CN108289915A - 包含脂肪组织来源基质细胞的肝病治疗剂及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供保持脂肪组织来源基质细胞对于肝病的优异的治疗效果且制备治疗剂的便利性也优异的、肝病治疗剂的制造方法、利用这样的制造方法而得到的肝病治疗剂，所述肝病治疗剂包含脂肪组织来源基质细胞。本发明为一种肝病治疗剂，其包括至少进行了2次冷冻保存和融解的脂肪组织来源基质细胞。

Description

包含脂肪组织来源基质细胞的肝病治疗剂及其制造方法
技术领域
本发明涉及包含脂肪组织来源基质细胞的肝病治疗剂及其制造方法。
背景技术
间充质干细胞是被指出存在于骨髄的成体干细胞，由于作为干细胞具有分化为骨、软骨和脂肪的能力，因而作为在细胞治疗中有期望的细胞来源而受到注目。最近，已知具有同等功能的细胞存在于脂肪组织和胎盘、脐带、卵膜等的胎儿附属物的基质细胞中。因此，有时也将间充质干细胞称为基质细胞。
间充质干细胞除了分化能以外具有各种各样的功能的情况也受到注目，使用骨髄来源间充质干细胞，针对造血干细胞移植中的急性移植物抗宿主疾病(Graft-versus-hostdisease：GVHD)、炎性肠病的克罗恩病(Crohn病)、急性心肌梗塞和缺血性心力衰竭进行了试验。
与骨髄相比，脂肪组织可以一次性得到较多的基质细胞，从供体采集时的侵袭程度也低于骨髄，因而脂肪组织来源的基质细胞作为细胞移植用的治疗剂受到注目(专利文献1和2)。然而，骨髄来源的间充质干细胞和脂肪组织来源的基质细胞不一定显示出相同的性质，也报告了如增殖速度、分化倾向的不同等的差异(非专利文献1)。
一直以来，启示了将脂肪组织来源基质细胞用于肝病治疗特别是用于肝硬化的治疗(非专利文献1至4)，但尚未公开治疗效果、用于提高治疗时的便利性的脂肪组织来源基质细胞的制备方法、保存方法。
虽然在日本计划了对使用了脂肪组织来源基质细胞的肝硬化的治疗效果进行研究的试验，但它们全部是同族(同种同体)的细胞移植。然而，为了进行通用的细胞移植治疗，期望以后在非同族(同种异体)中进行，对于非同族移植用的脂肪组织来源基质细胞的制备方法、保存方法，尤其是考虑了对于肝病的治疗效果、治疗时的便利性提高的研究尚未充分进行。
另外，由于有报告称：与未进行冷冻保存的细胞相比，进行了冷冻保存的细胞的细胞治疗效果减弱或副作用增大等(非专利文献5至7)，因而认为在将细胞用于治疗时优选不进行冷冻保存。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第6,777,231号说明书
专利文献2：日本特开2013-13411号公报
非专利文献
非专利文献1：Yu F.,et.al.,Journal of the Formosan Medical Association，114，130-138，2015
非专利文献2：Banas A.,et.al.,Stem Cells.26：2705-2712，2008
非专利文献3：Harn H.,et.al.,Cell Transplant.,21：2753-2764，2012
非专利文献4：Salomone F.,et.al.,Stem Cell Res.,11：1037-1044，2013
非专利文献5：Francois M.,et.al.,Cytotherapy，14：147-152，2012
非专利文献6：Moll G.,et.al.,Stem Cells，32(9)：2430-2442，2014
非专利文献7：Quimby J.M.,et.al.,Stem Cell Res.Ther.,4(2)：48-59，2013
发明内容
发明要解决的问题
使用进行了冷冻保存的细胞的情况下，难以预测在融解后细胞是否具有与冷冻前同等的功能(非专利文献5至7)。特别是，将脂肪组织来源基质细胞用于肝病治疗的情况下，该细胞通过何种功能而对肝病治疗产生效果，其机理是不清楚的，因此推测冷冻融解后的细胞对肝病治疗的有效性是特别困难的。在此基础上，给予重复进行了冷冻融解的脂肪组织来源基质细胞的情况下，不能推定产生了对肝病的治疗效果。
而且，在需要将脂肪组织来源基质细胞培养至即将给药前的情况下，医疗机关需要准备特殊的培养设备，因此有通用性降低的担心。因此，为了提高便利性，期望开发出对保存的移植用的脂肪组织来源基质细胞直接进行配制的方法。细胞的保存需要在低温下进行冷冻，但出于维持细胞的核型、增殖能力或分化能力等细胞功能、提高细胞存活率而开发了这样的冷冻时所使用的保存液，但没有想到与保存液一起将细胞给予至体内的情况进行开发。另外，进行冷冻保存液的评价时，由于在经过培养工序而使细胞活化后进行评价，因此融解后、未进行培养的细胞为何种状况是不清楚的而且也没有着眼于这种情况的例子。更何况，对融解后的细胞直接进行配制、给予的情况对于肝病治疗是否有效是不清楚的。
本发明是鉴于上述问题点而完成的，其课题在于提供保持脂肪组织来源基质细胞对于肝病的优异的治疗效果且治疗剂制备的便利性也优异的、肝病治疗剂的制造方法、利用这样的制造方法而得到的肝病治疗剂，所述肝病治疗剂包含脂肪组织来源基质细胞。
用于解决问题的方案
即，本发明涉及下述方案：
[1]一种肝病治疗剂，其包含至少进行2次冷冻保存和融解的脂肪组织来源基质细胞。
[2]根据[1]所述的肝病治疗剂，其为肝炎治疗用。
[3]根据[1]所述的肝病治疗剂，其为肝硬化治疗用。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的肝病治疗剂，其为抑制肝脏纤维化用。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的肝病治疗剂，其中，前述脂肪组织来源基质细胞相对于被检体为同种异体。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的肝病治疗剂，其中，前述脂肪组织来源基质细胞为人脂肪组织来源基质细胞。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的肝病治疗剂，其中，前述至少进行2次冷冻保存和融解包括以下的工序：
(1)对脂肪组织来源基质细胞进行冷冻保存和融解的工序；
(2)培养该融解的细胞的工序；及
(3)对该培养的细胞进行冷冻保存和融解的工序。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的肝病治疗剂，其中，前述脂肪组织来源基质细胞为4次传代以下的脂肪组织来源基质细胞。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的肝病治疗剂，其中，前述冷冻保存在液氮上的气相中进行。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的肝病治疗剂，其中，前述冷冻保存使用包含DMSO(二甲基亚砜)的溶液来进行。
[11]一种包含脂肪组织来源基质细胞的肝病治疗剂的制造方法，其具有如下工序：
(i)培养从采集的脂肪组织中分离的基质细胞的工序；
(ii)对工序(i)中得到的脂肪组织来源基质细胞进行冷冻保存和融解的工序；
(iii)对融解的脂肪组织来源基质细胞进行冷冻保存和融解的工序；及
(iv)将工序(iii)中融解的脂肪组织来源基质细胞与输液制剂进行混合的工序。
