CN108220338A - 一种apn基因敲除的ipec-j2细胞的构建方法 - Google Patents

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Abstract

一种APN基因敲除的IPEC_J2细胞的构建方法，属于基因工程技术领域，本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除IPEC_J2细胞系基因组中APN基因序列，建立的APN基因敲除的小肠上皮细胞可为深入揭示腹泻病原体致病机制以及抗腹泻病转基因猪的培育和应用提供更直接有效的研究模型。

Description

一种APN基因敲除的IPEC-J2细胞的构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及CRISPR/Cas9的应用技术，也涉及猪小肠上皮细胞系（IPEC_J2）模型的构建技术。
背景技术
CRISPR/Cas9技术是来源于细菌和古生菌中的一种由sgRNA（small guide RNA）介导的适应性免疫***。其中sgRNA用于识别、结合靶点DNA，当Cas9蛋白活性被激活后可结合区域下游的DNA并对其进行切割，生成双链DNA断裂，诱发由非同源末端连接修复机制造成的移码突变，从而实现对靶基因的编辑。CRISPR/Cas9技术因其简便和高效的特性，近几年来作为真核基因进行定点编辑的重要遗传手段在人类及动植物基因功能研究领域得到广泛应用。
猪小肠上皮细胞（IPEC_J2）分离自新生仔猪空肠中段的柱状上皮细胞，具有研究猪病原体感染的物种特异性，是研究猪腹泻疾病的理想体外模型，在产肠毒素大肠杆菌和病毒性腹泻抗性基因功能鉴定研究中广泛应用。氨基肽酶N基因（APN）在小肠上皮细胞中高表达，作为细胞功能性受体可介导I 型冠状病毒（猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒等）以及K88大肠杆菌感染宿主细胞，并且APN蛋白表达水平可决定多种病原的感染程度。
APN基因可编码多种腹泻病原感染宿主细胞的功能性受体蛋白，已有关于编辑猪APN基因的sgRNA和修饰载体（专利申请号：201710424887.0）的相关研究，然而研究人员目前尚未获得APN基因敲除的小肠上皮细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种可应用在猪腹泻疾病研究中的APN基因敲除的IPEC-J2细胞的构建方法。
本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除IPEC-J2细胞系基因组中APN基因序列。
本发明包括以下步骤：
1）将5’端添加CACCG的sgRNA序列5’-TCTGTCTGTGGTGTATGCCC-3’和5’端添加AAAC的sgRNA序列的反向互补序列退火形成双链DNA；
2）将双链DNA与线性化后的敲除载体pGK1.1连接，得到连接产物；
3）以引物：
F：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’、
R：5’-GGGCATACACCACAGACAGA-3’对连接产物进行菌落PCR筛选，经扩大培养和质粒提取，取得阳性打靶载体；
4）将阳性打靶载体转染猪小肠上皮细胞（IPEC_J2），提取细胞基因组DNA，即得APN基因敲除的IPEC-J2细胞。
本发明提供的sgRNA序列5’-TCTGTCTGTGGTGTATGCCC-3’中sgRNA作用位点位于猪APN基因第一外显子中。
猪腹泻病原体具有小肠亲嗜性，本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除IPEC_J2细胞系基因组中APN基因序列，建立的APN基因敲除的小肠上皮细胞可为深入揭示腹泻病原体致病机制以及抗腹泻病转基因猪的培育和应用提供更直接有效的研究模型。
本发明的优点在于：（一）首次利用CRISPR/Cas9技术构建APN敲除的IPEC-J2细胞系，可作为研究猪腹泻疾病的理想细胞模型；（二）利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除，比基因沉默、干扰等技术手段可更有效地敲除APN基因，更有助于APN蛋白的功能研究；（三）基因和蛋白水平检测都表明APN基因被敲除，证明APN基因序列已被改变，可造成APN基因功能的缺失，是较为理想的APN基因敲除的IPEC-J2细胞模型。
进一步地，本发明所述步骤1）中，将5’端添加CACCG的sgRNA序列和5’端添加AAAC的sgRNA序列的反向互补序列和双蒸水、退火缓冲液混合，反应体系瞬时离心后，于95℃孵育3min，再经冷却获得双链DNA。
述步骤2）中，将双链DNA和线性化后的敲除载体pGK1.1、T4DNA连接酶、连接缓冲液、双蒸水混合后，体系瞬时离心后，于16℃孵育30min，取得连接产物。
将所述连接产物加入Top10感受态，在无抗SOC液体培养基中进行扩大培养。
附图说明
图1为菌落PCR凝胶电泳检测图。
图2为菌落PCR产物测序峰图。
图3为敲除靶位点PCR扩增凝胶电泳检测图。
图4为Cruiser™Enzyme酶切筛选阳性克隆PCR验证结果。
图5为Cruiser™Enzyme酶切筛选出的潜在阳性克隆测序峰图。
图6为Westernblot检测APN蛋白表达结果。
图7为野生型APN基因序列和APN基因敲除序列的对比分析结果。
图8为猪APN基因敲除的IPEC-J2细胞照片（放大倍数100）。
具体实施方式
靶位点设计及sgRNA序列的合成：
根据NCBI数据库获取猪APN基因（Gene ID：397520）所有转录本的CDs序列，并找出CDs区所处的第一个外显子进行靶位点设计。利用在线工具CRISPR Design（http://crispr.mit.edu/）设计sgRNA向导序列：
5’-TCTGTCTGTGGTGTATGCCC-3’，其中sgRNA作用位点位于猪APN基因第一外显子中，在其5’端添加CACCG，形成正链Oligo DNA。
同时合成sgRNA序列的反向互补序列：5’-GGGCATACACCACAGACAGA-3’，并在5’端添加AAAC，形成负链Oligo DNA。
结果如下：
正链Oligo DNA：5’-CACCGTCTGTCTGTGGTGTATGCCC-3’；
负链Oligo DNA：5’-AAACGGGCATACACCACAGACAGA-3’。
．打靶载体的构建：
（1）将以上正链Oligo DNA和负链Oligo DNA退火形成dsDNA：
反应体系如下：
成分 用量
正链Oligo (10 μM) 10 μl
负链Oligo (10 μM) 10 μl
双蒸水 16 μl
退火缓冲液(10X) 4 μl
将上述反应体系瞬时离心并置于95℃孵育3min，自然冷却20min。
