CN108220244A

CN108220244A - 一种含重组人表皮生长因子受体抗体基因的cho细胞株、筛选方法及其生产工艺

Info

Publication number: CN108220244A
Application number: CN201810048430.9A
Authority: CN
Inventors: 任桂萍; 李德山; 张胜奇; 刘春香
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2018-01-18
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明公开了一种含重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株、筛选方法及其生产工艺。本发明提供了一种重组人表皮生长因子受体抗体基因，并将携带重组人表皮生长因子受体抗体基因的真核表达载体转染进入CHO‑K1细胞，利用流式细胞仪多次筛选得到高表达重组人表皮生长因子受体抗体的细胞，并建立细胞株的生产工艺。本发明提供的含重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株所表达的重组蛋白可对多种癌细胞表面的EGFR配体结合位点进行封闭，从而削弱或阻断EGFR下游的信号传导，达到抑制肿瘤的生长和侵袭，促进细胞凋亡的目的。在治疗EGFR过表达引起的癌症方面具有很大的应用价值，对于EGFR过表达引起的癌症治疗具有重大应用价值。

Description

一种含重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株、筛选方法及其生产工艺

技术领域

本发明涉及“一种含重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株、筛选方法及其生产工艺”属于生物技术领域。

背景技术

近年来，恶性肿瘤一直作为一种顽固性疾病危害着人类健康。目前，癌症的治疗主要还是以放疗和化疗为主，但放化疗给人体带来的损伤往往是不可修复的，如放射性肝、肺纤维化等。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种膜表面受体，其具有酪氨酸激酶活性，能够进行细胞信号传递，已有研究证实，EGFR过度表达与某些肿瘤，如非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、乳腺癌等密切相关。在癌症患者中，通过人为干预使EGFR降低后，可以明显改善癌症患者的病情。

编码表皮生长因子受体的基因位于7号染色体的短臂1区2带，隶属于表皮生长因子(erbB)家族，该家族共有四个成员：ErbB1(EGFR)、ErbB2、ErbB3、ErbB4，EGFR在许多如头颈部癌、皮肤鳞癌、食管癌、结直肠癌等实体瘤组织和器官中过度表达。EGF结合EGFR后，促使EGFR单体进行二聚化作用而形成二聚体，受体的二聚化导致胞内区的酪氨酸蛋白激酶活性激活，随后，信号传导到细胞核，通过对核内基因的转录调控，发挥相应的生物学作用。相关研究发现，EGF途径主要包括RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT通路，这两个通路作为一个复杂的网络而运行。EGFR的过度表达和活化导致胞内若干信号活化，不仅使细胞增殖达到高潮，而且对细胞凋亡、细胞迁移，血管生成等其他癌症的进展过程也至关重要。表皮生长因子受体(EGFR)的异常信号传导在恶性表型的发展和维持起着重要的作用，因此，该受体是一种合理的抗肿瘤靶点。

目前，临床上针对于EGFR异常表达所引起的肿瘤所使用的治疗药物主要为小分子酪氨酸激酶拮抗剂和单克隆抗体。小分子化合物酪氨酸激酶拮抗剂主要为吉非替尼和埃罗替尼。目前，已批准上市的用于治疗癌症抗体药物有20种，其中，以EGFR为靶点的治疗性单克隆抗体主要为Cetuximab、Panitumumab和Nimotuzumab三种，这些EGFR单克隆抗体可以封闭EGFR胞外区对应的配体的结合位点，抑制其特有的酪氨酸激酶活性，减慢因该信号通路所引起的癌症的恶化速度。FDA批准上市的抗hEGFR抗体中，其中，Cetuximab为人鼠嵌合单克隆抗体，其虽然可以特异性的与EGFR结合，较好的抑制癌症的发展，但在人体应用的过程中往往表现出较强的免疫原性，易产生人抗鼠反应；Panitumumab是100％的人源性单克隆抗体，其采用转基因小鼠技术制备，由balb/c小鼠细胞分泌表达及修饰，鼠源修饰可造成糖基化减弱，超敏反应，半衰期短等缺点；Nimotuzumab是一种通过人源化改造的而获得的IgG1型单克隆抗体，改造过程中将鼠源IgG2a的互补决定域(CDR)移植到人的抗体结构中，大大降低了鼠源抗体成分，然而在表达载体的构建过程中，抗体的轻、重链基因被分别连至不同的载体而使之分别表达，这种方法往往会导致轻、重链的表达比例处于非均衡状态，同时降低抗体的组装效率，使具有完整结构的抗体的产率下降。本发明中，抗体轻、重链连接到同一表达载体peedual中，实现抗体轻、重链的共表达。