[12]根据[11]所述的制造方法，其中，前述冷冻保存使用冷冻保存液进行，工序(iv)是对包含融解的脂肪组织来源基质细胞的冷冻保存液和输液制剂进行混合的工序。
[13]根据[11]或[12]所述的制造方法，其中，前述脂肪组织来源基质细胞为人脂肪组织来源基质细胞。
[14]根据[11]～[13]中任一项所述的制造方法，其中，前述工序(i)的培养至少进行1次传代。
[15]根据[11]～[14]中任一项所述的制造方法，其中，前述工序(ii)中，还包括培养融解的脂肪组织来源基质细胞的工序。
[16]根据[11]～[15]中任一项所述的制造方法，其中，前述冷冻保存在液氮上的气相中进行。
[17]根据[12]～[16]中任一项所述的制造方法，其中，前述冷冻保存液是包含DMSO的溶液。
发明的效果
根据本发明，能够使用经冷冻保存和融解的脂肪组织来源基质细胞来治疗肝病。因此，本发明提供包含经冷冻保存和融解的脂肪组织来源基质细胞的肝病治疗剂。而且，本发明提供包含经冷冻保存的脂肪组织来源基质细胞的肝病治疗剂的制造方法。
附图说明
图1表示向给予0.5mL/kg的四氯化碳(CCl4)而制作的肝硬化模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞后的血清中的天冬氨酸转氨酶(AST：Aspartate transaminase)(左图)和丙氨酸转氨酶(ALT：Alanine transaminase)(右图)的测定结果。图中，CCl4表示仅给予了乳酸林格溶液的对照组；CCl4+MSC表示给予了人脂肪组织来源基质细胞的治疗组。
图2表示向给予0.0625mL/kg的CCl4而制作的急性肝炎模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞后的血清中的AST(左图)和ALT(右图)的测定结果。图中，G1是仅给予了PBS的对照组的结果，G2是给予了培养后的人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果，G3是给予了刚冷冻融解的人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果。
图3表示对于向给予0.0625mL/kg的CCl4而制作的急性肝炎模型小鼠，在CCl4给予前和给予后给予了人脂肪组织来源基质细胞后的血清中的AST(左图)和ALT(右图)的测定结果。图中，G1是仅给予了PBS的对照组的结果，G2是在CCl4给予前给予了人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果，G3是在CCl4给予后给予了人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果。
图4表示向给予20mL/kg的伴刀豆球蛋白A型IV而制作的暴发型肝炎模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞后的血清中的AST(左图)和ALT(右图)的测定结果。图中，G1是仅给予了PBS的对照组的结果，G2是给予了人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果。
图5表示向给予20mL/kg的伴刀豆球蛋白A型IV而制作的暴发型肝炎模型小鼠给予了各用量的人脂肪组织来源基质细胞后的血清中的AST(左图)和ALT(右图)的测定结果。图中，G1是仅给予了乳酸林格溶液的对照组的结果，G2是给予了中用量(1.5×107个细胞/kg)的人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果，G3是给予了高用量(5×107个细胞/kg)的人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果。
图6表示向健康小鼠给予了STEM-CELLBANKER的、或者向给予0.0625mL/kg的CCl4而制作的急性肝炎模型小鼠给予了STEM-CELLBANKER或给予了溶解于STEM-CELLBANKER中的人脂肪组织来源基质细胞后的血清中的AST(左图)和ALT(右图)的测定结果。图中，G1是向健康小鼠仅给予了STEM-CELLBANKER的对照组的结果，G2是向肝硬化模型小鼠给予了STEM-CELLBANKER的对照组的结果，G3是向肝硬化模型小鼠给予了悬浮于STEM-CELLBANKER的人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果。
图7的A表示：对向给予1mL/kg的各浓度的CCl4而制作的肝硬化模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞后的摘除肝脏进行Masson三色染色，对纤维化进行评分化的结果。图7的B表示：对向给予1mL/kg的各浓度的CCl4而制作的肝硬化模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞后的摘除肝脏中的羟脯氨酸的量进行测定的结果。图中，Normal(正常)是健康小鼠的结果，10％是给予了以10v/v％调节的CCl4的肝硬化模型小鼠的结果，10％+MSC是向给予了以10v/v％调节的CCl4的肝硬化模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果，25％是给予了以25v/v％调节的CCl4的肝硬化模型小鼠的结果，25％+MSC是向给予了以25v/v％调节的CCl4的肝硬化模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果。
图8表示对向多次给予CCl4而制作的肝硬化模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞后的摘除肝脏中的羟脯氨酸的量进行测定的结果。图中，Normal(正常)是健康小鼠的结果，CCl4表示未向肝硬化模型小鼠给予人脂肪组织来源基质细胞的对照组的结果，CCl4+MSC是向肝硬化模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果。
图9表示对向由摄取胆碱缺乏氨基酸调节饲料而导致的非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞后的摘除肝脏中的羟脯氨酸的量进行测定的结果。图中，Normal(正常)是健康小鼠的结果，NASH是未向非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠给予人脂肪组织来源基质细胞的对照组的结果，NASH+MSC是向非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠给予了人脂肪组织来源基质细胞的治疗组的结果。
图10表示向对多次给予CCl4而制作的肝硬化模型小鼠单次给予或多次给予人脂肪组织来源基质细胞后的摘除肝脏中的羟脯氨酸的量进行测定的结果。图中，Normal(正常)是健康小鼠的结果，Vehicle control(空白对照)是未向肝硬化模型小鼠给予人脂肪组织来源基质细胞的对照组的结果，hADSC(TRB02)单次给予是向肝硬化模型小鼠单次给予了脂肪组织来源基质细胞(TRB02)的治疗组的结果，hADSC(TRB03)单次给予是向肝硬化模型小鼠单次给予了人脂肪组织来源基质细胞(TRB03)的治疗组的结果，hADSC(TRB03)隔周共计给予4次是向肝硬化模型小鼠多次给予了人脂肪组织来源基质细胞(TRB03)的治疗组的结果。