取1 μl以上退火形成的dsDNA与BbsI酶切后线性化的敲除载体pGK1.1进行连接：
反应体系如下：
成分 用量
dsDNA 1 μl
线性化后的敲除载体pGK1.1 1 μl
T4DNA连接酶 0.5μl
连接缓冲液(10X) 1 μl
双蒸水 6.5 μl
将上述体系瞬时离心后，16℃孵育30 min，取得连接产物。
以上“线性化后的敲除载体pGK1.1”是将敲除载体pGK1.1经过BbsI酶切取得的。
（2）转化Top10感受态及筛选阳性打靶载体：
打靶载体的培育：将10 μl以上连接产物加入Top10感受态，轻弹混匀，冰上孵育30min；42 ℃水浴60 sec，迅速拿出置冰上冷却2～3 min；向管中加入800 μl 无抗SOC液体培养基，摇床（37 ℃/160 rpm）培养45 min；4500 rpm离心5 min，弃去600 μl上清，将沉淀悬在剩余的200 μl上清中，均匀涂布于含卡那霉素抗性的培养平板上，倒置37 ℃过夜培养。
根据敲除载体pGK1.1及sgRNA序列设计一对引物：
F：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’、
R：5’-GGGCATACACCACAGACAGA-3’ 。
菌落PCR的筛选：自以上培养板中挑取白色单克隆菌落并置于PCR管中，向PCR管中添加上述上下游引物各1 μl，缓冲液(10X) 2 μl，dNTP 2 μl，Taq酶0.2 μl，双蒸水13.8 μl。PCR反应程序为95℃ 10 min；95℃ 35 sec，60℃ 35 sec，72℃ 35 sec，35个循环；72℃10 min。
图1为菌落PCR凝胶电泳检测图，其中，M为100 bp DNA Marker，1、2、3为阳性菌落PCR条带。由图1可见：以上方法获得了阳性打靶载体，即阳性克隆。
对得到的阳性克隆进一步测序验证，如图2所示的菌落PCR产物测序峰图。
图2可见：该阳性克隆的基因序列与pGK1.1载体及sgRNA序列相吻合。
经过图1、2充分证明：得到的阳性克隆即打靶载体。
对阳性克隆采用常规方法进行扩大培养后，再进行质粒提取，即得阳性重组质粒。
．细胞转染：
将状态良好的对数生长期的约5×106个猪小肠上皮细胞（IPEC_J2）置于15mL离心管中，1000 rpm/5 min离心弃上清，用210 μl DPBS悬浮细胞，转移至1.5 mL离心管中，加入阳性重组质粒5～8 μg（浓度要求大于1 μg/μl），轻轻混匀。
将混合液用专用电转枪头转移至电击杯中，待液面凸起后，盖上电击杯盖并至于电转仪，650V/30ms进行电转，之后将细胞液转移至六孔板培养基中。
基因的敲除：
电转72小时后，以3 μg/ml浓度的嘌呤霉素进行药筛，并用有限稀释法稀释细胞至10块96孔板中，在37℃的CO2培养箱中静置培养一周后，观察单克隆生长情况，约两周后将长起来的单克隆细胞转移至48孔中扩大培养。
当细胞长满48孔1/2时，取出102～104个细胞，使用Genloci TNA抽提试剂盒（货号：GP0155）及其提供的操作步骤提取细胞基因组DNA。
至此，已完成对猪小肠上皮细胞中APN基因的敲除。
以上步骤 4提取的细胞基因组DNA的扩增：
根据APN基因全序列，在敲除靶位点附近设计高特异性的引物，序列为：
F: 5’-ACCATGGCCAAGGGATTCTA-3’；
R: 5’- GGTGGTGTAGTTGAGCTTCT -3’。
PCR扩增反应体系如下：
成分 用量
细胞基因组DNA 100ng
DMSO 1.8μl
dNTP (10 mM) 0.6 μl
上/下游引物 各1.2μl
Taq酶 0.3μl
缓冲液(10X) 3μl
双蒸水 添加至30 μl
PCR反应程序为95℃ 5min；95℃ 10sec，60℃ 10sec，72℃ 10sec，35个循环；72℃5min，95℃ 3 min，获得长度为384bp的PCR产物。
图3为敲除靶位点PCR扩增凝胶电泳检测图。其中，M为100bp DNA Marker，1、2、3为PCR产物条带。
由图3可见：敲除靶位点附近设计的引物可对目的序列进行成功扩增。
．对长度为384bp的PCR产物的验证：
（1）Cruiser™Enzyme酶切筛选阳性克隆
使用识别错配的Cruiser™ Enzyme对以上长度为384bp的PCR产物进行检测：
在PCR管中配置反应体系如下：
成分 用量
长度为384bp的PCR产物 2μl
Cruiser™酶 1 μl
Cruiser™缓冲液(5X) 2μl
双蒸水 5 μl
45℃反应20min后立即向上述10 μl反应体系内加入2μl 6×Stop Buffer，随后进行琼脂糖电泳检测，获得潜在阳性克隆（编号3）。
图4为Cruiser™ Enzyme酶切筛选阳性克隆PCR验证结果。其中，M为100 bp DNAMarker，1、2、4为野生型克隆，3为潜在阳性克隆（即潜在打靶阳性克隆）。
以上“野生型克隆”是目的基因片段没有被敲除掉的细胞；目的基因片段被敲除的细胞称为潜在阳性克隆。
图4说明：试验已获得潜在打靶阳性克隆。
（2）阳性克隆测序及Western blot验证：
对Cruiser™ Enzyme酶切筛选出来的潜在阳性克隆进行PCR测序验证，如图5的潜在阳性克隆测序峰图所示，确定阳性克隆。
然后用Western blot在蛋白水平检测APN基因表达情况，结果未检测到APN蛋白表达（图6）。
图6为Western blot检测APN蛋白表达结果。其中，Control为野生型IPEC-J2细胞，APN KO为APN基因敲除的IPEC-J2细胞，GAPDH为内参蛋白。证明APN基因已从IPEC-J2细胞敲除。
对于两个等位基因突变情况不一样的阳性克隆，重新做TA克隆后送测序，与野生型进行比对，序列突变为176bp的缺失（图7）。
图7为TA克隆测序分析APN基因敲除序列。其中，上行为野生型APN基因序列，下行为APN基因敲除序列。
通过对比，可见本发明采用以上方法构建了APN基因敲除的IPEC-J2细胞，缺失片段的176bp序列表（SEQ ID NO.1）如下：
cccaggagaa gaacaagaat gccgagcatg tcccccaggc ccccacgtcg cccaccatca 60
ccaccacagc cgccatcacc ttggaccaga gcaagccgtg gaaccggtac cgcctaccca 120
caacgctgtt gcctgattcc tacttcgtga cgctgagacc ctacctcactc ccaac 176。
基因敲除的IPEC-J2细胞的扩大培养：
对获得的APN敲除的IPEC-J2细胞添加含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、CO2培养箱中扩大培养，可获得大量的APN基因敲除的IPEC-J2细胞，如图8所示。

