CN108285454A - 一种含氨基酸的Fe3+荧光探针及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于荧光探针材料及其制备领域，具体涉及一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针及其合成方法，其结构式如图所示，包括灵敏度高，光稳定性好，荧光量子产率高，波长长的罗丹明荧光团，水溶性好的丝氨酸，一定量的罗丹明内酰胺与丝氨酸在一定条件下发生缩合反应得到特殊结构的含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，合成过程原料简单易得、反应条件温和、操作简单，同时所得罗丹明荧光探针能够在水环境下快速检测生物细胞内Fe³⁺，对Fe³⁺的结合属于配位型识别，具有可逆性。

Description

一种含氨基酸的Fe3+荧光探针及其合成方法

技术领域

本发明属于荧光探针材料及其制备领域，具体涉及一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针及其合成方法。

背景技术

人体中含有丰富的铁元素，平均每个成年人约含有3-5g，在整个细胞中的浓度约为50-100μΜ(Epsztejn,S.,Glickstein,H.,Picard,V.,Slotki,I.N.,Breuer,W.,Beaumont,C.,Cabantchik,Z.I.H-ferritin subunit overexpression in erythroidcells reduces the oxidative stress response and induces multidrug resistancepropertie[J].Blood 1999,94(10),3593-3603)。人体中大多细胞进程中都涉及到铁元素，如新陈代谢，电子转移和DNA的合成。通常铁元素在人体以两种离子形式存在即Fe²⁺和Fe³⁺，在细胞生理过程中两种离子会处于一定的平衡状态。因此必须控制好细胞中铁的含量，分布和铁离子形式，若人体中正常的铁元素运行遭到破坏，便会引起身体的失衡，如贫血，血色沉着病和老年痴呆症，因此对铁离子的检测具有重要意义。

目前检测铁元素的主要方法有：原子吸收光谱法，等离子体感应光谱法，电感耦合等离子发射光谱法，电感耦合等离子质谱法，电化学传感等，但是这些方法存在仪器昂贵，专业性强，耗时，对样品具有破坏性同时也会造成检测物的损失。

可见早期检测铁离子的方法缺乏而且影响其生物功能，而荧光探针是极具吸引力的工具，能够肉眼直接观察到不稳定铁离子的分布和物种形成。然而由于铁具有顺磁性，会引起荧光的猝灭，因此早期的荧光探针多是猝灭型，并且同时检测铁元素的两种离子状态，固对检测的选择性和灵敏度有很大的影响。因此近年来利用罗丹明off-on机理设计合成的罗丹明类荧光探针能够很好地选择性检测Fe²⁺或Fe³⁺。

Hirayama等人(Hirayama,T.,Okuda,K.,Nagasawa,H.A highly selective turn-on fluorescent probe for iron(II)to visualize labile iron in living cells[J].Chem.Sci.2013,4(3),1250-1256.)合成了一种与Fe²⁺进行反应的罗丹明基荧光探针，其原理为Fe²⁺将探针上N-O-基团分解，还原为叔氨基团。当细胞中存在Fe³⁺时，此反应不会进行，因此需用螯合剂处理细胞。尽管探针能够作为活体细胞的荧光成像选择性地识别Fe²⁺，但是其检测机理并不会显示出可逆性，从而限制了探针检测流动下不稳定的能力Fe²⁺。

Yang等人(Han OuYang,Yong Gao,Yaofeng Yuan.A highly selectiverhodamine-based optical-electrochemical multichannel chemosensor for Fe³⁺[J].Tetrahedron Letters,2013,54,2964-2966.)利用罗丹明内酰胺与二茂铁甲酰氯反应合成荧光探针，此探针在CH₃CN-H₂O(1:1,v/v)溶液中对Fe³⁺具有很好的选择性，除了Cr³⁺,Fe²⁺,Hg²⁺和Cu²⁺有干扰外，溶液出现明显的从无色变为红色，560nm处的紫外吸收增强，583nm处的荧光强度增强，往溶液中加入EDTA后可明显见到溶液由红色变为无色，这说明探针具有可逆性。但是此探针需在50％的CH₃CN水溶液中才能溶解，对细胞具有一定毒性。