图11表示利用定量PCR对共培养THP1细胞来源的巨噬细胞和人脂肪组织来源基质细胞时的巨噬细胞中的各炎症标记物(IL6、CCL2、IL1β和TNF)进行测定的结果。图中白色条是无LPS刺激的结果，黑色条是有LPS刺激的结果。“-”表示仅培养THP1细胞来源的巨噬细胞，“+”表示THP1细胞来源的巨噬细胞和人脂肪组织来源基质细胞的共培养。
具体实施方式
本发明中“脂肪组织”是指含有脂肪细胞和包含微血管细胞的基质细胞的组织，例如是通过外科的切除或吸引哺乳动物的皮下脂肪而得到的组织。优选为人的皮下脂肪。皮下脂肪的供给个体可存活着或可死亡，本发明中使用的脂肪组织优选为从存活个体采集的组织。从个体采集的情况，吸脂例如可示例出PAL(辅助)吸脂、Elconi激光吸脂或Body-jet吸脂等，从维持细胞的状态这样的观点出发，优选不使用超声波等。
本发明中的“基质细胞”是指具有分化为属于间充质的细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等)的分化能力且维持该能力的同时能增殖的细胞。本发明中，基质细胞是指与间充质干细胞相同的细胞，而没有特别区分。脂肪组织来源基质细胞是指脂肪组织中所含有的基质细胞，还可以称为脂肪来源间充质干细胞。
本发明中，脂肪组织来源基质细胞是指包含脂肪组织来源基质细胞的任意的细胞群。该细胞群的至少20％以上、优选为30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为脂肪组织来源基质细胞。
该脂肪组织来源基质细胞例如还可以利用美国专利第6,777,231号中记载的制造方法得到，例如可以利用包括以下工序(a)～(c)的方法制造：
(a)通过酶使脂肪组织消化而得到细胞悬浮物的工序；
(b)使细胞沉淀，将细胞再悬浮于适当的培养基中的工序；及
(c)在固体表面培养细胞，去除对固体表面不显示出结合的细胞的工序。
工序(a)中使用的脂肪组织优选使用经清洗的脂肪组织。清洗可以通过使用适合生理学的生理盐水溶液(例如磷酸缓冲盐水(PBS))并剧烈地搅拌使其沉淀来进行。其用于从组织中去除脂肪组织中所含的夹杂物(也称为残渣，例如损伤组织、血液、红血球等)。因此，直至从上清液中总体去除残渣为止重复进行清洗和沉淀。残留的细胞以各种各样的大小的块的形式存在，因此边使细胞本身的损伤抑制在最小限度边使其解离，因而优选用使细胞间结合减弱或破坏的酶(例如胶原酶、分散酶、胰蛋白酶等)对清洗后的细胞块进行处理。这种酶的量和处理期间依赖于所使用的条件而改变，但其是本技术领域已知的。代替这样的酶处理或进行组合使用并利用机械搅拌、超声波能量、热能量等的其它处理法使细胞块分解，但为了使细胞的损伤抑制在最小限度，因此优选仅通过酶处理进行。使用酶时，使对细胞的有害作用抑制在最小限度，而期望在经过适当的期间后使用培养基等使酶失活。
利用工序(a)而得到的细胞悬浮物包含聚集状的细胞的浆料或悬浮物、以及各种夹杂细胞、例如红血球、平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。因此，虽然接着还可以分离、去除聚集状态的细胞及它们的夹杂细胞，但由于可以通过在后述工序(c)中的粘接和清洗而去除，因此还可以省略该分离、去除。分离、去除夹杂细胞的情况，可以通过使细胞强制分为上清液与沉淀的离心分离来实现。使得到的包含夹杂细胞的沉淀悬浮于生理学合适的溶剂中。悬浮状的细胞有包含红血球的担心，但利用通过向后述个体表面的粘接的选择而可排除红血球，因此未必需要进行溶解的工序。作为选择性地溶解红血球的方法，例如可以使用在通过氯化铵进行的溶解的高渗培养基或低渗培养基中的孵育等本技术领域中公知的方法。溶解后，例如通过过滤、离心沉淀或密度分级而可从期望的细胞中分离溶解物。
工序(b)中，对于悬浮状的细胞，为了提高基质细胞的纯度，还可以进行1次或者连续多次清洗、离心分离，再悬浮于培养基中。另外，还可以以细胞表面标记物轮廓为基础或以细胞的大小和颗粒性为基础来分离细胞。
再悬浮时使用的培养基只要是能够培养基质细胞的培养基就没有特别限定，这样的培养基可以通过向基础培养基中添加血清和/或添加例如白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、***钠、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等1个以上的血清替代物来制作。根据需要这些培养基还可以进一步添加脂质、氨基酸、维生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。这样的培养基例如从PromoCell公司、Lonza公司、Biological Industries公司、Veritas公司、R&D Systems公司、Corning公司和Rohto公司等作为间充质干细胞(基质细胞)用以预先制备的培养基的形式来提供。基础培养基例如可列举出：IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle’s Minimum EssentialMedium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco’s modified Eagle’s Medium(DMEM)培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、它们的混合培养基等。血清例如有人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清、仔牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔子血清、大鼠血清等，但不限定于这些。使用血清时，可以对基础培养基添加5v/v％至15v/v％、优选添加10v/v％。增殖因子例如可示例出血小板衍生生长因子(PDGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，但不限定于这些。氨基酸例如包含L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等，但不限定于这些。从将本发明中得到的脂肪来源基质细胞用于细胞移植这样的观点出发，优选使用不包含异种来源成分(异源：xeno-free)的培养基。
接着，作为工序(c)，在不使工序(b)中得到的细胞悬浮液分化的情况下，在固体表面上、使用上述适当的细胞培养基并以适当的细胞密度和培养条件进行培养。本发明中，“固体表面”是指本发明的脂肪组织来源基质细胞能够结合的任意材料。在特定的方式中，这样的材料是经处理的塑料材料以促进哺乳类细胞结合于该表面。具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，可适宜使用培养皿、烧瓶等。为了去除非结合状态的细胞和细胞的碎片而在孵育后对细胞进行清洗。
本发明中，作为脂肪组织来源基质细胞的细胞群可以选择最终以结合于固体表面的状态滞留的细胞。
