CN108250297B

CN108250297B - 抗egfr抗体、其制法及其应用

Info

Publication number: CN108250297B
Application number: CN201810063905.1A
Authority: CN
Inventors: 瞿爱东; 祝婧烨; 郭锦林; 黄海武; 吴丽娜; 陆瑾; 陈家琪; 邱建华; 徐帆洪; 李翱翔; 粱红远
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date: 2018-01-23
Filing date: 2018-01-23
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2038-01-23
Also published as: CN108250297A

Abstract

本发明涉及抗EGFR抗体、其制法及其应用。本发明提供了含有独特的互补决定区的蛋白，其能与EGFR特异性结合并有效抑制EGFR的功能，缓解或治疗EGFR过表达相关的疾病，如肿瘤。

Description

抗EGFR抗体、其制法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及抗EGFR抗体、其制法及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体(The epidermal growth factor receptor，EGFR，erbB1,HER1)是HER/ErbB受体家族的四个成员之一，属于酪氨酸激酶生长因子受体。EGFR是一个分子量为170KD的跨膜糖蛋白，主要由参与配体结合的胞外区、跨膜区和具有酪氨酸激酶活性的胞内区三部分构成。EGFR的最主要配体是表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和转化生长因子α(transforming growth factor-α，TGF-α)，EGFR与配体结合后，发生同源或异源二聚化，导致EGFR胞内酪氨酸激酶活性区发生磷酸化，并将细胞信号传递下去，进而导致细胞的增殖与分化、细胞凋亡的下降、血管再生、肿瘤侵袭转移等。

研究表明在许多实体肿瘤，如非小泡细胞肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、头颈癌、食道癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤等(Woodburn JR，Pharmacol Ther 1999；82:241-50；Yarden Y，Eur J Cancer 2001；37:S3-S8；Mendelsohn J等，Oncogene 2000；19:6550-65)中存在EGFR的高表达或异常表达，EGFR信号通路发生异常的可能机制有：EGFR的过表达；EGFR突变；自分泌环的作用增强；配体表达的增加；受体下调机制的破坏；异常信号转导通路的激活等(Roza Zandi等，Cellular Signalling,2007,19:2013-2023)。

目前，靶向EGFR治疗的药物主要有两类：①针对EGFR胞外域部分的单克隆抗体，如Cetuximab(IMC-225，Erbitux)、Matuzumab(EMD72000)、Panitumumab(ABX-EGF)和IMC-11F8，可阻断配体分子对EGFR的激活或干扰EGFR二聚化的形成；②针对EGFR激酶区的小分子激酶活性抑制剂，如Gefitinib(Iressa)、Erlotinib(Tarceva)和Sorafenib(Nexavar)，作为ATP的类似物竞争结合于EGFR的TK区，抑制EGFR信号通路的转导。

目前已经有许多靶向EGFR的抗体已经进入了临床实验阶段或已经应用到了临床治疗上，但目前不同抗体的适应症却存在差异，如Cetuximab与Panitumumab单抗目前仅应用在结肠癌、头颈癌、肺癌等几种有限的癌症中。

考虑到其他更多的EGFR的高表达或异常表达的实体肿瘤的治疗需求，本领域有必要开发出更多的EGFR抗体来满足这种需要。

发明内容

本发明的目的在于提供抗EGFR抗体、其制法及其应用。

在本发明的第一方面，提供特异性结合EGFR的结合蛋白，该结合蛋白具有轻链可变区和重链可变区，且，其重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；其轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；或

其重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；其轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。

在一个优选例中，所述的结合蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，其轻链可变区的氨基酸序列如28所示；或其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。

在另一优选例中，所述的结合蛋白是单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供编码所述的特异性结合EGFR的结合蛋白的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的多核苷酸的重链可变区的CDR1的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；或

其重链可变区的CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；其轻链可变区的CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

在另一优选例中，所述的多核苷酸的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；或其重链可变区的核苷酸序列如SEQID NO:29所示，其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，其包含所述的表达载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种结合蛋白组合物，所述的组合物含有结合蛋白1和结合蛋白2，该结合蛋白1具有轻链可变区和重链可变区，且其重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQID NO:9所示；其轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；该结合蛋白2具有轻链可变区和重链可变区，且其重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；其轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。

在一个优选例中，所述的结合蛋白1和结合蛋白2以1：10～10：1的比例存在于组合物中；较佳地，以1：5～5：1的比例存在于组合物中；例如还可以是1：4～4：1的比例，1：3～3：1的比例，1：2～2：1的比例。

在本发明的另一方面，提供所述的特异性结合EGFR的结合蛋白或所述的结合蛋白组合物在制备用于诊断、治疗和/或预防EGFR过表达相关疾病的药物中的用途。

在一个优选例中，所述的EGFR过表达相关疾病是：存在EGFR过表达的实体肿瘤。

在另一优选例中，所述的实体肿瘤包括：非小泡细胞肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、头颈癌、食道癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物含有：有效量的所述的特异性结合EGFR的结合蛋白；和药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物含有：有效量的所述的结合蛋白组合物，和药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗和/或预防EGFR过表达相关疾病的药盒，该药盒中包括：所述的特异性结合EGFR的结合蛋白；所述的结合蛋白组合物；或所述的药物组合物。

