至细胞计数器中。计算蓝染细胞(视为无活性细胞)和总细胞数量。对于健康的对数期培养细胞，细胞活性应为至少95％。
评估细胞凋亡
利用流式细胞仪及依据制造商的使用手册进行Annexin V/碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色(Annexin V-FITC细胞凋亡侦测试剂盒；Roche)。简而言之，以冰PBS(不含Ca2+或Mg2+)清洗0.5×106细胞(Life Technologies)。将细胞再悬浮至100微升结合缓冲液(binding buffer)，再以5.0微升PI和2.0微升annexin V-异硫氰酸荧光素于室温及黑暗环境下培养15分钟。立即以FACScalibur仪器(Becton Dickinson)进行流式细胞仪分析。
干眼症动物模型
动物
本实验采用七至八周龄的C57BL/6小鼠(每只体重约18至25克)。实验过程经马偕纪念医院审查委员会同意并遵循视觉及眼科学学术研究会议(ARVO)所订定的动物实验眼科和视觉研究相关规定。
诱导干眼症
将小鼠置于人工环境室(controlled environment chamber；CEC)中14天，并依据Barabino等人(IVOS(2005)46(8),2766-2771)所用的实验步骤，诱导小鼠产生干眼症。置于CEC的小鼠暴露在一湿度相对较低的环境下，相对湿度(RH)<25％；温度为20至22℃；空气流量为15公升/分；每日12小时。对照组的小鼠置于正常的环境(RH>50％；空气流量为0；温度为20–22℃)并经过相同的期间。
治疗
利用一般人工泪液制剂(1％羧甲基纤维素钠溶于平衡盐溶液(balanced saltsolution,BSS)作为所述肽载体。局部施用肽(50μM)或1％CMC载体至眼睛，一日三次，连续施用4天。
利用眼部荧光染色侦测角膜损伤
利用局部荧光素染色测定角膜损伤(100毫克/毫升或10％；FLUORESCITETM,AlconLaboratories)。于施用上，利用微量分注器将局部荧光素(每只眼睛施用0.6微升005％钠荧光素(溶于4.4微升BSS))施用至外眦部(lateral canthus)，染色时间15秒。角膜荧光染色以裂隙灯显微镜(slit-lamp biomicroscope)，于钴蓝光(cobalt blue light)下观察，并以数字相机撷取影像。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。角膜染色以单盲方式计分，计分方式如下：无点状染色，分数为0；低于1/3角膜被染色，分数为1；2/3或低于2/3角膜被染色，分数为2；以及当高于2/3角膜被染色，分数为3。
泪液分泌量测定
泪液产量以酚红检测棉线测定(Zone-Quick；Oasis,Glendora,CA)。本小鼠试验的有效性是依据前述Dursun等人(IVOS(2002)43,632-638)所使用的步骤执行。以镍子夹取棉线将其置放于小鼠的外眦部，静置60秒。棉线经泪液沾湿后，湿润处转变成红色，再以公厘表示泪液分泌量。
牛皮癣样皮肤炎模型
本模式***采用BALB/c小鼠(8周龄母鼠；n＝42)。依据van der Fits等人(JImmunol.(2009),182,5836-5845)所用的步骤，以咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)处理小鼠皮肤而诱发产生牛皮癣样皮肤炎。再者，在此动物模型中，每日局部施用62.5毫克市售IMQ乳霜(5％w/w，AldaraTM)至每一只BALB/c小鼠(8周龄)裸背和右耳上，连续施用6天；其中对照组小鼠(正常组)则处以对照乳霜。在治疗组中，将试验肽与IMQ乳霜混合，浓度为25μM(n＝6/组)。以BrdU标记测定角质细胞增殖。利用DMSO配置BrdU(Sigma-Aldrich)储存溶液(Sigma-Aldrich)(80mM)。将10微升BrdU与90微升PBS混合，并将其以腹腔注射的方式注入至每一小鼠中，经24小时后，将小鼠安乐死。
组织学和免疫组织化学及定量
将小鼠背部皮肤以4％多聚甲醛固定，以梯度浓度乙醇脱水，再以石蜡包埋。经固定的样本以二甲苯去除石蜡，再以梯度浓度乙醇复水。将组织进行切片(厚度：5微米)。利用苏木精和伊红染色(hematoxylin and eosin,H&E)(Merck,Rayway,NJ,USA)进行一般组织学检查。
载玻片利用10％山羊血清阻断60分钟，接着以对抗BrdU的初级抗体(稀释1:50；GTX42641)于室温下培养3小时。所述载玻片接着以标志过氧化氢的驴免疫球蛋白培养30分钟，接着以呈色受质(3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine))培养2分钟，再以苏木经复染。利用Nikon Eclipse80i光学显微镜拍摄的高质量影像(1208X 960像素缓冲)。
统计
结果以平均值±标准误(mean±standard error of the mean,SEM)表示。以单因子变异数分析(1-way ANOVA)进行统计分析。P<0.05为具有显著性。
实施例1 9-mer及其类似物对于细胞活性的影响