虽然没有特别限定，但对于所选择的细胞而言，为了确认是本发明的脂肪组织来源基质细胞的情况，还可以使用流式细胞仪等并利用现有的方法对表面抗原进行解析。而且，还可以检查分化为各细胞系列的能力，这样的分化可以利用现有的方法进行。
本发明的脂肪组织来源基质细胞可以如上所述来制造，但还可以作为具有由以下组组成的特性的细胞进行定义；
(a)在标准培养基中的培养条件下对塑料显示出粘接性；
(b)表面抗原CD105，CD73，CD90为阳性，CD45，CD34，CD11b，CD19，HLA-DR为阴性；以及
(c)在培养条件下能分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。
本发明的脂肪组织来源基质细胞用作肝病治疗剂，因此还可以适宜重复进行冷冻保存和融解，优选为至少进行2次冷冻保存和融解，例如为2次以上、3次以上、4次以上、5次以上，可列举出10次以下、9次以下、8次以下、7次以下、6次以下的冷冻保存和融解的次数。进一步优选为进行2次冷冻保存和融解。在制备包含脂肪组织来源基质细胞的肝病治疗剂的过程中，多次导入这样的冷冻保存和融解的工序，从而可通过评价试验确认不适应，在废弃该细胞时，避免在融解后进行的多余的工序的实施，因而能够抑制制造成本。此外，在制备肝病治疗剂的过程中，能够中断作业，可以人为地控制制造工序。而且，即使像这样进行2次以上的冷冻保存和融解，本发明的肝病治疗剂也保持了优异的治疗效果。至少进行2次这样的冷冻保存和融解的情况，例如可以使用包括如下工序的方法，(1)对脂肪组织来源基质细胞进行冷冻保存和融解的工序；(2)培养该融解的细胞的工序；及(3)对该培养的细胞进行冷冻保存和融解的工序。从供体获得采集的脂肪组织时，可列举出包括如下工序的方法，(i)培养从采集的脂肪组织中分离的基质细胞的工序；(ii)对工序(i)中得到的脂肪组织来源基质细胞进行冷冻保存和融解的工序；(iii)对经融解的脂肪组织来源基质细胞进行冷冻保存和融解的工序；及(iv)将工序(iii)中融解的脂肪组织来源基质细胞与输液制剂进行混合的工序，优选为进一步包括在前述工序(ii)后培养经融解的脂肪组织来源基质细胞的工序的方法。根据需要，可以重复进行工序(iii)。重复进行工序(iii)的情况，还可以进一步包括在冷冻保存前培养脂肪组织来源基质细胞的工序。
本发明中，冷冻保存可以通过使脂肪组织来源基质细胞悬浮于本领域技术人员所公知的冷冻保存液中并冷却来进行。该悬浮可以通过利用胰蛋白酶等的剥离剂使细胞剥离，移至冷冻保存容器中进行适宜处理后，加入冷冻保存液进行。冷冻保存液例如还可以使用由Bioverde公司、Nippon GeneticsCo.,Ltd.、ReproCell公司、ZENOAQ公司、Cosmo BioCo.,Ltd.、Kohjin Bio Co.,Ltd.、Thermo Fisher Scientific K.K.等提供的冷冻保存液。
冷冻保存液还可以含有DMSO(二甲基亚砜)，DMSO除了具有细胞毒性之外还具有分化诱导基质细胞的特性，因此优选减少DMSO的含量。作为DMSO的替代物，可示例出甘油或多糖类。使用DMSO时，通过含有5％～20％的浓度、优选为5％～10％的浓度、更优选为10％的浓度，从而能够抑制冷冻时的细胞损伤。
对上述悬浮的细胞进行冷冻保存时，可以在-80℃～-100℃之间的温度(例如，-80℃)下进行保管，可以使用能实现该温度的任意的冷冻仪进行。虽然没有特别限定，但为了避免剧烈的温度变化，还可以使用程序冷冻仪对冷却速度进行适宜控制。冷却速度可以根据冷冻保存液的成分进行适宜选择，还可以依据冷冻保存液的制造者的指示。
保存期间没有特别限定，例如可列举出：1周以上、2周以上、3周以上、4周以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上、5个月以上、6个月以上、1年以上或者更长时间。通过在较低的温度下保存而能够抑制细胞损伤，因此还可以从-80℃～-100℃之间的温度移至液氮上的气相(从约-150℃以下至-180℃以下)中进行保存。在液氮上的气相中进行保存时，可以使用本领域技术人员所公知的保存容器进行。虽然没有特别限定，但例如进行2周以上保存时，优选在液氮上的气相中进行保存。
从融解的脂肪组织来源基质细胞或脂肪组织中分离的基质细胞优选适宜培养直至进行下述冷冻保存为止。使用能够培养上述基质细胞的培养基来进行培养，没有特别限定，可以在约30～40℃、优选为约37℃的培养温度下、在含有CO2的空气气氛下进行。CO2浓度约为2～5％、优选约为5％。培养时还可以在相对于培养容器达到适当的汇合(例如可列举出相对于培养容器细胞占有50％至80％的情况)后进行传代。本发明中，传代是指通过胰蛋白酶等的剥离剂使细胞剥离，以适当的细胞密度接种于另行准备的培养容器中。传代中作为典型的细胞密度，可示例出：约100个细胞/cm2～约100000个细胞/cm2、约500个细胞/cm2～约50000个细胞/cm2、约1000～10000个细胞/cm2、约2000～10000个细胞/cm2等。在特定的方式中，细胞密度为2000～10000个细胞/cm2。直至达到适当的汇合的期间优选调节为3天至7天。培养中还可以根据需要适宜更换培养基。
冷冻保存的细胞的融解可以利用本领域技术人员所公知的方法进行。例如可示例出在37℃的恒温槽内或热水中静置或振动来进行的方法。对于融解的细胞，可以在进行再次冷冻保存前进行培养，还可以作为后述治疗剂来制备。进行培养时，与上述传代同样地、可以通过以适当的细胞密度接种于另行准备的培养容器中来进行。
脂肪组织来源基质细胞根据培养方法，可以在不失去对肝病的治疗效果的情况下进行多次传代，增加其次数，但优选传代次数更少者。另一方面，为了通过培养来确保肝病治疗所需的细胞数，而优选进行传代。用于本发明的治疗的脂肪组织来源基质细胞例如优选为经过8次以下、7次以下、6次以下、5次以下、4次以下或3次以下的传代的细胞。更优选为经过4次以下的传代的细胞。本发明中，可以将细胞剥离、进行冷冻保存、融解的过程作为1次传代来计数。作为得到这样的脂肪组织来源基质细胞的方式，可示例出(1)对从脂肪组织中分离的基质细胞进行至少1次伴随传代的培养的工序；(2)进行冷冻保存的工序；(3)进行融解的工序；(4)进行培养的工序；(5)进行冷冻保存的工序；及(6)进行融解的工序。
上述制备的脂肪组织来源基质细胞可以作为肝病的治疗剂来利用。本发明中，肝病可示例出肝炎、肝硬化、脂肪肝等，该疾病有如下分类，根据原因不同的病毒性、酒精性、非酒精性、先天性、自体免疫性、代谢障碍性或药剂性的分类、根据发病期间的急性或慢性的分类，另外，有根据病情的进展的代偿性或非代偿性的分类，但这些分类全部包括在肝病中。如后述实施例中所提示的那样，通过脂肪组织来源基质细胞来抑制肝脏中的纤维化，因此肝病治疗还包括抑制肝脏的纤维化。本发明中，脂肪组织来源基质细胞可适宜地用于肝炎或肝硬化的治疗。
为了作为肝病的治疗剂使用，而期望脂肪组织来源基质细胞是从人来源的脂肪组织中分离的基质细胞，从使用冷冻保存的脂肪组织来源基质细胞这样的观点出发，期望从并非是患有肝病的给予对象的其它对象采集脂肪组织。即，脂肪组织来源基质细胞优选相对于被检体为同种异体。
根据本发明，可提供包含上述脂肪组织来源基质细胞作为有效成分的肝病治疗剂。进而根据本发明，可提供为了进行细胞移植治疗而使用的上述脂肪组织来源基质细胞。进而根据本发明，可提供包括向患有肝病的被检者给予治疗有效量的上述脂肪组织来源基质细胞的工序的、将细胞移植至被检者的方法、以及被检者的疾病的治疗方法。