在本发明的另一方面，提供一种免疫辍合物，所述的免疫辍合物包括：所述的特异性结合EGFR的结合蛋白；以及可检测标记物；较佳地，所述可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测EGFR水平的检测试剂盒，该检测试剂盒中包括：所述的特异性结合EGFR的结合蛋白；或所述的免疫辍合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、EGFR单抗FACS结果。图中所示：鼠源抗体Mab79、Mab87流式细胞术结果。黑色表示对照组，绿色线表示抗体组，M1表示对照组荧光偏移量，M2表示抗体实验组荧光偏移量。

图2、EGFR抗体Mab79、Mab87及西妥昔体外对A431细胞增殖抑制作用。

图3、A431移植肿瘤模型试验。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种含有独特的互补决定区(CDR区)的特异性结合表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)的结合蛋白，其能与EGFR特异性结合并有效抑制EGFR，可以应用于治疗与EGFR过表达相关或者是受到EGFR功能影响的疾病。

不同的抗体具有的不同特性如结合抗原表位、亲和力、抗体类型等，往往会导致不同的直接或间接抑制EGFR下游信号转导的效应，这正是本发明的出发点。本发明人致力于寻找靶向EGFR新表位的单克隆抗体，本发明的单抗表位在与配体结合相关的EGFR第Ⅲ结构域，并且有别于现有的其他单抗。鼠抗Mab87表位位点：N 389、N 420、T 422，鼠抗Mab79表位位点:F 352、R 353、G 354、F 357、H 359、L 363、W 386。

本发明人还意外地发现，本发明的Mab79与Mab87联合应用，与单用相比，能够呈现协同增效的效果，对于抑制肿瘤的效果更为明显。

结合蛋白

本发明提供了能特异性结合EGFR的结合蛋白。本发明的结合蛋白可以是完整的免疫球蛋白分子，也可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab’)₂片段、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、结构域抗体，二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体等。

CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列。本发明所述的结合蛋白可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个CDR区。优选地，本发明所述的结合蛋白包含本文揭示的至少两个CDR。

本发明的另一方面包括本文所述结合蛋白的功能变体。如果变体能与亲代结合蛋白竞争特异性结合EGFR，则认为该变体分子是本发明结合蛋白的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合或其片段。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合蛋白中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合蛋白的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合蛋白的结合特性，即所述结合蛋白仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者***，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、***或者缺失而不消除免疫学活性的指导。

功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合蛋白相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合EGFR或其片段。例如，本发明的功能变体与亲代结合蛋白相比对于EGFR或其片段可具有增加或降低(优选增加)的结合亲和性。优选地，可变区包括但不限于构架区、高变区或CDR区的氨基酸序列被修饰。通常，轻链和重链可变区包含三个高变区，包括三个CDR，以及更保守的区域，即所谓的构架区(FR)。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合蛋白具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合蛋白或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。

作为本发明的优选方式，所述的结合蛋白是单克隆抗体。抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(CDR)，所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。本发明的抗EGFR单克隆抗体的CDR区是全新的，不同于现有的抗EGFR抗体。

本发明的结合蛋白也可以是与IgG Fc相融合后的蛋白。

本发明另一方面提供了编码本发明的至少一种结合蛋白、其功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆，例如用于如上述的亲和力成熟方法中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。DNA分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合蛋白的序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。在所述表达载体中分别***抗EGFR的鼠源单克隆抗体重链可变区(VH)与人源单抗重链恒定区(来自人源IgG1的恒定区)融合序列和抗EGFR的鼠源单克隆抗体轻链可变区VL与人源单抗轻链恒定区(来自人源Iglambda的恒定区)融合序列。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS7、NSO或Bowes黑素瘤细胞等。特别适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞，如CHO细胞、293细胞。

如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的结合蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

药物组合物

本发明的结合分子可用于制备诊断、治疗和/或预防EGFR表达或活性失调相关疾病的药物组合物。

所述的“EGFR过表达相关疾病”包括存在EGFR过表达的实体肿瘤。较佳地，所述的“EGFR过表达相关疾病”包括但不限于：非小泡细胞肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、头颈癌、食道癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤。

所述EGFR单抗还可用于检测和定量EGFR，以用于各种诊断目的。

基于本发明的新发现，还提供了一种可诊断、治疗和/或预防EGFR过表达相关疾病的药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的结合分子；以及药学上可接受的载体。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如

润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

本发明的结合分子可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分子可以单独应用或者于包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。

