CN108285902A - 生产高价值天然产物的工程菌的构造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，以及用这种构造方法所制造的生产高价值天然产物的工程菌。该方法为将人工调控组件导入宿主细胞，每个所述宿主细胞内存在一个或者多个、一种或多种人工调控组件，所述人工调控组件包括载体、启动子、5’非翻译区和编码模块，所述编码模块可操作地连接于人工调控组件，所述编码模块包括hmgS‑atoB‑hmgR模块、mevK‑pmk‑pmd‑idi模块、crtE‑crtB‑crtI‑ispA模块、crtY模块、crtY‑crtZ‑crtW模块、ispA‑nls模块或者GPPS‑nls模块。使用人工调控组件可以方便进行全局优化筛选，而选择不同的人工调控组件，能够兼顾全局和局部，不同的载体、不同的启动子序列、不同的RBS序列、不同的酶组合。

Description

生产高价值天然产物的工程菌的构造方法
技术领域
本发明涉及一种生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，以及用这种构造方法所制造的生产高价值天然产物的工程菌。
背景技术
目前天然产物的主要来源是生物提取（主要来源于植物）。然而由于在植物体内的天然产物含量很低并且有很多同属性杂质，其提取效率较低而且成本极其高昂。而且很多植物的生长周期很长因此只能利用野生植物，这种提取方案对许多稀有生物和生物多样性都构成严重威胁（如需要六颗生长百年的太平洋红豆杉才能提纯一剂量的紫杉醇，因此大量太平洋红豆杉被砍伐）。同时化学合成的化合物在结构（手性）、功能及安全性（残留有毒原料及中间体）等方面都与天然产物有着显著差距。随着合成生物学和代谢工程领域取得了空前的发展，用微生物来合成天然产物有着显著优势。相比植物提纯、微生物生长快速、生产周期短。并且经过工程优化的菌种，天然产物含量高纯度高，下游分离成本低。同时植物的生长需要占用大量耕地，而微生物发酵几乎不需要占用耕地。相比化学合成的化合物，微生物生产的产物不但更加环保和可持续，还有与天然产物具有完全一样的手性和生物活性等优势。
工程化的微生物***依赖于对许多相互依存的变量控制（如基因表达水平）。通过改变构成这些***的遗传成分，我们可以调节基因表达水平和其他参数，以了解这些***如何应对这些变化。目前，生物合成途径的工程优化主要采用组合技术，如全局转录机械工程和多重自动基因组工程来产生途径变体文库，并筛选出所需的表型。最近，依赖于组合装配的半定量方法已被用于DNA组件设计生物合成途径变体的文库。作为之前的一些案例，新型DNA组件（例如载体、启动子，核糖体结合位点（RBS））及酶变体已经被广泛开发并应用于设计和构建路径变体。具体来说，主要分成两大部分，一是全局设计方案，如启动子的案例。然而由于一个启动子同时调控几个基因的表达水平，导致这种全局方案无法调节这几个基因之间存在巨大差异（如蛋白质的表达量及其活性差异）。另一种是局部设计方案，这个方案主要调节几个关键基因，可以使用启动子或核糖体结合位点（RBS）来控制。这种局部方案存在忽视其***中未被控制基因等潜在问题（如活性不足或过强表达），因而同样会导致生物***的非优值。基于此，这里提出一个新的方案，多维度控制***方法（MCO）。MCO方法兼顾全局和局部，全局由载体或启动子或两者组合来控制，局部由RBS或酶变体或两者组合来优化。因此MCO方法更加灵活高效，并可以得到更优的工程化生物***。同时结合有效筛选（颜色或质谱）和统计模型，MCO方法比之前的方法需要更少的***参数数据，并可以利用预测模型（如果存在统计显着的***与变量关系）来不断优化和提高***。本文以甲羟戊酸途径在大肠杆菌的优化为例，证明MCO方法不仅可以应用于有色化合物（虾青素和胡萝卜素、蕃茄红素）还可以应用其他无色化合物（如萜类化合物，橙花叔醇和芳樟醇）的生产优化，阐明该方案的优越性和广泛适用性。
在自然界，与其他中间产物相比，虾青素具有更强的抗氧化性和生物活性。虾青素可以保护动植物组织不受紫外线损坏，还有很强的抗炎特性及抑制多种恶性肿瘤的生长。此外，虾青素还能预防动脉粥样硬化性心血管疾病和糖尿病，增强肌肉耐力，提升运动表现。因而广泛应用于食品、饲料、医药、保健品和化妆品等领域，市场需求巨大并且在快速增长。2016年调查数据显示，全球合成虾青素和天然虾青素的总市场规模在5.5亿美元，并预计在2025年将达到25.7亿美元。与虾青素相似，蕃茄红素和β胡萝卜素也是重要的天然色素，具有较强的抗氧化活性，而且对于增强人体免疫力、预防慢性疾病、促进细胞缝隙间连接交流、减少动脉硬化、延缓衰老以及有效抑制癌细胞的增殖等都具有重要意义，广泛用于药品、化妆品、保健品和食品添加。橙花叔醇是一种香料广泛用于各种化妆品（例如洗发水和香水）和非化妆品（例如洗涤剂和家用清洁剂）。而且，最近的研究表明橙花叔醇还具有许多药理和生物活性（抗氧化，抗微生物，抗生物膜，抗寄生和抗炎等）。芳樟醇是另一种重要的香料，不但被应用于在绝大多数化妆品及洗漱用品（沐浴露，洗发水和肥皂等），还具有镇静，抗焦虑和止痛作用等生物活性，因此市场前景尤为广阔。