利用上述方法而得到的经冷冻保存的脂肪组织来源基质细胞在融解后与输液制剂进行混合，从而能够制造包含脂肪组织来源基质细胞物的肝病治疗剂。在进行混合时，可以将悬浮有融解后的细胞的冷冻保存液与输液制剂进行混合，还可以利用离心分离等使细胞与溶剂分离后，仅将细胞与输液制剂进行混合。为了避免技术的复杂性，而优选的是：融解后不包括进行培养的工序，或将悬浮有融解后的细胞的冷冻保存液直接与输液制剂进行混合。该情况如后述实施例7中提示的那样，通过作为含有10％的DMSO的冷冻保存液与由ZENOAQ公司市售的STEM-CELLBANKER一起进行给予，能使肝损伤标记物降低，由此确认了通过该技术的有效性。混合了细胞的输液制剂进而还可以包含药学上容许的载体。本发明中，载体可示例出用于给予治疗药的稀释剂、佐剂、赋形剂、pH缓冲剂、等渗剂、蛋白质(例如，为白蛋白等的血清成分)和糖类(例如，葡萄糖)。需要说明的是，本发明的肝病治疗剂中还包括组合了冷冻的脂肪组织来源基质细胞和输液制剂的试剂盒。
作为本发明中的“输液制剂”，只要是用于人治疗时的溶液就没有特别限定，例如可列举出：生理盐水、日本药典生理盐水、5％葡萄糖液、日本药典葡萄注射液、日本药典林格溶液、乳酸林格溶液、乙酸林格溶液、1号液(开始液)、2号液(脱水补给液)、3号液(维持液)、4号液(术后恢复液)等。
本发明的肝病治疗剂的给予方法没有特别限定，例如可列举出：皮下注射、***内注射、静脉内注射、门静脉内注射、腹腔内注射、胸腔内注射、肝动脉内注射或向肝或脾脏中的直接注射等，优选为静脉内注射、门静脉内注射、脾脏内给予。
本发明的肝病治疗剂的给予量是与未给予的被检者相比在给予至被检者时能得到对于疾病的治疗效果的细胞量。具体的给予量可以根据给予形态、给予方法、使用目的和被检者的年龄、体重和症状等来进行适宜确定，但作为一个例子，以脂肪组织来源基质细胞数计、人(例如成人)每1次给予优选1×105～1×109个/kg体重、更优选1×105～1×108个/kg体重、进一步优选1×105～1×107个/kg体重。
作为本发明的肝病治疗剂的给予次数，可以将上述给予量进行一天1次给予或分成多次来给予。而且，还可以适宜隔天给予上述给予量。在隔天给予时，还可以适宜增减1次的给予量。
本发明的肝病治疗剂可以与其它治疗药组合使用，还可以以单剂的形式使用。
实施例
通过以下的实施例对本发明进行具体地说明，但本发明不限定于实施例。
[实施例1]本发明的肝病治疗剂的制备
人脂肪组织来源基质细胞的确立
得到人供体的同意后，用生理盐水对利用吸脂法得到的皮下脂肪组织进行清洗。为了实现细胞外基质的破坏和细胞的分离，添加Liberase(胶原酶)(Roche公司)(溶剂为生理盐水)，在37℃下振动90分钟进行分散。接着，将该上述悬浮液以800g进行5分钟离心分离而得到基质血管细胞组的沉淀。
向上述细胞的沉淀中加入基质细胞用无血清培养基(Rohto公司)，将该细胞悬浮液以400g进行5分钟离心分离，在去除上清液后再悬浮于基质细胞用无血清培养基(Rohto公司)中，将细胞接种于烧瓶中。
将细胞在37℃下、5％CO2气氛中培养数天。数天后用PBS清洗培养物并去除培养液中所包含的血球、脂肪组织的残存等，得到粘接于塑料容器的基质细胞。
人脂肪组织来源基质细胞的冷冻保存
将得到的人脂肪组织来源基质细胞分注于离心管中，以400g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，加入适量细胞冷冻保存液(STEM-CELLBANKER(ZENOAQ公司))使其悬浮。将该细胞悬浮溶液分注于CryoTube(冷存管)后，在冷冻仪内、-80℃下保存，然后移至液氮上的气相中继续保存。
人脂肪组织来源基质细胞的融解
在37℃的恒温槽中，将冷冻保存于冷存管中的人脂肪组织来源基质细胞溶解并移至离心管中，用基质细胞用无血清培养基(Rohto公司)进行稀释后，以400g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，悬浮于基质细胞用无血清培养基(Rohto公司)中，接种于烧瓶中。数天后加入胰蛋白酶，将细胞剥离，稀释细胞，在此基础上接种于新的烧瓶中。将从接种经处理的皮下脂肪组织起至通过胰蛋白酶进行的剥离/细胞的回收作为1次传代，共计进行4次传代，由此进行了扩大培养。如上所述对得到的人脂肪组织来源基质细胞进行冷冻保存。对疾病个体进行给予时，如后述实施例中所述，使该冷冻细胞融解，将悬浮于适当的悬浮液中的物质作为本发明的肝病治疗剂使用。
[实施例2]肝硬化的治疗效果研究试验1
给予细胞的制备
利用上述方法融解如上所述保存的人脂肪组织来源基质细胞，以400g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，加入乳酸林格溶液进行再悬浮。对活细胞数进行计数，以活细胞密度为5×106个细胞/mL的方式加入乳酸林格溶液进行制备。
模型小鼠的制作和治疗效果
用橄榄油(和光纯药工业株式会公司)稀释四氯化碳(CCl4)(和光纯药工业株式会社或Sigma-Aldrich公司)而制作5v/v％浓度的溶液，通过将CCl4以0.5mL/kg、每周2次频率重复8周给予至BALB/c小鼠的腹腔内，从而制作了肝硬化模型。重复给予CCl4开始4周后从尾静脉给予1×106个人脂肪组织来源基质细胞。作为阴性对照，准备了仅给予了乳酸林格溶液的组。为了评价，在重复给予CCl4开始8周后采集血液，进行了生化学检查。其结果，确认了表示肝细胞毒性程度的AST和ALT在细胞给予组中显示出降低倾向(图1)。
[实施例3]急性肝炎的治疗效果研究试验1
给予细胞的制备
利用上述方法融解如上所述保存的人脂肪组织来源基质细胞，以400g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，悬浮于PBS，接种于预先加热至37℃的基质细胞用无血清培养基(Rohto公司)中，培养4天，利用胰蛋白酶处理使细胞剥离，进行离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，溶解于乳酸林格溶液，制成1×106个细胞/200μL(Cultured MSC：G2)。另一方面，利用上述方法融解如上所述保存的人脂肪组织来源基质细胞，以400g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，溶解于乳酸林格溶液中，制成1×106个细胞/200μL(Cryopreserved MSC：G3)。
模型小鼠的制作和治疗效果
用橄榄油稀释CCl4而制作1.25v/v％浓度的溶液，以0.0625mL/kg将CCl4给予至BALB/c小鼠的腹腔内而制作了急性肝炎模型。CCl4给予1天后从尾静脉给予1×106个细胞/200μL的人脂肪组织来源基质细胞。作为阴性对照，准备了仅给予了乳酸林格溶液的组。为了评价，在CCl4给予2天后(细胞给予1天后)采集血液，进行了生化学检查。其结果，确认了表示肝细胞毒性程度的AST和ALT在细胞给予组中显示出降低倾向(图2)。
[实施例4]急性肝炎的治疗效果研究试验2
给予细胞的制备