在此实施例中，测定本发明9-mer(DITYVRLKF，SEQ ID NO.2)肽及其类似物对于骨髓瘤RPMI 8226细胞活性的影响。本发明制备了四种类型的9-mer类似物。第一类型的类似物包含9-mer Da、9-mer Ia、9-mer Ta、9-mer Ya、9-mer Va、9-mer Ra、9-mer La、9-mer Ka和9-mer Fa肽(SEQ ID NO.3至11)，此类型的类似物是9-mer上特定氨基酸被丙氨酸取代而得。举例而言，9-mer Da所代表的9-mer类似物，其中9-mer(SEQ ID NO.2)序列中的天门冬氨酸(D)残基被丙氨酸(A)取代。相似地，9-mer Ia、9-mer Ta、9-mer Ya、9-mer Va、9-merRa、9-mer La、9-mer Ka和9-mer Fa肽所代表的9-mer类似物，分别代表9-mer(SEQ IDNO.2)序列中的异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、缬氨酸(V)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)和苯丙氨酸(F)残基分别被丙氨酸所取代。所述第二类型的类似物包含9-mer DD、9-mer DI、9-mer DT、9-mer DY、9-mer DV、9-mer DR、9-mer DL、9-mer DK和9-mer DF，这些类似物是9-mer上特定氨基酸残基被相对应的右旋氨基酸取代。举例而言，9-merDD代表的9-mer类似物是指9-mer(SEQ ID NO.2)序列中的天门冬氨酸(D)残基被右旋天门冬氨酸取代。相似地，9-mer DI、9-mer DT、9-mer DY、9-mer DV、9-mer DR、9-mer DL、9-mer DK和9-mer DF代表的9-mer类似物，其中9-mer(SEQ ID NO.2)序列中的异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、缬氨酸(V)、精氨酸(R)，亮氨酸(L)、赖氨酸(K)和苯丙氨酸(F)残基分别被相对应的右旋氨基酸残基所取代。第三类型的9-mer类似物是所述12-mer肽，其于9-mer的N-端上额外增加3个氨基酸残基，因而产生所述12-mer肽(KAFDITYVRLKF，SEQ ID NO.12)。第四类型的9-mer类似物为8-mer肽，删除9-mer上的天门冬氨酸(D)残基，因而产生8-mer肽(ITYVRLKF，SEQ ID NO.13)。
利用MTT分析法测定9-mer及其类似物对于细胞活性，结果示于图1至图2。
如图1所示数据显示，12-mer和9-mer皆能够有效抑制骨髓瘤RPMI8226细胞活性；然而，于9-mer上第2、3、4、6、7和8的残基位置进行丙氨酸置换(即，9-mer Ia、9-mer Ta、9-mer Ya、9-mer Ra、9-mer La和9-mer Ka肽)会使得9-mer丧失抑制活性，由此可知上述这些特定氨基酸残基位置对于9-mer生物活性具有重要性。值得注意的是于9-mer第1、5和9氨基酸残基位置进行丙氨酸置换(即，9-mer Da、9-mer Va和9-mer Fa肽)能保留9-mer的部分生物活性，由此可见，前述三个特定氨基酸残基位置对于9-mer维持活性而言，非为必要。
另一方面，经右旋氨基酸置换所得到的9-mer类似物中，意外发现9-mer上第1-8的氨基酸残基位置经置换会导致9-mer丧失其生物活性。值得注意的是，相较于9-mer，所述9-mer DF肽(即，9-mer第9氨基酸残基位置被右旋氨基酸取代)仍保留类似的生物活性，代表此一右旋氨基酸置换可保留肽活性(图2)。
综合以上结果，显示所述9-mer和12-mer皆能够有效抑制骨髓瘤细胞活性，且12-mer在低剂量中更为有效。再者，9-mer上的第1、5和9个氨基酸残基位置可以被其它氨基酸残基取代；且9-mer上第9个氨基酸残基位置可以是左旋氨基酸或右旋氨基酸，其它残基则必须为左旋氨基酸，以维持9-mer的生物活性。
实施例2 9-mer对于干燥诱导干眼症的功效
本实施例依据“材料与方法”所述的步骤建立鼠干眼症模型，以评估9-mer及其类似物的治疗功效。
简而言之，将小鼠置入干燥环境中14天，诱导干眼症产生，以荧光染色确认干眼症典型病征(即，角膜溃疡症状)，接着于指定时间和剂量进行治疗。结果示于图3。
经眼滴剂(对照组)或含9-mer肽眼滴剂处理的眼球照片，如图3A所示。接受9-mer治疗4天的小鼠，所述角膜荧光染色显著减少，可以得知9-mer具有治疗干眼症的功效。相似的结果可见于以12-mer、9-mer、9-mer DF、或9-mer丙氨酸类似物(9-mer Da、9-mer Va或9-mer Fa)治疗干眼症4天的小鼠；结果显示相较于经载体处理的对照组小鼠，经前述这些合成肽处理的小鼠平均角膜荧光素染色分数下降三倍(图3，图框(B))。再者，所述8-mer对照肽无相同的功效。此外，以12-mer、9-mer、9-mer DF和9-mer丙氨酸类似物(9-mer Da、9-merVa和9-mer Fa)处理4天(P<0.01v.s.载体处理)能够使得眼睛内泪液量显著增加(图4)。
实施例3 9-mer对于人类多发性骨髓瘤细胞的治疗功效
在此实施例中，测定9-mer对于骨随瘤细胞造成的细胞毒性影响，所述骨随瘤细胞包含RPMI8226细胞和U266细胞。结果示于图5和图6。
利用台酚蓝分析测定9-mer对于人类多发性骨髓瘤细胞生长的细胞毒性影响；所述结果显示，相较于经9-mer溶剂(DMSO)处理，9-mer能够显著降低RPMI8226细胞(7.5±1.3vs 59.7±4.5)和U266细胞(8.7±1.1vs47.0±4.6)的细胞活性(图5)。通过annexin-V染色的测定结果得知，9-mer凭借诱导癌细胞凋亡来达到抑制的功效。相较于对照组未处理的细胞，对照组中表现凋亡的细胞低于15％，而经9-mer处理24小时，暴露于磷脂酰丝氨酸外的骨随瘤细胞凋亡约54％(图6)。
实施例4 9-mer对于IMQ-诱导牛皮癣样皮肤炎的治疗效果
本实施例依照“材料与方法”一节所示的步骤建立鼠牛皮癣样皮肤炎动物模型，以评估9-mer及其类似物的治疗效果。