发明内容
本发明目的在于提供一种能既进行全局调控，又能进行局部调控的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法以及应用该方法得到的生产高价值天然产物的各种工程菌。
本发明解决上述各种问题所采用的技术方案是： 该生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：将人工调控组件导入宿主细胞，每个所述宿主细胞内存在一个或者多个、一种或多种人工调控组件，所述人工调控组件包括载体、启动子、5’非翻译区和编码模块，所述编码模块可操作地连接于人工调控组件，所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块、crtY-crtZ-crtW模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块、ispA-nls模块或者GPPS-nls模块。各个模块中基因的意义如下，atoB为乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因，hmgS为HMG-CoA合酶基因，hmgR为HMG-CoA还原酶基因，mevK为甲羟戊酸激酶基因, pmk为磷酸羟脯氨酸激酶基因, pmd为甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶基因，idi为异戊烯焦磷酸异构酶基因，ispA为法呢基焦磷酸合成酶基因，crtE为香叶基香叶基焦磷酸合酶基因，crtB为八氢番茄红素合酶基因，crtI为八氢番茄红素去饱和酶基因，crtY为番茄红素环化酶基因，crtZ为β-胡萝卜素羟化酶基因，crtW为β-胡萝卜素酮化酶基因，nls为橙花叔醇/芳樟醇合酶基因，GPPS为香叶基焦磷酸合酶基因。比如hmgS-atoB-hmgR模块就是包含hmgS基因、atoB基因和hmgR基因的编码模块。编码模块中的每个酶基因都相对应的在5’非翻译区设置有核糖体结合位点（RBS），比如在人工调控组件的编码模块是hmgS-atoB-hmgR模块，那么有三个核糖体结合位点（RBS）分别控制hmgS基因、atoB基因和hmgR基因。工程菌的优化步骤为，a.构建载体库、启动子库、5’非翻译区库和酶变体库；b.全局调控载体和启动子和局部微调5’非翻译区和酶变体。
通过预定义的生物调节元件（载体，启动子和RBS）以及关键酶库以高维的方法形成菌体库，再辅以适当的筛选方法来得到最优菌株。不同于现有高通量方法（全局转录工程gTME （Alper, H., Moxley, J., Nevoigt, E., Fink, G.R. & Stephanopoulos, G.Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance andproduction. Science314, 1565-1568 (2006).）），多重自动基因组工程MAGE （Wang,H.H. et al. Programming cells by multiplex genome engineering and acceleratedevolution. Nature460, 894-898 (2009).），可调节基因间区域TIGR （Pfleger, B.F.,Pitera, D.J., Smolke, C.D. & Keasling, J.D. Combinatorial engineering ofintergenic regions in operons tunes expression of multiple genes. Nat. Biotechnol.24, 1027-1032 (2006).）），该方法通过预定义或预校准的调控元件库针对靶向特异性途径来优化，因此有更高的可控性和精准度。此外，结合逆向工程来探索潜在生物机制和边界条件，对于进一步的***改进及指导其他途径和天然产物的优化有着很高的借鉴价值。比现有的模块化方法（MMME, Ajikumar, P.K. et al. Isoprenoid pathwayoptimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.Science330, 70-74 (2010). EDASPO, Zhang, C., Zou, R., Chen, X.,Stephanopoulos, G. & Too, H.-P. Experimental design-aided systematic pathwayoptimization of glucose uptake and deoxyxylulose phosphate pathway forimproved amorphadiene production. Appl. Microbiol. Biotechnol.99, 3825-3837(2015)）。