Claims (4)

1.一种APN基因敲除的IPEC_J2细胞的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将5’端添加CACCG的sgRNA序列5’-TCTGTCTGTGGTGTATGCCC-3’和5’端添加AAAC的sgRNA序列的反向互补序列退火形成双链DNA；
2）将双链DNA与线性化后的敲除载体pGK1.1连接，得到连接产物；
3）以引物：
F：5’-CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG-3’
R：5’-GGGCATACACCACAGACAGA-3’
对连接产物进行菌落PCR筛选，经扩大培养和质粒提取，取得阳性打靶载体；
4）将阳性打靶载体转染猪小肠上皮细胞，提取细胞基因组DNA，即得APN基因敲除的IPEC-J2细胞。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤1）中，将5’端添加CACCG的sgRNA序列和5’端添加AAAC的sgRNA序列的反向互补序列和双蒸水、退火缓冲液混合，反应体系瞬时离心后，于95℃孵育3min，再经冷却获得双链DNA。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤2）中，将双链DNA和线性化后的敲除载体pGK1.1、T4DNA连接酶、连接缓冲液、双蒸水混合后，体系瞬时离心后，于16℃孵育30min，取得连接产物。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于将所述连接产物加入Top10感受态，在无抗SOC液体培养基中进行扩大培养。
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