简而言之，每日局部施用IMQ乳霜以及有/无合并施用9-mer和/或9-mer类似物(如，12-mer、9-mer DF、9-mer Da、9-mer Va或9-mer Fa)至BALB/c小鼠的裸背和右耳上，连续施用6天。在这段期间，仅施用IMQ的小鼠，产生牛皮癣样皮肤炎和脱屑；而局部施用IMQ和9-mer(25μM)的小鼠，其皮肤炎和脱屑的症状显著的减少(图7)。
以显微镜检查发现经IMQ处理的小鼠其皮肤切片表现出牛皮癣病灶的特征变化，例如棘皮症(表皮增厚)、脱屑和皮肤浸润(H&E染色；图8，图框(A))。相反地，相较于经IMQ处理的皮肤切片，接受9-mer处理的小鼠皮肤切片的结果显示，棘皮症和脱屑的症状减少。相似地结果可见于接受12-mer、9-mer、9-mer DF处理的牛皮癣样皮肤炎小鼠，与IMQ对照组相比，利用12-mer、9-mer、9-mer DF处理使得棘皮症显著减少(35.3±4.1、39.2±2.7和35.7±4.2vs 122±10.5；图8，图框(B))。
利用BrdU嵌入分析监控这些皮肤切片中角质细胞的增殖。经IMQ处理的小鼠中，如图9，图框(A)，BrdU嵌入至角质细胞的DNA中(呈棕色)，所述细胞位于表皮各层，显示角质大量增殖。相反地，经IMQ+9-mer处理的小鼠中，其BrdU阳性细胞仅限于表皮的基底层。类似的结果可以发现在经12-mer、9-mer或9-mer DF处理的小鼠中，结果显示相较于IMQ或9-merDD处理的小鼠，经12-mer、9-mer或9-mer DF处理的小鼠其角质细胞增殖量显著减少(24.5±2.0和23.3±2.5vs 8.5±1.4、8.3±1.4和6.3±1.2；图9，图框(B))。
综合以上实施例的结果可以证实本发明的短合成肽能用以治疗和/或预防与干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤相关的疾病或症状。
虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求书所界定者为准。
sequence list
<110> 马偕纪念医院
<120> 短合成肽及其用途
<130> 18FAP0111CP
<150> US62/267,269
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<160> 13
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer-1
<220>
<221> VARIANT
<222> (1,5,9)
<223> Xaa是任一氨基酸残基
<400> 1
Xaa Ile Thr Tyr Xaa Arg Leu Lys Xaa
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer
<400> 2
Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer Da
<400> 3
Ala Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer Ia
<400> 4
Asp Ala Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer Ta
<400> 5
Asp Ile Ala Tyr Val Arg Leu Lys Phe
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer Ya
<400> 6
Asp Ile Thr Ala Val Arg Leu Lys Phe
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer Va
<400> 7
Asp Ile Thr Tyr Ala Arg Leu Lys Phe
1 5
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<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer Ra
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1 5
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer La
<400> 9
Asp Ile Thr Tyr Val Arg Ala Lys Phe
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer Ka
<400> 10
Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Ala Phe
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 9-mer Fa
<400> 11
Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Ala
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 12-mer
<400> 12
Lys Ala Phe Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe
1 5 10
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成; 8-mer
<400> 13
Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Ala
1 5

Claims (30)

1.一种合成肽其由氨基酸序列X1ITYX2RLKX3(SEQ ID NO.1)所组成，其中，
X1、X2和X3分别是任一种氨基酸残基；