相比，本发明的方法更为先进通过引入了同步的全局优化（载体和启动子）和局部精调（RBS和酶多样性）的概念。区分于基于因子设计的优化方法（DoE, Xu, P., Rizzoni,E. A., Sul, S.-Y., & Stephanopoulos, G. (2016). Improving Metabolic PathwayEfficiency by Statistical Model-Based Multivariate Regulatory MetabolicEngineering. ACS Synthetic Biology, acssynbio.6b00187) ，本发明通过预定义组件来控制最终的菌体库（可大可小），并采用完全随机设计或全组合设计，并能结合高吞吐量***或结合逆向工程步骤的来构建引导下一轮优化的数据驱动模型。
作为优选，本发明所述5’非翻译区包括核糖体结合位点（RBS）。不同RBS序列能够影响蛋白翻译速度和表达量，通过选择不同核糖体结合位点（RBS）可以优化工程菌。
作为优选，本发明通过载体或启动子或两者组合来控制来进行全局调控，通过所述核糖体结合位点（RBS）或酶变体或两者组合来优化进行局部调控。
作为优选，本发明全局调控为对整个生物合成途径的所有酶的调控，对所有酶进行分组模块化以减少组合数量，每个模块都通过量化的载体或启动子或两者组合来控制。
作为优选，本发明在所述全局调控的基础上，所述局部调控是对整体生物***效率的进一步提升，模块分组可能导致模块成为整体生物***的瓶颈，而所述全局调控无法实现瓶颈模块的内部优化，因此，采用不同强度的5’非翻译区或不同活性的酶变体或两者组合来实现瓶颈模块的局部优化。
作为优选，本发明所述全局调控和所述局部调控可同步也可以分步进行。
作为优选，本发明所述宿主细胞为大肠杆菌。
作为优选，本发明所述载体为pBR322 或 p15A或pMB1 或ColE1或pSC101或它们的变体。
作为优选，本发明所述启动子为T7、TM1-255。其中，TM1-255是指TM1到TM255。
作为优选，本发明所述核糖体结合位点（RBS）为RZ1-4、RW1-4、RLZ1-36、RLW1-54、RBS2-10或其他RBS（AGGAGA）变体。其中RZ1-4、RW1-4、RLZ1-36、RLW1-54、 RBS2-10分别表示，RZ1到RZ4，RW1到RW4，RLZ1到RLZ36，RLW1到RLW54，RBS2到RBS10。
作为优选，本发明所述crtY-crtZ-crtW模块中的crtZ的RBS为RZ1-4或RLZ1-RLZ36的其中之一，所述crtY-crtZ-crtW模块中的crtW为RW1-4或RLW1-RLW54的其中之一。
作为优选，本发明所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块和/或crtY-crtZ-crtW模块，用于生产虾青素。
作为优选，本发明所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块和/或crtE-crtB-crtI-ispA模块，用于生产番茄红素。
作为优选，本发明所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块和/或crtY模块，用于生产胡萝卜素。
作为优选，本发明所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块和/或ispA-nls模块，用于生产橙花叔醇。
作为优选，本发明包括所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块和/或GPPS-nls模块，用于生产芳樟醇。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：使用人工调控组件可以方便进行全局优化筛选，而选择不同的人工调控组件，能够兼顾全局和局部，不同的载体、不同的启动子序列、不同的RBS序列、不同的酶组合。
附图说明
图1是制造生产高价值天然产物的工程菌的流程图。
图2a、图2b、图2c是启动子文库表，包括T7、TM1-TM256。
图3a、图3b、图3c是RBS文库表，包括RLZ1-RLZ54。
图4是64种组合表。
图5是各菌种调控表。
图6a是相对强度图，图6b三个模块之间的正交组合，图6c不同菌种的产量图。
图7a是ctrY1和crtY2的产量图，图7b是使用中低拷贝的载体对比图，图7c是拟合图。
图8a是不同载体的效果图，图8b是不同RBS和不同酶变体的效果图，图8c是HPLC图。
图9是局部微调和全局控制的示意图。
图10是合成路径图。
图11是RBS相对强度图。
图12a是不同RBS组合图，图12b是crtW和crtZ相对强度三维拟合图，图12c是拟合曲线图。