本发明的结合分子或药物组合在用于人体之前可以在合适的动物模型***中检测。这种动物模型***包括但不限于小鼠、猴。

本发明的结合分子的合适的剂量范围可例如是0.001-100mg/kg体重，优选0.01-15mg/kg体重。此外，例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以以与本发明的结合分子相似的给药方案给予。如果单独给予其它分子，则可以在给予本发明的一或多种结合分子或药物组合物之前、同时或者之后给予患者。对于人患者的精确给药方案通常在临床实验期间挑选出。

本发明所述的结合分子可被置于适当的包装中，制成药盒，以便于临床医师使用。较佳地，所述的药盒中也可包含说明如何给药的使用说明书。

本发明还包括缓解或治疗EGFR过表达相关疾病的方法，所述方法包括给予患者有效量的本发明的至少一种单克隆抗体。当用于抗肿瘤治疗时，还可以将本发明的单克隆抗体与其它抗肿瘤的药剂或疗法(如化疗制剂或放疗方法)联合应用。

免疫缀合物

另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含本文所述至少一个结合蛋白以及进一步包含至少一个功能性分子(如可检测的部分/物质的分子)。所述抗体与所述功能性分子可以通过共价连接、偶联、附着、交联等方式构成辍合物。本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。所述标记也可以通过共价键与本发明的结合蛋白直接结合/缀合。或者，所述标记可以通过一或多种连接化合物与所述结合蛋白结合/缀合。标记与结合蛋白的缀合技术为本领域技术人员所熟知。本发明的免疫缀合物的标记也可以是治疗剂。

所述免疫缀合物可包含：本发明的抗体以及可检测标记物。所述的可检测标记物包括但不限于：荧光标记物、显色标记物；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

此外，本发明的人结合蛋白或者免疫缀合物也可以附着于固体支持物上，其特别用于EGFR蛋白或其片段的体外免疫测定或者纯化。这种固体支持物可以是多孔或者无孔的、平面或非平面的。本发明的结合蛋白可以与标记序列融合以便于纯化。所述标记序列的例子包括但不限于六组氨酸标记、血凝素(HA)标记、myc标记或者flag标记。或者，一种抗体可以与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)。

检测试剂和试剂盒

以本发明所述的结合分子为基础，可制备方便、快速且准确地检测待测样品中EGFR水平的试剂或试剂盒。

如本文所用，术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。

因此，本发明提供了一种用于检测待测样品中EGFR水平的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的EGFR结合分子，或EGFR结合分子与可检测标记物构成的免疫缀合物。

在获得了本发明提供的EGFR结合分子后，可以方便地制备出用于特异性检测EGFR水平的检测试剂盒。

为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的结合分子或含有EGFR结合分子与可检测标记物构成的免疫缀合物以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的结合分子作为识别EGFR的试剂。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

在获得了本发明提供的结合分子和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中EGFR或其含量，从而得知待测样品的供体是否存在EGFR过表达相关疾病。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(例如可参考通常按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》中所述的条件、或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、EGFR鼠源单克隆抗体的制备

一、EGFR单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备

1、免疫原

免疫原为EGFR胞外区全长(EGFR-ECD)，通过CHO/dhfr^-细胞(购自ATCC)稳转表达，纯化细胞培养上清得到。

2、免疫Balb/c小鼠

Balb/c小鼠购自上海斯莱克试验动物有限责任公司，所有免疫用Balb/c小鼠均为3周龄、雌性、标准化无病、健康的纯种小鼠，符合美国FDA标准。

3、Balb/c小鼠免疫方法

第一次免疫：将50μg(250μl)抗原与250μlMF59佐剂混匀，配置成500μl溶液，注射于Balb/c小鼠皮下多点及足掌。第二次免疫：距第一次免疫间隔三周后，同法同剂量进行第二次免疫。第三、四次免疫：距第二次免疫间隔二周后，同法同剂量进行第三、四次免疫。四次免疫后小鼠尾静脉采血，采用常规酶联免疫吸附实验(ELISA法)测定血清抗体滴度，待血清滴度>10⁵以上时，准备做细胞融合。细胞融合前三天进行加强免疫：小鼠尾静脉注射抗原20μg(100μl)。

4、细胞融合

Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞购自美国ATCC公司。

(1)融合前一天换液，使Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞保持良好生长状态。

(2)脾细胞：取免疫小鼠，放血，断颈猝死，于75％酒精浸泡3-4min。无菌条件下取出小鼠脾脏，放入15ml离心管中，加入少许无血清RPM 1640培养液，用移液管轻轻吹打，碾碎，直至没有组织结块、细胞均匀为止。然后，用无血清RPM1640培养液洗涤小鼠脾脏细胞三次，计数备用。

(3)取对数生长期的Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞，无血清RPM 1640培养液洗涤三次，计数备用。

(4)将小鼠脾脏细胞和Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞以10：1的比例混合，1500rpm离心7min。洗去上清液，准备融合。

(5)一分钟内缓缓加入1ml PEG(1450)，轻摇90sec；再在2.5min中内加入5ml无血清RPM 1640培养液，最后再加入5ml无血清培液终止反应，静置5min后，1280rpm离心8min，弃去上清，加入常规RPM 1640培养液(含有10％胎牛血清)，制备成细胞悬液。