R及X3分别是左旋(L-form)或右旋氨基酸(D-form)，而其它氨基酸残基皆为左旋氨基酸，且
所述合成肽氨基酸序列的N端经乙酰化，且合成肽氨基酸序列的C端经酰胺化。
2.如权利要求1所述的合成肽，其中所述合成肽具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的合成肽，更包含3个额外的氨基酸残基在其N端，因而产生SEQ IDNO.12所示的肽。
4.如权利要求1所述的合成肽，其中X1是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的合成肽，其中X2是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的合成肽，其中X3是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列。
7.一种药学组合物，包含一有效量的如权利要求1所述的合成肽，以及一药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的药学组合物，其中所述合成肽的氨基酸序列是SEQ ID NO.2、3、7、11或12。
9.如权利要求7所述的药学组合物，其中所述药学上可接受的载体是液体、凝胶、乳霜或软膏。
10.一种治疗患有干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤的个体的方法，包含对所述个体投予一有效量的一种合成肽，其由氨基酸序列X1ITYX2RLKX3(SEQ ID NO.1)所组成，其中，
X1、X2和X3分别是任一种氨基酸残基；
R及X3分别是左旋(L-form)或右旋氨基酸(D-form)，而其它氨基酸残基皆为左旋氨基酸，且
所述合成肽氨基酸序列的N端经乙酰化，且合成肽氨基酸序列的C端经酰胺化。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述合成肽具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的方法，更包含3个额外的氨基酸残基在其N端，因而产生SEQ IDNO.12所示的肽。
13.如权利要求10所述的方法，其中X1是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列。
14.如权利要求10所述的方法，其中X2是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列。
15.如权利要求10所述的方法，其中X3是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述合成肽的投予量是0.01-100毫克/公斤。
17.如权利要求10所述的方法，其中所述个体是人类。
18.一种合成肽的用途，其可用来制造一种用以治疗干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤的药物，其中所述合成肽由氨基酸序列X1ITYX2RLKX3(SEQ ID NO.1)所组成，其中，
X1、X2和X3分别是任一种氨基酸残基；
R及X3分别是左旋(L-form)或右旋氨基酸(D-form)，而其它氨基酸残基皆为左旋氨基酸，且
所述合成肽的氨基酸序列的N端经乙酰化，且C端经酰胺化。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述合成肽具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述合成肽更包含3个额外的氨基酸残基在其N端，因而产生SEQ ID NO.12所示的肽。
21.如权利要求18所述的用途，其中X1是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列。
22.如权利要求18所述的用途，其中X2是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列。
23.如权利要求18所述的用途，其中X3是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列。
24.合成肽用来作为一种药物，以治疗干眼症、牛皮癣或多发性骨髓瘤，其中所述合成肽由氨基酸序列X1ITYX2RLKX3(SEQ ID NO.1)所组成，其中，
X1、X2和X3分别是任一种氨基酸残基；
R及X3分别是左旋(L-form)或右旋氨基酸(D-form)，而其它氨基酸残基皆为左旋氨基酸，且
所述合成肽的氨基酸序列的N端经乙酰化，且C端经酰胺化。
25.如权利要求24所述的合成肽，其中所述合成肽具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
26.如权利要求25所述的合成肽，其中所述合成肽更包含3个额外的氨基酸残基在其N端，因而产生SEQ ID NO.12所示的肽。
27.如权利要求24所述的合成肽，其中X1是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列。
28.如权利要求24所述的合成肽，其中X2是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列。
29.如权利要求24所述的合成肽，其中X3是丙氨酸(A)，且所述合成肽具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列。
30.如权利要求24所述的合成肽，其中所述合成肽是以0.01-100毫克/公斤的剂量使用。
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