全长抗体分子是由两条完整的重链和两条完整的轻链通过二硫键连接而成的四聚体蛋白，在生物表达过程中经过细胞器严格的加工修饰才能使其具有高亲和力以及与抗原特异性结合能力，因此，对其生产从质和量上的要求就更加的严格，表达***的选择也至关重要。原核生物不含蛋白加工修饰的众多细胞器，因此，大肠杆菌表达***只可以用于生产体积小、结构简单、不需要糖基化的抗体片断如Fab、Fab'、scFv等；低等真核生物表达***，如酵母及丝状真菌，可用于全长抗体的生产，但其糖基化类型与人类相比存在差异，如酵母糖基化类型为多麦芽糖类型，该类型糖蛋白抗体半衰期较短、生理活性有限甚至对人体有毒性。在蛋白修饰的***中最接近人体的是哺乳动物表达***，该***可以对蛋白进行适当的折叠、装配和翻译后修饰，在临床应用中占主导地位，目前，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO cells)是最理想的真核表达宿主，通过该***表达的蛋白在构型和构象上更接近于天然蛋白，是重组糖基化蛋白生产的首选体系。

目前，获FDA批准的抗体药物中许多是由CHO细胞生产的，CHO-K1细胞是可以悬浮生长的谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷型细胞，因此，转染后的CHO细胞可运用共扩增基因进行筛选，即在表达载体上游加入GS基因作为筛选标记，同时利用GS抑制物甲硫胺酸亚砜(L-Methionine sulfoxide，MSX)进行加压筛选，随培养基中MSX浓度的逐渐增加，GS基因带动与之串联在一起的外源基因共同转录，使目的基因的转录效率增加，从而实现外源基因的高效表达。由于GS筛选标记不能够直观的监测及分选阳性细胞，因此，本发明在轻链的下游引入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因，EGFP是GFP的突变体，具有更高的荧光强度，在488nm波长光激发下可产生绿色荧光，从而通过流式细胞仪进行检测和分选。

由于常规CHO细胞需要在有牛血清或类似成分存在的情况下贴壁生长，细胞培养基中的血清或蛋白质成分对重组蛋白在细胞中的表达以及后期的蛋白纯化过程有很大的影响。如果进行产业化，还需要首先进行无血清驯化，使细胞适应无血清培养基并在其中生长良好并持续分泌产生重组蛋白质以降低成本并方便下游纯化工艺的开发。

无血清悬浮驯化技术被广泛应用于基因工程制药。一方面是为了获得能够满足生产要求的无血清细胞株；另一方面，是为了获得无血清悬浮生长的宿主细胞，为后续细胞株的开发奠定基础，常用的宿主细胞，如CHO细胞、骨髓瘤细胞。本发明中工程细胞驯化方法采用两个阶段的驯化过程，第一步适应无血清培养条件培养，第二步使细胞适应悬浮。

发明内容

本发明提供了一种可以稳定，高效表达anti-hEGFR的悬浮CHO-K1单克隆细胞株，可以用于hEGFR抗体的产业化生产，得到的anti-hEGFR可以封闭EGFR胞外区对应的配体的结合位点，抑制其特有的酪氨酸激酶活性，减慢因该信号通路所引起的癌症的恶化速度。

本发明提供的稳定，高效表达anti-hEGFR的悬浮CHO-K1单克隆细胞株，由不含内毒素的peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒转染进入CHO-K1细胞株，并通过甲硫胺酸亚砜加压和流式细胞仪多次筛选、流式细胞仪分选单克隆后悬浮驯化得到。