专利号CN201310409868.2公开了一种新型罗丹明类荧光探针，属于功能材料领域。本发明的荧光探针以罗丹明B(RhB)为原料，用二元胺修饰改性RhB制备罗丹明内酰胺，进而与马来酸酐(MAH)和金刚烷胺反应，制备得到罗丹明类荧光探针，其结构中含有可与金属离子发生作用的多个胺基功能团和可与Hg²⁺作用的碳碳双键。螺旋状罗丹明内酰胺化合物在与重金属粒子结合后，内酰胺氮原子的质子化将导致氮原子电荷密度减少，从而引发螺旋中心C-N键的开裂，产生荧光变化和颜色变化。本发明所得的罗丹明衍生物对水溶液中汞离子和铁离子都具有较好的识别能力，对铁离子检测极限达到8.3ppm，对汞离子检测极限高达4.7ppm，因此所述的探针不具有专一性，检测铁离子时易受汞离子的影响或检测汞离子时易受铁离子的影响。

因此为了克服分析仪器昂贵、专业性强、耗时、对样品具有破坏性等问题和目前荧光探针具有不可逆性，专一性差，水溶性差等问题，设计合成一种具有可逆性，水溶性好，抗干扰能力强的新型荧光探针具有重要的意义。

发明内容

为了解决上述仪器昂贵、专业性强、耗时、对样品具有破坏性等问题和目前荧光探针存在的不可逆性、专一性差、水溶性差等问题，本发明提供一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针及其合成方法。

一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，其结构式如图1所示。

进一步的，含氨基酸的Fe³⁺荧光探针结构式中基团R1、R2、R3、R4为H，或基团R1与R2为CH₃、基团R3与R4为H，或基团R1与R2为C₂H₅、基团R3与R4为H，或基团R1为C₂H₅、基团R2与R3为H、基团R4为CH₃。

进一步的，含氨基酸的Fe³⁺荧光探针结构式中n为0，2，3，...n。

一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，制备上述的含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，其合成方法如下：

步骤一：合成罗丹明内酰胺中间体，称取2-3g罗丹明染料，将其溶于有机溶剂，接着将胺类化合物溶液逐滴加入到罗丹明染料溶液中，加热至50-60℃，回流反应2-7h后得到罗丹明内酰胺中间体；

步骤二：合成含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，称取1-2mmol罗丹明内酰胺，将其溶于有机溶剂，接着将丝氨酸溶液逐滴加入到罗丹明内酰胺溶液中，加热至60-85℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到目标化合物。

进一步的，有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈。

进一步的，罗丹明内酰胺与丝氨酸的摩尔比为1:1.0-1.5。

进一步的，合成目标化合物的反应温度为80℃。

进一步的，柱层析分离纯化溶剂为二氯甲烷与乙醇。

进一步的，柱层析分离纯化溶剂二氯甲烷与乙醇的体积比为160-220:1。

本发明基于罗丹明染料和丝氨酸具有较好的水溶性，设计出一种特殊结构的水溶性含氨基酸的Fe³⁺荧光探针。一定量的罗丹明内酰胺与丝氨酸在一定条件下发生缩合反应得到含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，合成过程原料简单易得、反应条件温和、操作简单，同时所得罗丹明荧光探针能够在水环境下快速检测生物细胞内Fe³⁺，且不受其他金属离子的干扰，具有专一性，对Fe³⁺的结合属于配位型识别，具有可逆性。