(6)将上述细胞悬液以每孔2×10⁴个细胞的密度种入96孔板，每孔200μl，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育。培养24h后，更换含有HAT(25×)的常规RPM1640培养液，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续孵育。培养14d后用ELISA法检测各个克隆细胞的上清液筛选EGFR抗体的阳性克隆。

5、细胞筛选与亚克隆

首先使用含有HAT的常规RPM 1640培养液进行培养筛选，培养7d后，改用HT的常规RPM 1640培养液培，进行再次培养筛选。培养14d后，用ELISA方法以各个克隆细胞的上清液筛选EGFR抗体的阳性克隆。采用有限稀释法，将细胞悬液稀释至60个/ml，于96孔板中每孔加100μl(约6个细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释，再接种2排。重复一次。置37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育。每隔2～3天，更换1/2培养液。培养约10d后，选择单个克隆生长的阳性孔进行第二次筛选和亚克隆。连续三次亚克隆后，经ELISA法检测抗体阳性率为100％时确定为稳定表达目的抗体的杂交瘤细胞株，保种建库。

6、鼠源单抗的制备与纯化

提前一周注射液体石蜡，0.5ml/只腹腔注射6周龄以上的Balb/c小鼠，每种杂交瘤细胞注射Balb/c小鼠3只。7天后腹腔注射1～2×10⁶个杂交瘤细胞，隔7～10天取腹水。抗体纯化过程参照GE protein G蛋白柱进行：

(1)腹水12000rpm离心15min去杂质与上层降脂烷，平衡缓冲液(pH7.0PBS)5倍稀释，用0.45um膜过滤。

(2)protein G柱用ddH₂O平衡柱子5～10柱体积后用平衡缓冲液平衡柱子10个柱体积；

(3)按照1ml protein G胶结合5mg蛋白的载量上样(腹水抗体含量通常为：1～5mg/ml)

(4)用平衡缓冲液液平衡柱子10柱体积；

(5)用洗脱液洗脱(0.1M pH 2.7甘氨酸-HCl)10个柱体积，分管收集，洗脱蛋白迅速按每1ml加入150ul 1M Tris-Cl pH 9.0的比例进行中和。

(6)SDS-PAGE分析洗脱抗体的量和纯度。

实施例2、鼠单抗亲和力测定

采用proteon^TMXPR36 Protein Interaction Array System法测定EGFR单克隆抗体的亲和力。

测定结果显示，Mab79亲和力KD值为：1.2E-09；Mab87亲和力KD值为：1.3E-08。

实施例3、抗EGFR单抗对细胞表面EGFR分子的识别

采用流式细胞术(FACS)进行检测，间接免疫荧光染色法。

(1)计数：取对数生长期的A431细胞，调整单细胞悬液浓度为2×10⁶/ml。

(2)洗涤：取1ml单细胞悬液加入1.5ml离心管中，1000rpm×3min。弃上清，用2％PBA(PBS加2％的胎牛血清)洗涤并重悬细胞，1000rpm×3min，弃上清。

(3)一抗孵育：用2％PBA稀释抗EGFR单抗至10μg/ml，加入200μl，轻轻吹打混匀细胞，4℃冰浴30min。同时做空白对照和鼠IgG单抗同型对照。1000rpm×3min，弃上清。

(4)荧光二抗孵育：用预冷的2％PBA洗涤一次，加入PBA适当稀释的FITC标记羊抗小鼠IgG多抗(1μg/106细胞)200μl。轻轻吹打混匀细胞，4℃避光冰浴30min。

(5)用预冷的2％PBA洗涤2次。将细胞重悬于200μl PBS中，轻轻混匀，置流式管中，避光，用流式检测仪检测。

流式检测的结果如图1所示。

实施例4、EGFR鼠源抗体结合EGFR胞外区表位确定

为了确定抗体的表位，本发明人根据EGFR胞外区的四个结构域，把胞外区分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅰ+Ⅱ、Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+Ⅲ、Ⅲ+Ⅳ、EGFR ECD九段，分别构建与hGH融合表达的pCDNA3.1(+/-)真核表达载体。分别将这九个表达载体进行瞬时转染表达，以鼠抗hGH单抗包板，检测结构域表达水平；以筛选的鼠单抗包ELISA板，检测鼠单抗与EGFR胞外区结构域的结合。结果见表1。