本发明还提供了稳定，高效表达anti-hEGFR的悬浮CHO-K1单克隆细胞株悬浮培养的生产工艺，即37℃、5％CO2、150rpm培养8天，分别于第3天、第5天和第7天补加10％培养体积的含1g/L Pluronic F-68OptiCHO无血清培养基，培养结束后收集上清，得到anti-hEGFR。

附图说明

图1为转染前后的CHO-K1细胞

图2为转染后的经MSX加压CHO-K1细胞

图3为转染后CHO-K1阳性细胞的筛选

图4为单克隆细胞阳性率检测

图5为单克隆细胞的Dot Blot检测

图6为表达anti-EGFR重组蛋白的悬浮细胞和贴壁细胞形态

图7为悬浮培养表达anti-hEGFR CHO-K1单克隆细胞株SDS-PAGE分析

图8为anti-hEGFR纯化结果

图9为anti-hEGFR与抗原结合的ELISA分析

图10为anti-hEGFR对A431细胞周期的影响

图11为anti-hEGFR对A431细胞侵袭的抑制作用

图12为anti-hEGFR对A431细胞中MMP2、TIMP2、MMP9、TIMP1基因mRNA表达影响

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。CHO-K1细胞：本实验室保存。胎牛血清，IMDM培养基，DMEM培养基，无血清MEM培养基，OptiCHO无血清培养基：GIBCO公司。L-Glutamine，甲硫胺酸亚砜:Sigma公司。

实施例1、获得anti-hEGFR CHO-K1细胞株

CHO-K1细胞是谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷的中国仓鼠卵巢细胞系，从细胞库中复苏一支CHO-K1细胞株，用含有10％胎牛血清含谷氨酰胺的DMEM培养基传代两次，当细胞处在对数生长期时，以1×10^6cells/ml细胞密度接种于细胞培养瓶，于37℃，5％CO2培养箱中培养直至汇合度为70～80％，用胰蛋白酶消化，加血清终止消化，1000rpm，5min，离心后用PBS洗细胞一次，将细胞用无血清MEM培养基(GIBCO公司MEM转染用无血清培养基)稀释计数，使其浓度达1×10^7cells/mL。取纯化后且不含内毒素的peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒DNA 20μg加入400μL细胞悬液中，250V、1 000Ω、1 000μF参数下进行电转。将转染后的细胞转入含有10％胎牛血清的完全培养基中复苏培养。电转24-30h后更换含50μM GS抑制物甲硫胺酸亚砜(L-Methionine sulfoxide，MSX)，无谷氨酰胺的10％胎牛血清IMDM培养基进行加压培养。转染前后细胞形态如图1所示。转染后经MSX加压培养后anti-hEGFR CHO-K1细胞株流式细胞仪检验阳性率如图2所示。

实施例2、稳定、高效表达anti-hEGFR CHO-K1细胞株的筛选

本发明在轻链的下游引入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因，在488nm波长光激发下可产生绿色荧光，可通过流式细胞仪进行检测和分选。转染后用含50μM MSX，无谷氨酰胺的10％胎牛血清IMDM培养基进行加压培养使未转入和瞬时转染的CHO-K1细胞淘汰，待稳定转染的克隆长满细胞培养瓶后进行流式细胞仪无菌分选。

分选的步骤为：将细胞用胰蛋白酶消化，加血清终止消化，1000rpm，5min，离心后用PBS洗细胞两次，500μL PBS重悬细胞，同样处理未转染的空白细胞作对照。流式细胞仪识别出的阳性率较高的细胞分选到含50μM MSX，无谷氨酰胺的10％胎牛血清IMDM培养基的六孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养并观察，细胞长至约5～10×10^6cells后，进行下一轮筛选。

四轮筛选完成后，得到阳性率90％以上的混合克隆群，扩大培养，冻存细胞，建立种子细胞库。四轮筛选流式细胞仪检验anti-hEGFR CHO-K1细胞株阳性率结果如图3所示。