附图说明

图1为含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的结构式；

图2为含氨基酸的Fe³⁺荧光探针对金属离子选择性的荧光发射光谱图；

图3为含氨基酸的Fe³⁺荧光探针对3eq的Fe³⁺和5eq其它干扰离子的荧光发射光谱图；

图4为含氨基酸的Fe³⁺荧光探针对不同Fe³⁺浓度的荧光发射光谱图；

图5为含氨基酸的Fe³⁺荧光探针可逆性测试的荧光发射光谱图。

具体实施方式

如图1所示，一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，具体实施方案如下：

实施例一

一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，合成基团R1、R2、R3、R4为H，n为2的罗丹明110Fe³⁺荧光探针。

一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，制备上述的罗丹明110Fe³⁺荧光探针，其合成方法如下：

步骤一：合成罗丹明110内酰胺中间，称取2g罗丹明110染料，将其溶于乙醇溶剂，接着将乙二胺溶液逐滴加入到罗丹明110溶液中，加热至50℃，回流反应6h，反应过程中溶液由枣红色变成橙黄色，得到罗丹明110内酰胺中间体；

步骤二：合成罗丹明110Fe³⁺荧光探针，称取1mmol罗丹明110内酰胺，将其溶于乙醇溶剂，接着将1.2mmol丝氨酸溶液逐滴加入到罗丹明110内酰胺溶液中，加热至80℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到目标化合物，柱层析分离纯化溶剂乙醇与二氯甲烷体积比为1:200。

实施例二

一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，合成基团R1与R2为CH₃、基团R3与R4为H，n为2的四甲基罗丹明Fe³⁺荧光探针。

一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，制备上述的四甲基罗丹明Fe³⁺荧光探针，其合成方法如下：

步骤一：合成四甲基罗丹明内酰胺中间，称取2g四甲基罗丹明染料，将其溶于乙醇溶剂，接着将乙二胺溶液逐滴加入到四甲基罗丹明溶液中，加热至50℃，回流反应6h，反应过程中溶液由枣红色变成橙黄色，得到四甲基罗丹明内酰胺中间体；

步骤二：合成含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，称取1mmol四甲基罗丹明内酰胺，将其溶于乙醇溶剂，接着将1.2mmol丝氨酸溶液逐滴加入到四甲基罗丹明内酰胺溶液中，加热至80℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到目标化合物，柱层析分离纯化溶剂乙醇与二氯甲烷体积比为1:200。

实施例三

一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，合成基团R1与R2为C₂H₅、基团R3与R4为H，n为2的含氨基酸的Fe³⁺荧光探针。

一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，制备上述的罗丹明B Fe³⁺荧光探针，其合成方法如下：

步骤一：合成罗丹明B内酰胺中间，称取2g罗丹明B染料，将其溶于乙醇溶剂，接着将乙二胺溶液逐滴加入到罗丹明B溶液中，加热至50℃，回流反应6h，反应过程中溶液由枣红色变成橙黄色，得到罗丹明B内酰胺中间体；

步骤二：合成含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，称取1mmol罗丹明B内酰胺，将其溶于乙醇溶剂，接着将1.2mmol丝氨酸溶液逐滴加入到罗丹明B内酰胺溶液中，加热至80℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到目标化合物，柱层析分离纯化溶剂乙醇与二氯甲烷体积比为1:200。

实施例四

一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，合成基团R1为C₂H₅、基团R2与R3为H、基团R4为CH₃，n为2的罗丹明6G Fe³⁺荧光探针。

一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，制备上述的罗丹明6G Fe³⁺荧光探针，其合成方法如下：

步骤一：合成罗丹明6G内酰胺中间，称取2g罗丹明6G染料，将其溶于乙醇溶剂，接着将乙二胺溶液逐滴加入到罗丹明6G溶液中，加热至50℃，回流反应6h，反应过程中溶液由枣红色变成橙黄色，得到罗丹明6G内酰胺中间体；

步骤二：合成含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，称取1mmol罗丹明6G内酰胺，将其溶于乙醇溶剂，接着将1.2mmol丝氨酸溶液逐滴加入到罗丹明6G内酰胺溶液中，加热至80℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到目标化合物，柱层析分离纯化溶剂乙醇与二氯甲烷体积比为1:200。