表1 MAb 79与MAb 87结合抗原结构域测定结果

结果显示，抗Mab79和Mab87均靶向在EGFR ECD的Ⅲ+Ⅳ区域。

为进一步确定抗体的表位，通过点突变技术，将EGFR胞外区全长的表达质粒的Ⅲ+Ⅳ区域几个氨基酸突变，完成突变之后，将突变过的表达质粒通过瞬时转染的方式表达，之后用ELISA的方法检测鼠单抗Mab87、Mab79、Cetuximab(西妥昔)及Nimotuzumab(泰欣生)与具有突变的EGFR胞外区结合情况。最终确定4个单抗的表位都在与配体结合相关的EGFR第Ⅲ结构域，但是具体表位有显著不同。本发明的抗Mab87表位位点：N389、N420、T422；抗Mab79表位位点：F 352、R 353、G 354、F 357、H 359、L 363、W 386；西妥昔结合位点：S 418、K 443、I 467、S 468、G 471、N 473、S474；泰欣生结合位点：I 467、S 468、G 471、N 473、S474。

很显然，本发明的抗Mab87和Mab79，特别是Mab87，所针对的表位位点不同于商业生产的单抗。

实施例5、EGFR单抗体外对A431细胞增殖抑制作用

处于对数期生长的A431细胞(人头颈部表皮癌细胞系，购自中国科学院细胞库)，胰酶消化后计数，用含有1％FBS的DF/12培养基调整细胞密度到20000cells/ml，以200ul/孔的量铺到96孔板中，37℃，5％CO₂培养24小时。之后选取96孔板中间的6排8列48个孔，分成4组，每组6个重复。对应加入不同编号单抗及西妥昔单抗，抗体终浓度为5ug/ml。37℃，5％CO₂培养4到5天，之后用Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒(购自同仁化学)检测细胞活性，细胞活性与OD450读数正相关，Mab79、Mab87及西妥昔均能抑制A431细胞生长，结果见图2。

实施例6、EGFR单抗体内对肿瘤生长的抑制作用

10％胎牛血清的DMEM/F12培养液培养A431细胞，待细胞数量足够后用0.25％胰酶(0.02％EDTA)消化，无血清的DMEM/F12培养液洗一遍，再重悬到适度体积的无血清的DMEM/F12培养液中，将2×10⁶/0.1ml的A431细胞接种的裸鼠背部皮下。约7天后能看到明显的肿瘤长出时，将裸鼠随机分为组，每组7只，Mab79、Mab87抗体分别按1mg/只的剂量进行腹腔注射治疗，还设置Mab79及Mab87抗体联合应用组(其中Mab79:Mab87为1:1；也即每次注射时两者各以0.5mg/只注射)，以不相关的同型鼠源单抗TT8D9作对照，每隔三天治疗一次并测量肿瘤体积，治疗持续20天时间。裸鼠肿瘤体积大小：V＝0.5ab²，a为肿瘤实体长直径，b为肿瘤实体短直径。

结果显示，Mab79及Mab87均能有效的抑制A431移植肿瘤的生长，但Mab79的抑制效果显著强于Mab87，这与Mab79所针对的抑瘤相关表位位点比较多相关、亲和力高相关；同时，Mab79及Mab87联合应用的效果显著更为理想的，两者联合应用达到显著的增效效果，详见图3。

实施例7、EGFR单抗可变区编码序列的克隆和鉴定

以实施例1中筛选所得EGFR杂交瘤细胞株cDNA为模板，利用PCR技术，克隆EGFR鼠源单抗可变区基因；经测序，选取无突变无终止密码子的序列，采用5’RACE技术克隆出功能性V_L和V_H基因。

一、EGFR鼠源单抗可变区编码序列的克隆

(一)从杂交瘤细胞株中提取EGFR单抗的总RNA

用上海飞捷生物公司FAST1000试剂盒提取。

(1)取4×10⁵杂交瘤细胞，1000rpm×3min，弃上清。用PBS洗涤一次。将细胞重悬于100μlPBS中，放入离心管内。

(2)加入RB1液1ml，充分颠倒混匀直至完全溶解，室温放置5min。

(3)加入RB2液500μl，充分颠倒混匀1min。将混匀后的液体吸入或直接倒入内套管中离心1min。

(4)弃去外套管中液体，内套管中加入500μl洗液，离心1min，再重复一次。

(5)取出内套管，弃去外套管中液体，仍然套回内套管，不加洗液，离心1min。

(6)将内套管移入新的离心管中，在膜中央加入洗脱液40μl，室温静置1min，获得总RNA。

(二)RT-PCR制备EGFR鼠源单抗cDNA

以总RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，RT-PCR扩增EGFR单抗cDNA。

(三)EGFR鼠源单抗可变区基因的克隆

A、兼并引物的合成

根据抗体信号肽及骨架区基因的保守性，设计并合成以下兼并引物(以下引物中W＝A/T，K＝G/T，R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，S＝C/G，N＝C/G/T，V＝A/C/G)：

(1)轻链上游可变区兼并引物：根据信号肽序列设计(5’-3’)

VLFWD1	GAATTCCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT(SEQ ID NO:33)
		VLFWD2	GAATTCCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG(SEQ ID NO:34)
VLFWD3	GAATTCCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA(SEQ ID NO:35)
		VLFWD4	GAATTCCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT(SEQ ID NO:36)
VLFWD5	GAATTCCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG(SEQ ID NO:37)