图13a、图13b是crtY、crtW、crtZ等的基因序列图。
图14是硫代磷酸化引物及其序列表。
图15是菌株和质粒表。
图16a是橙花叔醇/芳樟醇的合成路径，图16b和图16c分别是橙花叔醇/芳樟醇的菌落表。
图17a和图17b是crtZ和crtW的RBS库的预测翻译效率。
具体实施方式
下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
本发明中使用全局调控和局部调控结合的方法，全局调控是本发明方法的基础，为对整个生物合成途径的所有酶的调控，参见图10，采用本发明方法对所有酶进行分组模块化以减少组合数量，每个模块都通过量化的载体或启动子或两者组合来控制。以虾青素为例，从乙酰辅酶A到虾青素的15个生物酶被分组成4个模块，每个模块都由量化的载体和启动子控制。
在全局调控的基础上，局部调控是对整体生物***效率的进一步提升。模块分组可能导致单个或几个，具体的讲是单一或少数几个模块成为整体生物***的瓶颈，而全局调控无法实现瓶颈模块的内部优化。因此，采用不同强度 的5’非翻译区或不同活性的酶变体或两者组合来实现瓶颈模块的局部优化。以虾青素为例，crtY-crtZ-crtW模块为瓶颈模块，且无法通过载体或启动子提升其效率，这里采用了不同酶变体和不同5’非翻译区的组合，实现了对整体生物***的效率提升。
全局调控和局部调控可同步也可以分步进行。如在虾青素实例中，先采用全局调控，再进行局部微调；而在橙花叔醇和芳樟醇实例采用了同步全局和局部调控。
如本发明中将人工调控组件导入宿主细胞，每个宿主细胞内存在一个或者多个、一种或多种人工调控组件，人工调控组件包括载体、启动子、5’非翻译区和编码模块，编码模块可操作地连接于人工调控组件，编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块、crtY模块、crtY-crtZ-crtW模块、ispA-nls模块或者GPPS-nls模块。编码模块就是分组模块化。
本专利提供一种既能进行全局调控，又能进行局部调控的工程菌的构造方法，并以大肠杆菌生产虾青素、蕃茄红素、β胡萝卜素、橙花叔醇和芳樟醇为例说明该方法的高效性和鲁棒性。虾青素是一种红色素，是类胡萝卜素的一种，更是类胡萝素合成的最高级别产物。
实施例。
本实施例使用的是生物合成方法，如图10 所示的路径图，本实施例中使用的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法包括全局优化和局部优化，通过使用预定义的调节元件（调节元件指载体，启动子和RBS）与酶变体以高维度组合方式精细组装菌体文库，并结合适当的筛选方法来得到产量更高的微生物。载体和启动子全局调节包括多个基因的操纵子/模块的拷贝数和转录，而不是模块内基因的相对表达。5'非翻译区（5'UTR）作为控制单基因翻译的局部调节子。最后，结合生物酶多样性（天然生物来源或酶工程改造，例如定向进化或DNA改组）来选取最优的表达、活性和选择性。因此，本实施例的方法克服了以前的路径优化方法的局限性。本实施例应用该方法，即通过在大肠杆菌中控制多个异源基因和多个天然基因来优化虾青素的生产，并取得了目前为止最高的产率和生产速率。更进一步，我们还应用了本实施例的方法来优化生产了其他的萜类化学物（包括并不限于C15橙花叔醇、C15绿花白千层醇和C10芳樟醇），在一周时间得到几十倍的产量提高。说明本发明的高效性、鲁棒性（robustness）和广泛适用性。
生物合成途径的不均衡问题是影响代谢途径性能的主要障碍，从而限制了生物***的应用，使得许多高价值化学品的生物合成达不到的商业生产要求。本实施例的方法，是一种***的方法，通过预定义的生物调节元件（载体，启动子和RBS）以及关键酶库以高维的方法形成菌体库，再辅以适当的筛选方法来得到最优菌株。不同于高通量方法（全局转录工程gTME 49，多重自动基因组工程MAGE 50，可调节基因间区域TIGR 51），本实施例的方法通过预定义或预校准的调控元件库针对靶向特异性途径来优化，因此有更高的可控性和精准度。此外，本实施例的方法结合逆向工程，允许我们探索潜在机制和边界条件，这对于进一步的改进***及指导其他途径和产品的优化有着很高的借鉴价值。比现有的模块化方法（MMME 25，EDASPO 26）相比，本实施例的方法更为先进通过引入了同步的全局优化（载体和启动子）和局部精调（RBS和酶多样性）的概念。区分于基于因子设计的优化方法，MCO通过预定义组件来控制最终的菌体库（可大可小），并采用随机设计或全组合设计，并能结合高吞吐量***或结合逆向工程步骤的来构建引导下一轮优化的数据驱动模型。
制造生产高价值天然产物的工程菌的流程图，图1所示：
（1）首先，通过实验或数学方法建立并表征启动子和RBS文库。启动子文库（T7，TM1-255）通过实验建立，启动子文库参见图2。RBS文库（RZ1-4、RW1-4、RLZ1-36和RLW1-54）由数学模拟建立，也可以实验建立并表征（RBS2-10），RBS文库参见图3、图17a和图17b。