利用上述方法融解如上所述保存的人脂肪组织来源基质细胞，以400g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，悬浮于PBS，接种于预先加热至37℃的基质细胞用无血清培养基(Rohto公司)中，培养数天后，利用胰蛋白酶处理使细胞剥离，进行离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，溶解于乳酸林格溶液，制成1×106个细胞/200μL。
模型小鼠的制作和治疗效果
用橄榄油稀释CCl4而制作1.25v/v％浓度的溶液，以0.0625mL/kg向BALB/c小鼠的腹腔内给予CCl4而制作了急性肝炎模型。CCl4给予4小时后从尾静脉给予1×106个细胞/200μL的人脂肪组织来源基质细胞(G2)。作为阴性对照，准备了仅给予了PBS的组(G1)。另一方面，从尾静脉给予1×106个细胞/200μL的人脂肪组织来源基质细胞，4小时后给予至腹腔内0.0625mL/kg的CCl4，制作了急性肝炎模型(G3)。
为了评价，在CCl4给予1天后采集血液，进行了生化学检查。其结果，确认了通过诱发肝炎前后的任意的细胞给予均使表示肝细胞毒性程度的AST和ALT显示出降低倾向(图3)。
[实施例5]暴发型肝炎的治疗效果研究试验1
给予细胞的制备
利用上述方法融解如上所述保存的人脂肪组织来源基质细胞，以200g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，悬浮于基质细胞用无血清培养基(Rohto公司)后，进行离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，溶解于乳酸林格溶液，制成1×106个细胞/200μL。
模型小鼠的制作和治疗效果
在PBS中溶解伴刀豆球蛋白A型IV(Sigma-Aldrich公司)来制作4mg/mL浓度的溶液，以20mL/kg给予至腹腔内而制作了暴发型肝炎模型。30分钟后，以5×107个细胞/kg从尾静脉给予了人脂肪组织来源基质细胞(G2)。作为阴性对照，准备了仅给予了PBS的组(G1)。
为了评价，在伴刀豆球蛋白A给予1天后采集血液，进行了生化学检查。其结果，确认了通过细胞给予而表示肝细胞毒性程度的AST和ALT显示出降低倾向(图4)。
[实施例6]暴发型肝炎的治疗效果研究试验2
给予细胞的制备
将如上所述保存的人脂肪组织来源基质细胞利用上述方法融解，以200g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，悬浮于基质细胞用无血清培养基(Rohto公司)，进行离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，溶解于乳酸林格溶液中，制成1×106个细胞/200μL。
模型小鼠的制作和治疗效果
在PBS中溶解伴刀豆球蛋白A型IV来制作4mg/mL浓度的溶液，以20mL/kg给予至腹腔内而制作了暴发型肝炎模型。30分钟后以1.5×107个细胞/kg(中用量组、G2)和5×107个细胞/kg(高用量组、G3)从尾静脉给予了人脂肪组织来源基质细胞。作为阴性对照，准备了仅给予了乳酸林格溶液的组(G1)。
为了评价，在伴刀豆球蛋白A给予1天后采集血液，进行了生化学检查。其结果，确认了通过细胞给予而使表示肝细胞毒性程度的AST和ALT显示出降低倾向(图5)。
[实施例7]急性肝炎的治疗效果研究试验3
给予细胞的制备
利用上述方法融解如上所述保存的人脂肪组织来源基质细胞，加入STEM-CELLBANKER制成1×106个细胞/200μL。
模型小鼠的制作和治疗效果
用橄榄油稀释CCl4而制作1.25v/v％浓度的溶液，以0.0625mL/kg给予至BALB/c小鼠的腹腔内而制作了急性肝炎模型。CCl4给予1天后从尾静脉给予了1×106个细胞/200μL的人脂肪组织来源基质细胞(G3)。作为比较对象，准备了给予了200μL～800μL的STEM-CELLBANKER的组(G2)。另一方面，相对于仅给予了BALB/c小鼠的橄榄油的健康模型，给予了200μL～800μL的STEM-CELLBANKER(G1)。
为了评价，在CCl4给予2天后(细胞给予1天后)采集血液，进行了生化学检查。其结果，确认了STEM-CELLBANKER本身不会诱发肝炎以及不具有肝炎的治疗效果。另外，确认了即使与STEM-CELLBANKER一起给予细胞，表示肝细胞毒性程度的AST和ALT也显示出降低倾向(图6)。
[实施例8]肝硬化的治疗效果研究试验2
给予细胞的制备
利用上述方法融解冷冻保存的人脂肪组织来源基质细胞(hADSC、Lonza公司)，以200g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，使之悬浮于PBS中，接种于预先加热至37℃的基质细胞用无血清培养基(Rohto公司)中，培养了4天。利用ACCUTASE处理使得到的细胞剥离，进行离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，溶解于乳酸林格溶液中，制成5.4×106个细胞/mL。
模型小鼠的制作和治疗效果
用橄榄油稀释CCl4而制作10v/v％和25v/v％的浓度的溶液，通过适宜调节给予量，从而将1mL/kg用量的CCl4以每周2次频率重复8周的方式给予至BALB/c小鼠的腹腔内而制作了肝硬化模型。在重复给予CCl4开始4周后从尾静脉给予了1×106个细胞的人脂肪来源干细胞(10％+MSC组和25％+MSC组)。作为阴性对照，准备了未给予人脂肪来源干细胞的组(10％组和25％组)。另外，准备了未给予CCl4的正常动物(Normal组)。
为了评价，在重复给予CCl4开始8周后摘除肝脏，通过Masson三色染色标本观察的肝纤维化得分和肝组织中羟脯氨酸含量测定来评价肝纤维化的强度。其结果，确认了无论诱发肝纤维化时的CCl4的浓度如何，在细胞给予组中均抑制了肝纤维化(图7的A和B)。
[实施例9]肝硬化的治疗效果研究试验3
给予细胞的制备
利用上述方法融解如上所述保存的人脂肪组织来源基质细胞，以200g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后，使之悬浮于乳酸林格溶液中，制成5×106个细胞/mL。
模型小鼠的制作和治疗效果
用橄榄油稀释CCl4而制作50v/v％和75v/v％的浓度的溶液，通过适宜调节给予量，从而将1mL/kg用量的CCl4以每周2次频率重复8周的方式给予至BALB/c小鼠的腹腔内而制作了肝硬化模型。在重复给予CCl4的开始4周后从尾静脉给予了1×106个细胞的人脂肪组织来源基质细胞(CCl4+MSC)。作为阴性对照，准备了给予了CCl4但未给予人脂肪组织来源基质细胞的组(CCl4)。另外，准备了未给予CCl4的正常动物(Normal)。
为了评价，在重复给予CCl4的8周后摘除肝脏，通过肝组织中羟脯氨酸含量测定评价了肝纤维化的强度。其结果，确认了在细胞给予组中显示出肝内的羟脯氨酸量的降低倾向(图8)。因此，启示出通过给予人脂肪组织来源基质细胞而能够抑制慢性肝炎中的纤维化的可能性。
[实施例10]非酒精性脂肪性肝炎的治疗效果研究试验
给予细胞的制备
利用上述方法融解如上所述保存的人脂肪组织来源基质细胞，收集于离心管中。去除上清液后，加入乳酸林格溶液，活细胞以1.5×106个细胞/mL的方式来制备。
模型小鼠的制作和治疗效果