根据FR1保守序列设计(5’-3’)

MKac-Fwd GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA

(2)轻链下游兼并引物(5’-3’)

MKac-Rev GGATACAGTTGGTGCAGCATC

(3)重链上游兼并引物：根据信号肽序列设计(5’-3’)

MμIgVHD1	ATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT(SEQ ID NO:38)
		MμIgVHD2	ATGGRCAGRCTTACWTYYTCATTCCT(SEQ ID NO:39)
MμIgVHD3	ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACC(SEQ ID NO:40)
		MμIgVHD4	ATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT(SEQ ID NO:41)
MμIgVHD5	ATGTACTTGGGACTGAGCTGTGTAT(SEQ ID NO:42)
		MμIgVHD6	ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG(SEQ ID NO:43)
MμIgVHD7	ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG(SEQ ID NO:44)

(4)重链上游兼并引物：根据FR1保守序列设计(5’-3’)

MHFR Fwd1	SARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQ ID NO:45)
		MHFR Fwd2	SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQ ID NO:46)
MHFR Fwd3	CAGGTTACTCTGAAAGWGTST(SEQ ID NO:47)
		MHFR Fwd4	GAGGTCCARCTGCAACARTC(SEQ ID NO:48)
MHFR Fwd5	GAGGTCCAACTVCAGCARCC(SEQ ID NO:49)
		MHFR Fwd6	AGAGTGAASSTGGTGGAATC(SEQ ID NO:50)
MHFR Fwd7	GATGTGAACTTGGAAGTGTC(SEQ ID NO:51)

(5)重链下游兼并引物

MHCC-Rev ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQ ID NO:52)

B、可变区基因的克隆

以上述兼并引物和已制备EGFR单抗cDNA为模板，PCR扩增EGFR鼠源单抗可变区基因。

(1)PCR体系和参数设置如下：

PCR参数设置：95℃，预变性，5min；30轮如下循环：95℃变性，0.5min，65℃复性，0.5min，72℃延伸，0.5min；72℃延伸，10min。

(2)用1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，并与DNA分子量标记LD2000判断扩增片段的大小。结果显示：分别有5条兼并引物扩增出轻链可变区基因，有4条兼并引物扩增出重链可变区基因，其大小约为330bp左右，条带单一，与轻/重链可变区基因片段的理论大小基本一致。

采用博大泰克公司的胶回收试剂盒回收330bp处的单抗可变区PCR扩增片段，并连接于pMD18T克隆载体(购自Takara公司)上，转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，将阳性克隆送Invitrogen公司测序验证。

根据NCBI IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)免疫球蛋白基因比对分析结果，筛选出功能性抗体可变区基因，设计抗体轻链和重链可变区下游引物：

采用5’RACE扩增出可变区5’端的序列。最终获得EGFR单抗的功能性可变区基因。

得到的抗体基因序列及对应氨基酸序列如下。其中红色部分表示CDR区。

Mab79重链可变区基因序列(下面的划线部分从前到后依次为：SEQ ID NO:1；SEQID NO:2；SEQ ID NO:3)：

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGTCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGGTTCCGGCTACAAATTCACTGATTATGATATACACTGGGTGAAGCAGAGTCATGCAAAGAGTCTAGAGTGGATTGGAGTTGTTAATACTTTCTCTGATAATATAAACTACAACCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACAGTGACTGTTGACAAATCCTCCAGTACCGCCTATATGGAACTTGGCAGATTGACATCTGAGGATTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGCGG GAATTGGGACTACGGCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:25)

Mab79重链可变区氨基酸序列(下面的划线部分从前到后依次为：SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9)：

QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGSGYKFTDYDIHWVKQSHAKSLEWIGVVNTFSDNINYNQKFKGKATVTVDKSSSTAYMELGRLTSEDSAIYYCASGNWDYGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:26)

Mab79轻链可变区基因序列(下面的划线部分从前到后依次为：SEQ ID NO:4；SEQID NO:5；SEQ ID NO:6)：

GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAGGCCTCCATCTCTTGCACATCTAGTCAGCCCATTATGTATAGTAATGGAAAAATCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGG TCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:27)

Mab79轻链可变区氨基酸序列(下面的划线部分从前到后依次为：SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12)：

DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCTSSQPIMYSNGKIYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHGPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:28)

Mab87重链可变区基因序列(下面的划线部分从前到后依次为：SEQ ID NO:13；SEQID NO:14；SEQ ID NO:15)：

CAGGCGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACTTGCACTGTCTCTGGGTTTTCATTAACCAGCTATAATGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGCTGGTGGAATCACAAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACTGAGCATCAGGAAAGACAACTCCAAAAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTATTGTGCCAGAGTGGG GGGTTACGACGGGGACTGGCTTGCCTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:29)

Mab87重链可变区氨基酸序列(下面的划线部分从前到后依次为：SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)：

QAQLKESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGITNYNSALMSRLSIRKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARVGGYDGDWLAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:30)