（2）以下实验具有取决于产物是否可以应用高通量分析方法（比色或荧光）。如果可以，之后的随机克隆进行了一个大的组合文库（1010-1015）和高通量预筛选。如果产物检测不可以高通量分析方法，后续的随机克隆则选用小的组合文库（102-103）。
（3）然后再通过表型（分析菌落的颜色或产物的产量用气相色谱，液相色谱和核磁共振光谱等检测）来筛选较优的基因型。
（4）接下来，进一步验证了液体培养中的菌株性能。
（5）通过测序分析基因型并应用逆向工程来设计菌株（如果不进行逆向设计，此步可省略）。
（6）最后，选用最优的基因型在生物反应器中进行放大实验。
在（2）的时候，通过克隆载体库、启动子库、5’非翻译区库和酶变体库中的不同载体、启动子、5’非翻译区和酶变体连接成不同的质粒，将质粒导入宿主细胞。每个宿主细胞内存在一个或者多个质粒，每个质粒包含一种或多种人工调控组件（载体、启动子、5’非翻译区）及连接于一个或多个编码模块，编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块、crtY-crtZ-crtW模块、crtY模块、ispA-nls模块或GPPS-nls模块。
本实施例中的方法通过载体或启动子或两者组合来控制来进行全局调控，通过所述核糖体结合位点（RBS）或酶变体或两者组合来优化进行局部调控。
实施例1：
本实施例以制备生产番茄红素的工程菌为例（载体为pSc101,ColE1和p15A， RBS采用通用设计为AGGAGG或AGGAGA），编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块（简称为AHT模块），mevK-pmk-pmd-idi模块（简称为MPPI模块）或crtE-crtB-crtI-ispA模块（简称为EBIA模块）。每个启动子连接一个编码模块，本实施例中的启动子库包括T7、TM1、TM2和TM3四种启动子。每一个人工调控组件只包含一个启动子，本实施例中的启动子控制编码模块在载体中的表达，其相对强度通过实验预先确定（参见图6a）。三个编码模块分别由4个不同启动子连接，克隆后共得到43=64种组合，见图6b，64种不同组合的菌株（参见图4，图中第一模块为AHT模块，MPPI模块为第二模块，EBIA模块为第三模块）。通过平板筛选，得到7个红色菌落作为高番茄红素生产者和1个白色菌落作为对照，然后选取高产菌株，进行逆向工程，得到结果，参见图6c，在验证实验中，菌株322（见图5）生产了46,000 ppm（46 mg/g细胞干重）的番茄红素 （超过目前报道的在大肝杆菌的最高含量20,000 ppm ，接近目前报道的在酵母中的最高含量54,000 ppm ），超过对照菌株323（见图5）含量（4000 ppm）的11倍。
实施例2：
在实施例1的基础上通过引入第四模块（番茄红素环化酶基因crtY1 或crtY2），重复实施例1中的步骤，以此得到的新菌株来生产β-胡萝卜素。其中，crtY1的表达得到高达11,300ppm的胡萝卜素含量，超过crtY2 （8,700 ppm）30%，参见图7a。然而此产量远低于之前蕃茄红素的含量，考虑可能是第四模块拷贝数的影响。果然，低拷贝的载体的使用显著提高了β-胡萝卜素的含量，参见图7a和图7b， 最高得到47,000 ppm β-胡萝卜素同时还有7,000 ppm的蕃茄红素。本实施例的工程菌可以生产β-胡萝卜素。最后图7c中是一个拟合图。
实施例3：
在实施例2的基础上制备生产虾青素的工程菌为例，宿主细胞使用大肠杆菌，本实施例中的载体库包含pBR322载体和p15A载体（参见图8a），不同RBS序列（影响蛋白翻译速度和表达量）和不同的酶组合（图8a，图8b，图8c）pBR322载体的使用获得较高的虾青素产量，但总类胡萝卜素的产量远低于p15A。在四种组合中，crtZ1-crtW1（或11，参见图5），crtZ1-crtW2（或12，参见图5），crtZ2-crtW1（或21，参见图5）和crtZ2-crtW2（或22，参见图5）的组合中，菌株22（参见图5）积累了最高的虾青素（4,800 ppm）和最高玉米黄质（4,400 ppm），而在菌株12（参见图5）中产生最高的角黄素（3,400 ppm），并且在菌株11（参见图5）中保留最高的β-胡萝卜素（9,500 ppm）。此外，图8b表明使用不同的RBS同时影响虾青素和总类胡萝卜素的生成和类胡萝卜素分布。与菌株22（参见图5）相比，crtZ的 RBS变体（菌株2'2，参见图5）同时增加了虾青素细胞含量（4,800至7,700 ppm，图8b）和纯度（图8c）的总类胡萝卜素的30％至90％（参见图8c），但crtW的 RBS变体 菌株22'）却降低了虾青素（4,800至3,300 ppm）和总类胡萝卜素含量（16,000至10,000 ppm）。综上，菌种22’远优于其他菌种，其虾青素产量达到7660 ppm，并且副产物低，虾青素含量占整体类胡萝卜素的90%左右。