通过让KK-Ay小鼠摄取9周胆碱缺乏氨基酸制备饲料(CDAA)，由此制作了非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠(NASH)。饲料摄取开始第8天从尾静脉以每2周1次、共计给予4次的方式给予3×105个细胞的人脂肪组织来源基质细胞。作为阴性对照，准备了摄取了通常饲料的组和未向各非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠给予细胞的组。
摄取期间结束的第二天摘除肝脏，通过肝组织中羟脯氨酸含量测定评价了肝纤维化的强度。其结果，确认了在细胞给予组中肝组织中羟脯氨酸量的降低(图9)。因此，启示出通过给予人脂肪组织来源基质细胞而能够抑制非酒精性脂肪性肝炎中的纤维化的可能性。
[实施例11]肝硬化的治疗效果研究试验4
给予细胞的制备
利用上述方法融解如上所述保存的2种脂肪组织来源基质细胞(TRB02或TRB03)，收集于离心管中。离心分离后去除上清液，加入2mL乳酸林格溶液。适宜追加乳酸林格溶液，以活细胞为5×106个细胞/mL的方式来制备。
模型小鼠的制作和治疗效果
用橄榄油稀释CCl4而制作10v/v％的浓度的溶液，将10mL/kg的容量以每周2次频率重复8周的方式给予至BALB/c小鼠的腹腔内而制作了肝硬化模型。在重复给予CCl4的4周后从尾静脉给予了1×106个细胞的人脂肪组织来源基质细胞(TRB02或TRB03)(单次给予)。另外，在重复给予CCl4开始0、2、4和6周后从尾静脉给予了1×106个细胞的人脂肪组织来源基质细胞(隔周共计给予4次)。作为阴性对照，准备了未给予CCl4的组以及给予了CCl4但未给予人脂肪组织来源基质细胞的组。
为了评价，在重复给予CCl4的8周后摘除肝脏，通过测定肝组织中羟脯氨酸含量而评价了肝纤维化的强度。其结果，确认了在细胞给予组中显示出肝组织中羟脯氨酸量显著地降低(图10)。因此，启示出人脂肪组织来源基质细胞的给予即使为单次给予也能够抑制肝硬化中的纤维化的可能性。
[实施例12]
抗炎症效果的评价
将2×105个THP-1细胞(理研BRC)接种于12孔板中，在100nM Phorbol 12-Myristate 13-Acetate(佛波酯)(和光纯药)存在下、进行72小时培养而诱导了向巨噬细胞的分化。进行了巨噬细胞的分化诱导后，通过添加1μg/ml的LPS(InvivoGen公司)来诱导活化，同时开始进行与人脂肪组织来源基质细胞(hADSC、Lonza公司、传代数4)的共培养。共培养使用Falcon细胞培养添加物(Corning公司)进行，将人脂肪组织来源基质细胞接种于上部腔室上。在LPS刺激24小时后从下部腔室回收THP-1巨噬细胞，通过定量PCR测定了炎性细胞因子(IL6、CCL2、IL1β和TNF)的mRNA表达(图11)。
其结果，确认了通过LPS刺激的炎性细胞因子的表达诱导通过与人脂肪组织来源基质细胞的共培养而得以抑制。因此，启示出人脂肪组织来源基质细胞具有抗炎症作用。

Claims (17)

1.一种肝病治疗剂，其包含至少进行2次冷冻保存和融解的脂肪组织来源基质细胞。
2.根据权利要求1所述的肝病治疗剂，其为肝炎治疗用。
3.根据权利要求1所述的肝病治疗剂，其为肝硬化治疗用。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的肝病治疗剂，其为抑制肝脏纤维化用。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的肝病治疗剂，其中，所述脂肪组织来源基质细胞相对于被检体为同种异体。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的肝病治疗剂，其中，所述脂肪组织来源基质细胞为人脂肪组织来源基质细胞。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的肝病治疗剂，其中，所述至少进行2次冷冻保存和融解包括以下的工序：
(1)对脂肪组织来源基质细胞进行冷冻保存和融解的工序；
(2)培养该融解的细胞的工序；及
(3)对该培养的细胞进行冷冻保存和融解的工序。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的肝病治疗剂，其中，所述脂肪组织来源基质细胞为4次传代以下的脂肪组织来源基质细胞。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的肝病治疗剂，其中，所述冷冻保存在液氮上的气相中进行。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的肝病治疗剂，其中，所述冷冻保存使用包含二甲基亚砜即DMSO的溶液来进行。
11.一种包含脂肪组织来源基质细胞的肝病治疗剂的制造方法，其具有如下工序：
(i)培养从采集的脂肪组织中分离的基质细胞的工序；
(ii)对工序(i)中得到的脂肪组织来源基质细胞进行冷冻保存和融解的工序；
(iii)对融解的脂肪组织来源基质细胞进行冷冻保存和融解的工序；及
(iv)将工序(iii)中融解的脂肪组织来源基质细胞与输液制剂进行混合的工序。
12.根据权利要求11所述的制造方法，其中，所述冷冻保存使用冷冻保存液进行，工序(iv)是对包含融解的脂肪组织来源基质细胞的冷冻保存液和输液制剂进行混合的工序。
13.根据权利要求11或12所述的制造方法，其中，所述脂肪组织来源基质细胞为人脂肪组织来源基质细胞。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的制造方法，其中，所述工序(i)的培养至少进行1次传代。
15.根据权利要求11～14中任一项所述的制造方法，其中，所述工序(ii)中，还包括培养融解的脂肪组织来源基质细胞的工序。
16.根据权利要求11～15中任一项所述的制造方法，其中，所述冷冻保存在液氮上的气相中进行。
17.根据权利要求12～16中任一项所述的制造方法，其中，所述冷冻保存液是包含DMSO的溶液。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2018116732A1 (ja) * 2016-12-22 2019-10-24 ロート製薬株式会社 非アルコール性脂肪肝炎治療剤及び非アルコール性脂肪肝炎治療用キット
US11253550B2 (en) * 2017-03-03 2022-02-22 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Method for treating fibrotic liver disease
WO2023112942A1 (ja) * 2021-12-16 2023-06-22 慶應義塾 脂肪組織由来間葉系幹細胞株を用いた肝障害の治療

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009067601A1 (en) * 2007-11-20 2009-05-28 Pioneer Surgical Orthobiologics, Inc. Cryopreservation of cells using cross-linked bioactive hydrogel matrix particles