Mab87轻链可变区基因序列(下面的划线部分从前到后依次为：SEQ ID NO:16；SEQID NO:17；SEQ ID NO:18)：

GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTAGTCATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAACCACCCAAACTCCTCATCAAATATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAATATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGAGATTCC GTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG(SEQ ID NO:31)

Mab87轻链可变区氨基酸序列(下面的划线部分从前到后依次为：SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24)：

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSHSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:32)

实施例8、EGFR人-鼠嵌合单克隆抗体真核表达载体的构建

利用重叠PCR技术将轻链V_L基因与人Ig的C_L基因进行拼接，构成轻链嵌合基因；轻链5’端引入BamHI限制性内切酶位点，轻链3’端引入EcoRI限制性内切酶位点。同理，构建重链嵌合基因。分别将上述轻链/重链基因***pcDNA3.1(+/-)表达载体(购自Invitrogen公司)的单克隆酶切位点，构建EGFR人-鼠嵌合抗体的表达载体。

(1)按常规方法设计上下游物，利用PCR技术分别于重链/轻链可变区基因5’端引入BamHI单酶切位点，在重链/轻链恒定区基因3’端引入EcoR I单酶切位点。BamHI和EcoRI双酶切重链/轻链嵌合基因，切胶回收目的片段。

(2)pcDNA3.1(+/-)真核表达载体的处理：BamHI和EcoRI双酶切pcDNA3.1(+/-)载体，切胶回收目的片段(～5400bp)。

(3)将(1)中抗体重链/轻链基因分别克隆到(2)中pcDNA3.1(+/-)载体的BamHI和EcoRI位点。

(4)用上述连接产物转化DH5α感受态细胞，小量抽提重组质粒DNA。挑选***目的片段的阳性克隆送上海Invitrogen公司测序鉴定。

经酶切及测序鉴定，验证本发明构建的EGFR单抗重链/轻链的重组表达载体其序列正确。

实施例9、EGFR人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

采用脂质体法将EGFR人-鼠嵌合抗体重链/轻链表达载体共转染CHO/dhfr^-细胞(购自ATCC)，以未转染质粒的空细胞对照。培养48h、72h后，采用常规ELISA法，用HRP标记的羊抗人IgG抗体检测EGFR人-鼠嵌合抗体的表达及嵌合抗体对EGFR抗原的特异性识别，鉴定结果如表3所示。

表3 嵌合抗体的表达

结果显示，共转染表达质粒载体的CHO细胞成功表达嵌合抗体，能有效识别EGFR抗原抗原，而未转染表达质粒的CHO细胞培养上清不能识别EGFR抗原。即瞬时转染CHO成功表达了能特异性识别EGFR抗原的人-鼠嵌合抗体。

同时采用proteon^TMXPR36 Protein Interaction Array System法测定嵌合抗体的亲和力。测定结果显示，79嵌合抗体亲和力KD值为：3.29E-10，87嵌合抗体亲亲和力KD值为：1.25E-09。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海生物制品研究所有限责任公司

<120> 抗EGFR抗体、其制法及其应用

<130> 179977

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggctacaaat tcactgatta tgatatacac 30

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttgttaata ctttctctga taatataaac tacaaccaga agtttaaggg c 51

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggaattggg actacggctt tgcttac 27

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acatctagtc agcccattat gtatagtaat ggaaaaatct atttagaa 48

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaagtttcca accgattttc t 21

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttcaaggtt cacatggtcc gtggacg 27

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr Asp Ile His

1 5 10

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Val Val Asn Thr Phe Ser Asp Asn Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Asn Trp Asp Tyr Gly Phe Ala Tyr

1 5

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Thr Ser Ser Gln Pro Ile Met Tyr Ser Asn Gly Lys Ile Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Phe Gln Gly Ser His Gly Pro Trp Thr

1 5

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gggttttcat taaccagcta taatgtacac 30

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtaatatggg ctggtggaat cacaaattat aattcggctc tcatgtcc 48

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtggggggtt acgacgggga ctggcttgcc tac 33

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agggccagcc aaagtgtcag tacatctagt catagttata tgcac 45

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tatgcatcca acctagaatc t 21

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagcacagtt gggagattcc gtacacg 27

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asn Val His

1 5 10

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser

1 5 10 15

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Val Gly Gly Tyr Asp Gly Asp Trp Leu Ala Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser His Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr

1 5

<210> 25

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caggtccagc tgcagcagtc tgggcctgaa ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg gttccggcta caaattcact gattatgata tacactgggt gaagcagagt 120

catgcaaaga gtctagagtg gattggagtt gttaatactt tctctgataa tataaactac 180

aaccagaagt ttaagggcaa ggccacagtg actgttgaca aatcctccag taccgcctat 240

atggaacttg gcagattgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aagcgggaat 300

tgggactacg gctttgctta ctggggccaa gggaccctgg tcactgtctc tgca 354

<210> 26

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asp Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Val Asn Thr Phe Ser Asp Asn Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Gly Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Asn Trp Asp Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 27