局部精细微调（酮化和羟基化步骤）进一步优化虾青素产量（参见图9和图1）。首先，为基因crtZ和crtW设计了RBS库，分别覆盖RBS相对强度的50倍和140倍范围（图11）和预测的RBS强度显示在图3b和图3c。然后用crtZ或crtW的单个RBS文库，或两个RBS文库同时优化了虾青素产量。高产虾青素细胞（红色）与亲本β-胡萝卜素细胞（黄色）颜色不同，因此可以通过颜色来筛选高产虾青素细胞。从文库I中选出11个红色菌落和1个黄色菌落（作为对照菌种1，Z2），来自文库III的12个红色菌落和11个红色菌落和1个黄色菌落（作为对照菌种2，ZW12）菌落。在选择的36个菌株（菌落）中，丢弃了18个（Z4-12和W4-12），因为它们的培养物或呈黄色（表明它们主要积累了β-胡萝卜素，玉米黄质或其混合物）或颜色很低（表明它们的总类胡萝卜素产量低）。其余18菌落包含以虾青素为主要成分的13个菌株（ZW1-8，ZW11，Z1和W1-3），3个菌株（ZW12，Z2和Z3）主要积累了β-胡萝卜素， ZW9和ZW10而主要生产了虾青素和β-胡萝卜素（图12a）。尽管原因未知，各菌落所产生的总类胡萝卜素有着大幅度地变化，其中菌株Z1虾青素产量最高（约10,000 ppm）。虾青素的胞内含量与crtZ或crtW的翻译速率之间没有简单的相关性（图12b，图12c）。因此，通过数学建模来预测β-胡萝卜素酮醇酶和羟化酶的最佳表达比例是非常困难的。
实施例4：
本发明的方法同样适用于其他普通的无色化合物，我们选择一个倍半萜（橙花叔醇Nerolidol）和一个单萜（芳樟醇Linalool）作为例子。橙花叔醇是一种香料广泛用于各种化妆品（例如洗发水和香水）和非化妆品（例如洗涤剂和家用清洁剂）。而且，最近的研究表明橙花叔醇还具有许多药理和生物活性（抗氧化，抗微生物，抗生物膜，抗寄生和抗炎等）。芳樟醇是另一种重要的香料，应用到在绝大多数化妆品（沐浴露，洗发水和肥皂等），还具有镇静，抗焦虑和止痛作用等生物活性。
从杨树菇（Agrocybe aegerita）的基因组里发现了一种新型高效的双功能橙花叔醇/芳樟醇合酶（nls基因）。基因nls被克隆到两个***中，一个与大肠杆菌的ispA基因组成NA模块用来生产橙花叔醇），另一个与Abies grandis的GPPS基因组成NG模块一起生产芳樟醇。简单来说，三个模块由三个不同的启动子（TM1，TM2和TM3）控制。同时，nls和ispA（或GPPS）由3种不同的RBS调节。因此，共计有35 = 243个组合（参见图16a）。作为一个概念证明，我们各挑选了53个的菌落再加上一个对照菌株（16b中的Nel27和图16c中的Lin27）。在对照菌株中，所有三个模块都采用TM1启动子来控制，并且基因nls和ispA （或GPPS）选择最强RBS-8调节）。在筛选的53个菌株中，其中一个Ner3菌株在24小时内生产了323 mg/L的橙花叔醇（摇瓶数据），是对照菌株Nel27产量的（36 mg/L，图8b）近10倍。类似地，MCA方法使得芳樟醇产量（摇瓶数据）增加了28倍（从对照菌株Lin27的2mg/L到菌株Lin2中的65mg/L），参见图16c。作为对比，这里得到芳樟醇的产量是目前报道的产量的684倍（Amiri, P.,Shahpiri, A., Asadollahi, M.A., Momenbeik, F. & Partow, S. Metabolicengineering of Saccharomyces cerevisiae for linalool production. BiotechnolLett. 38, 503-508 (2016).）。
在本发明的实施例中，使用的宿主细胞为大肠杆菌K12 MG1655 ΔrecAΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3 and Bl21-Gold DE3（Stratagene）。通过PCR从酿酒酵母的基因组扩增基因hmgS，hmgR，mevK，pmk和pmk（或MVD1）。从大肠杆菌MG1655基因组扩增出基因atoB和idi。将所有基因克隆并得到两个质粒p15A-spec-hmgS-atoB-hmgR（L2-8）和p15A-cam-mevK-pmk-pmd-idi（L2-5）中。将从pAC-LYC质粒（Zhang, C. et al. Combining genotypeimprovement and statistical media optimization for isoprenoid production inE. coli. PLoS ONE 8, e75164 (2013)）扩增的番茄红素生物合成的三个基因（crtEBI）导入并得到p15A-kan-crtEBI-ispA质粒。