实施例五

如图2所示，往探针溶液中分别加入5倍当量的K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺离子时，探针溶液为无色，在580nm处荧光强度也没有发生变化，可见探针保持原来的结构，能够稳定存在于这些溶液体系中。当探针溶液中加入Fe³⁺后，溶液由无色变为红色，在580nm处荧光强度明显增强，出现一个强的发射峰。这是由于Fe³⁺与探针反应使得罗丹明的螺环打开，产生荧光发射。

实施例六

如图3所示，以最大发射峰位置的荧光强度为纵坐标，金属离子为横坐标，首先往探针溶液中分别加入5倍当量的干扰离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺)，再加入3倍当量的Fe³⁺，溶液从无色状态马上变为红色，测试其荧光强度，由图可知，在其他干扰离子的存在下，探针对Fe³⁺仍具有很好的识别能力。

实施例七

如图4所示，配制15份5mL的5μM探针溶液，分别加入0-240μM的铁离子，进行荧光检测(λ_Ex＝520nm)，计算各体系中荧光强度，通过分析580nm处的荧光强度与Fe³⁺浓度的关系，评估探针对Fe³⁺的响应性能，由图可知随着Fe³⁺浓度的增大，溶液的荧光强度逐渐增强，直到最大发射强度不在变化，探针在Fe³⁺浓度5×10^-6mol/L～6×10^-5mol/L范围内呈线性关系，线性相关系数为R²＝0.9958，而且探针对Fe³⁺的检测限为1.29×10^-7mol/L。

实施例八

如图5所示，固定探针浓度10μM，加入2eq的Fe³⁺溶液溶液由无色变为红色，580nm处的荧光强度明显增强，显示探针对Fe³⁺响应，继续加入5eq的EDTA溶液荧光强度减弱，这是由于EDTA与Fe³⁺络合，夺走了部分与探针络合的Fe³⁺，继续加入2eq的Fe³⁺后，体系的荧光强度又增强，表明探针与Fe³⁺的结合是属于配位型识别，而且具有可逆性。

上述仅为本发明的优选具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (9)

1.一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，其特征在于：含氨基酸的Fe³⁺荧光探针结构式如下所示：

2.根据权利要求1所述含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，其特征在于：所述含氨基酸的Fe³⁺荧光探针结构式中基团R1、R2、R3、R4为H，或基团R1与R2为CH₃、基团R3与R4为H，或基团R1与R2为C₂H₅、基团R3与R4为H，或基团R1为C₂H₅、基团R2与R3为H、基团R4为CH₃。

3.根据权利要求1所述含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，其特征在于：所述含氨基酸的Fe³⁺荧光探针结构式中n为0，2，3，...n。

4.一种含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：制备权利要求1所述的含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，其合成方法如下：

步骤一：合成罗丹明内酰胺中间体，称取2-3g罗丹明染料，将其溶于有机溶剂，接着将胺类化合物溶液逐滴加入到罗丹明染料溶液中，加热至50-60℃，回流反应2-7h后得到罗丹明内酰胺中间体；

步骤二：合成含氨基酸的Fe³⁺荧光探针，称取1-2mmol罗丹明内酰胺，将其溶于有机溶剂，接着将丝氨酸溶液逐滴加入到罗丹明内酰胺溶液中，加热至60-85℃，回流，薄层层析跟踪至反应结束，反应结束后通过柱层析分离纯化得到目标化合物。

5.根据权利要求4所述含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈。

6.根据权利要求4所述含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述罗丹明内酰胺与丝氨酸的摩尔比为1:1.0-1.5。

7.根据权利要求4所述含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述合成目标化合物的反应温度为80℃。

8.根据权利要求4所述含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述柱层析分离纯化溶剂为二氯甲烷与乙醇。

9.根据权利要求4所述含氨基酸的Fe³⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：所述柱层析分离纯化溶剂二氯甲烷与乙醇的体积比为160-220:1。