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gatgttttga tgacccaaag tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaggcctcc 60

atctcttgca catctagtca gcccattatg tatagtaatg gaaaaatcta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acatggtccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339

<210> 28

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Pro Ile Met Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Ile Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 29

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

caggcgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acttgcactg tctctgggtt ttcattaacc agctataatg tacactgggt tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatgggctg gtggaatcac aaattataat 180

tcggctctca tgtccagact gagcatcagg aaagacaact ccaaaagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact attgtgccag agtggggggt 300

tacgacgggg actggcttgc ctactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357

<210> 30

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Gln Ala Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Gly Tyr Asp Gly Asp Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 31

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagtc atagttatat gcactggtac 120

caacagaaac cagggcaacc acccaaactc ctcatcaaat atgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caatatccat 240

cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattccgtac 300

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgg 336

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ser His Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gaattcccac catggagaca gacacactcc tgctat 36

<210> 35

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gaattcccac catggatttt caagtgcaga ttttcag 37

<210> 36

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gaattcccac catggagwca cakwctcagg tctttrta 38

<210> 37

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gaattcccac catgkccccw rctcagytyc tkgt 34

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gaattcccac catgaagttg cctgttaggc tgttg 35

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

atgaaatgca gctggrtyat sttctt 26

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

atggrcagrc ttacwtyytc attcct 26

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

atgatggtgt taagtcttct gtacc 25

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

atgaacttyg ggytsagmtt grttt 25

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

atgtacttgg gactgagctg tgtat 25

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

atgagagtgc tgattctttt gtg 23

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

atggattttg ggctgatttt ttttattg 28

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

sargtnmagc tgsagsagtc 20

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

sargtnmagc tgsagsagtc wgg 23

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

caggttactc tgaaagwgts t 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gaggtccarc tgcaacartc 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gaggtccaac tvcagcarcc 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

agagtgaass tggtggaatc 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gatgtgaact tggaagtgtc 20

<210> 52

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

atagacagat gggggtgtcg ttttggc 27

Claims

1.特异性结合EGFR的结合蛋白，其特征在于，该结合蛋白具有轻链可变区和重链可变区，且其重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQID NO: 8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；其轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示；所述结合蛋白是单克隆抗体。

2. 如权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO: 26所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 28所示。

3.编码权利要求1～2任一所述的特异性结合EGFR的结合蛋白的多核苷酸。

4. 如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，其重链可变区的CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，CDR3的核苷酸序列如SEQ IDNO: 3所示；其轻链可变区的CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示。

5. 如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO: 25所示，其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO: 27所示。

6.一种表达载体，其包含权利要求3～5任一所述的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的表达载体或基因组中整合有权利要求3～5任一所述的多核苷酸。

8. 一种结合蛋白组合物，其特征在于，所述的组合物含有结合蛋白1和结合蛋白2，该结合蛋白1具有轻链可变区和重链可变区，且其重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO: 7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；其轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 11所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示；该结合蛋白2具有轻链可变区和重链可变区，且其重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 20所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示；其轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 22所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示；其中，所述结合蛋白是单克隆抗体。

9.权利要求1～2任一所述的特异性结合EGFR的结合蛋白或权利要求8所述的结合蛋白组合物在制备用于诊断或治疗EGFR过表达相关疾病的药物中的用途；所述的EGFR过表达相关疾病是存在EGFR过表达的实体肿瘤。

10. 特异性结合EGFR的结合蛋白在制备用于诊断或治疗EGFR过表达相关疾病的药物中的用途；所述特异性结合EGFR的结合蛋白的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO: 19所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 20所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，其轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 22所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示；所述的EGFR过表达相关疾病是存在EGFR过表达的实体肿瘤；所述结合蛋白是单克隆抗体。

11. 如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的实体肿瘤包括：非小泡细胞肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、头颈癌、食道癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤。

12.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：有效量的权利要求1～2任一所述的特异性结合EGFR的结合蛋白，和药学上可接受的载体；或

所述药物组合物含有：有效量的权利要求8所述的结合蛋白组合物，和药学上可接受的载体。

13. 一种用于治疗EGFR过表达相关疾病的药盒，所述的EGFR过表达相关疾病是存在EGFR过表达的实体肿瘤，其特征在于，该药盒中包括：

权利要求1～2任一所述的特异性结合EGFR的结合蛋白；或

权利要求8所述的结合蛋白组合物；或

权利要求12所述的药物组合物。

14. 一种免疫辍合物，其特征在于，所述的免疫辍合物包括：

权利要求1～2任一所述的特异性结合EGFR的结合蛋白；以及

可检测标记物。

15.如权利要求14所述的免疫辍合物，其特征在于，所述可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物。

16. 一种用于检测EGFR水平的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒中包括：

权利要求1～2任一所述的特异性结合EGFR的结合蛋白；或

权利要求14所述的免疫辍合物。