来自Pantoea ananatis LMG20103的两个crtY基因（番茄红素合酶）和来自未培养的海洋细菌HF10_19P19的一个crtY基因（番茄红素合酶）被密码子优化并克隆到质粒pET11a和p15A-amp中，形成β-胡萝卜素质粒pET11a-crtY或p15A-amp-crtY。随后，我们将两个不同的crtZ基因（来自Sulfolobus solfataricus P2和Pantoea ananatis LMG20103）和crtW基因（来自鱼腥藻Anabaena variabilis ATCC 29413和Brevundimonas sp. SD212）以四种组合***到β-胡萝卜素质粒中，得到质粒pET11a-crtYZW和p15A-amp-crtYZW。p15A系列质粒通过变体p15的复制起点（Selzer, G., Som,T., Itoh, T. & Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A andcomparative studies on the nucleotide sequences around the origin of relatedplasmids. Cell 32, 119-129 (1983).）衍生自pAC-LCY质粒，使质粒彼此相容。并通过比较10代后每个质粒的拷贝数来检查质粒的相容性。来自不同宿主的crtY，crtZ和crtW的序列列于图13a和图13b中。所用的硫代磷酸化引物及其序列列于图14中。本发明使用的菌株和质粒总结在图15。
启动子变体。为了变体T7启动子并构建启动子库，我们设计了通过改进的交叉体外装配方法构建多基因质粒的标准化模块化DNA片段（Zou, R., Zhou, K.,Stephanopoulos, G. & Too, H.-P. Combinatorial Engineering of 1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Pathway Using Cross-Lapping In Vitro Assembly (CLIVA)Method. PLoS ONE 8, e79557 (2013).）。改进的CLIVA方法比大多数现有方法更强大和更简单克隆方法，特别是对于多个组件（目前到12个）具有非常高的准确性，因此是构建组合库的理想选择。用于构建T7启动子变体文库的引物是简并寡核苷酸I-T7P_lib-F和I-T7P_lib-R。具体来讲，随后转化所产生的启动子（质粒）文库，并将其铺在含有适当抗生素的LB琼脂平板上。挑取二十至三十个菌落，并在培养基中培养。每个菌落表达的eGFP的荧光信号与测序后的启动子序列相关。通过表征启动子强度后，我们得到了启动子库含有一系列不同强度的启动子，并选择了三个T7启动子变体TM1，TM2和TM3，其相对强度分别为强、中和弱。三种T7启动子变体与天然T7启动子的相对转录效率由eGFP的荧光信号表征。
RBS变体。与启动子文库类似，我们使用退行性引物I-RBSlib-crtZ2-F和I-RBSlib-crtZ2-R，I-RBSlib-crtW2-F和I-RBSlib-crtW2-F R为crtZ和crtW分别设计了RBS库。RBS设计和预测值是基于网站工具RBS Calculator 2.0版(https://salislab.net/software/ 55）。图17a和图17b列出了crtZ和crtW的RBS库的预测翻译效率。与启动子实验不同，我们没有通过实验校准RBS效率。相反，我们用板上群落的集合来产生具有不同RBS的质粒混合物，然后我们将质粒混合物转化到细胞。基于菌落的颜色强度，我们选择了生产量高的菌落，并以低产量的菌落作为对照。对于nls和GPPS（或ispA）的RBS组合的生成，我们使用荧光活化细胞分类计（FACS）来预先量化的RBS（图17b的RBS-4, 6和8）。
启动子和RBS同步变体。首先，我们克隆了一个具有不同启动子的质粒库（第一轮）。 之后，我们以第一轮质粒库作为模板，用预量化的RBS库来变体橙花叔醇/芳樟醇合酶（nls）和ispA或GPPS的现有RBS，得到第二轮质粒库。因此，第二轮质粒库同时包含不同的启动子和不同的RBS，并以第二轮质粒库用于后续的MCA筛选实验。
本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明所作的举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明说明书的内容或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (16)

1.一种生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：将人工调控组件导入宿主细胞，每个所述宿主细胞内存在一个或者多个、一种或多种人工调控组件，所述人工调控组件包括载体、启动子、5’非翻译区和编码模块，所述编码模块可操作地连接于人工调控组件，所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块、crtY模块、crtY-crtZ-crtW模块、ispA-nls模块或者GPPS-nls模块。