CN101103101B (zh) * 2004-09-24 2012-10-10 成血管细胞***公司 增强间充质前体细胞（mpc）的增生和/或存活的方法
EP2554176A1 (en) * 2011-08-04 2013-02-06 ETHIANUM Betriebsgesellschaft mbH & Co. KG Means and methods for liver regeneration
CN103451152A (zh) * 2013-08-30 2013-12-18 浙江大学 脂肪间充质干细胞在制备肝癌化疗增敏制剂中的应用
CN104136034A (zh) * 2011-11-30 2014-11-05 先进细胞技术公司 间充质基质细胞及其相关用途

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6777231B1 (en) 1999-03-10 2004-08-17 The Regents Of The University Of California Adipose-derived stem cells and lattices
US20030054331A1 (en) 2001-09-14 2003-03-20 Stemsource, Inc. Preservation of non embryonic cells from non hematopoietic tissues
AU2002357135C1 (en) * 2001-12-07 2009-01-22 Macropore Biosurgery, Inc. Systems and methods for treating patients with processed lipoaspirate cells
ES2313805B1 (es) 2004-10-04 2009-12-23 Cellerix, S.L. Identificacion y aislamiento de celulas multipotentes de tejido mesenquimal no osteocondral.
WO2008140141A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 Rnl Bio Co., Ltd. Pharmaceutical composition for preventing and treating liver fibrosis or hepatic cirrhosis comprising mesenchymal stem cell
JP2009001509A (ja) * 2007-06-19 2009-01-08 Univ Nagoya 脂肪組織由来幹細胞を用いた組織再生用組成物
WO2009115581A2 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Cryo-Save Ag Improved cryopreservation of adipose tissue for the isolation of mesenchymal stem cells
JP5940975B2 (ja) 2009-07-20 2016-06-29 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション ディー／ビー／エイ マサチューセッツ ジェネラル ホスピタル 凍結保存細胞の生存率を向上させるための方法および組成物
EP2566955A4 (en) * 2010-05-06 2014-10-29 Stem Cell Medicine Ltd STEM CELL BANK FOR PERSONALIZED MEDICINE
JP5804342B2 (ja) * 2010-09-11 2015-11-04 国立大学法人金沢大学 脂肪組織由来間質細胞群を含む肝炎治療剤
AU2012313352B2 (en) * 2011-09-23 2015-07-02 Cell Ideas Pty Ltd Stem cells and secretions for treatment of inflammatory conditions
EP3476410B1 (en) * 2012-09-19 2021-08-18 MicroVascular Tissues, Inc. Compositions and methods for treating and preventing tissue injury and disease
WO2016001839A1 (en) * 2014-06-30 2016-01-07 Stempeutics Research Pvt. Ltd. Management of liver disease using pooled mesenchymal stromal cells
TWI740812B (zh) * 2015-01-05 2021-10-01 國立陽明大學 用於治療肝臟疾病的間葉幹細胞

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101103101B (zh) * 2004-09-24 2012-10-10 成血管细胞***公司 增强间充质前体细胞（mpc）的增生和/或存活的方法
WO2009067601A1 (en) * 2007-11-20 2009-05-28 Pioneer Surgical Orthobiologics, Inc. Cryopreservation of cells using cross-linked bioactive hydrogel matrix particles
EP2554176A1 (en) * 2011-08-04 2013-02-06 ETHIANUM Betriebsgesellschaft mbH & Co. KG Means and methods for liver regeneration
CN104136034A (zh) * 2011-11-30 2014-11-05 先进细胞技术公司 间充质基质细胞及其相关用途
CN103451152A (zh) * 2013-08-30 2013-12-18 浙江大学 脂肪间充质干细胞在制备肝癌化疗增敏制剂中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MURALI KRISHNA MAMIDI等: "Comparative Cellular and MSuccessive Cryopreservationolecular Analyses of Pooled Bone Marrow Multipotent Mesenchymal Stromal Cells During Continuous Passaging and After", 《JOURNAL OF CELL BIOCHEMISTRY》 *
吴洁莹等: "脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存", 《中国组织工程研究》 *

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