2.根据权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述5’非翻译区包括核糖体结合位点（RBS）。
3.根据权利要求2所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：通过载体或启动子或两者组合来控制来进行全局调控，通过所述核糖体结合位点（RBS）或酶变体或两者组合来优化进行局部调控。
4.根据权利要求3所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述全局调控为对整个生物合成途径的所有酶的调控，对所有酶进行分组模块化以减少组合数量，每个模块都通过量化的载体或启动子或两者组合来控制。
5.根据权利要求4所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：在所述全局调控的基础上，所述局部调控是对整体生物***效率的进一步提升，模块分组可能导致单个或几个模块成为整体生物***的瓶颈，而所述全局调控无法实现瓶颈模块的内部优化，因此，采用不同强度的5’非翻译区或不同活性的酶变体或两者组合来实现瓶颈模块的局部优化。
6.根据权利要求3或4所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述全局调控和所述局部调控可同步也可以分步进行。
7.根据权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌。
8.根据权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述载体为pBR322 或 p15A或pMB1 或ColE1或pSC101或它们的变体。
9.根据权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述启动子为T7、TM1-255。
10.根据权利要求2所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述核糖体结合位点（RBS）为RZ1-4、RW1-4、RLZ1-36、RLW1-54或RBS2-10。
11.如权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法所制造的生产高价值天然产物的工程菌，其特征在于：所述crtY-crtZ-crtW模块中的crtZ的RBS为RZ1-4或RLZ1-RLZ36的其中之一，所述crtY-crtZ-crtW模块中的crtW为RW1-4或RLW1-RLW54的其中之一。
12.如权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法所制造的生产高价值天然产物的工程菌，其特征在于：所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块和/或crtY-crtZ-crtW模块，用于生产虾青素。
13.如权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法所制造的生产高价值天然产物的工程菌，其特征在于：所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块和/或crtE-crtB-crtI-ispA模块，用于生产番茄红素。
14.如权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法所制造的生产高价值天然产物的工程菌，其特征在于：所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA和/或crtY模块，用于生产胡萝卜素。
15.如权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法所制造的生产高价值天然产物的工程菌，其特征在于：所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块和/或ispA-nls模块，用于生产橙花叔醇。
16.如权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法所制造的生产高价值天然产物的工程菌，其特征在于：包括所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块和/或GPPS-nls模块，用于生产芳樟醇。
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