实施例3、稳定，高效表达anti-hEGFR CHO-K1单克隆细胞株的获得

用96孔板单克隆分选方法从四筛得到的混合克隆群中筛选出稳定、高效表达的单克隆细胞株。

单克隆分选方法如下：先将96孔板每孔加入200μL、37℃提前预热的无菌含50μMMSX，无谷氨酰胺的10％胎牛血清IMDM培养基，边孔加入PBS。细胞处理步骤如实施例2分选步骤，筛选完成后将96孔板置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，1～2周后利用荧光显微镜观察细胞生长情况，并更换培养基，待单克隆细胞增殖到1 000cells以上时，传至24孔培养板，根据细胞增殖数量的增加依次扩大培养，利用流式细胞仪在488nm激发光条件下，检测各单克隆细胞株的荧光强度。流式细胞仪筛选得到anti-hEGFR单克隆细胞株检验阳性率如图4所示。选择流式检测值最高的5个细胞株进行Dot blot方法检测。Dot blot检测结果如图5所示。选取荧光强度既强、Dot blot值又高的一个细胞株作为anti-hEGFR表达细胞株，扩增培养，冻存细胞。建立种子细胞库。

实施例4、稳定，高效表达anti-hEGFR CHO-K1单克隆细胞株悬浮驯化

从细胞库中复苏一支重组anti-hEGFR表达细胞株，用50μM MSX、无谷氨酰胺的10％胎牛血清IMDM培养基传代两次，当细胞处在对数生长期时，用胰蛋白酶消化，加血清终止消化，1000rpm，5min，离心，去上清，加入OptiCHO无血清培养基(GIBCO公司CHO无血清培养基)，把细胞制成悬液，以5～6×10^5cells/ml接种到细胞培养瓶中，当细胞密度达到2～3×10^6cells/ml时按1：5细胞传代，培养两周，使细胞适应在无血清培养基中生长。而后1000rpm，5min，离心，去上清，加入1g/L Pluronic F-68OptiCHO无血清培养基(GIBCO公司CHO无血清培养基)，制成5～6×10^5cells/ml细胞悬液，接种到无菌摇瓶中，摇床转速为150rpm，当细胞密度达到2～3×10^6cells/ml，按1：3传代，传代5～6次时，当细胞在无血清中生长速度与含血清中生长速度接近，冻存细胞。建立种子细胞库。驯化前后细胞形态对比见图6。

实施例5、稳定，高效表达anti-hEGFR CHO-K1单克隆细胞株悬浮培养

从细胞库中复苏一支重组anti-hEGFR CHO-K1细胞株到无菌摇瓶中，用含1g/LPluronic F-68OptiCHO无血清培养基传代两次，当细胞处在对数生长期时，以3～5×10^5cells/ml细胞密度接种，37℃、5％CO2、150rpm培养8天，分别于第3天、第5天和第7天补加10％培养体积的含1g/L Pluronic F-68OptiCHO无血清培养基，培养结束后收集上清。即得到anti-hEGFR。培养期间每天取微量上清，经非还原性SDS-PAGE(图7)分析可见，随着培养时间的增加，anti-hEGFR表达量不断增加，可达到0.4mg/ml。

实施例6、anti-hEGFR纯化

收集细胞培养上清约400mL后，使用AKTA Purifier 100蛋白层析***(购自GE公司)进行抗体纯化。上样前以PH 7.0的磷酸盐缓冲液平衡proteinA柱子(购自GE公司)，上样后以PH 3.0的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液洗脱抗体蛋白，然后将洗脱的蛋白于PBS中过夜透析。纯化后的蛋白用SDS-PAGE分析(图8)。

实施例7、Anti-hEGFR的生物学活性检测

(1)ELISA检测anti-hEGFR的亲和力

将hEGFR抗原蛋白用包被液稀释至20μg/mL后包被酶标板，4℃过夜。分别加入二倍梯度稀释的anti-hEGFR(初始浓度3μg/mL)，不加抗体作为阴性对照，加Cetuximab(浓度3μg/mL)作为阳性对照，每个样品设置3个复孔。加入HRP标记的羊抗人抗体作为第二抗体，用酶标仪检测450nm波长下的A值。结果如图9所示，随着hEGFR全长抗体浓度的降低，吸光值也随之降低，在0.047μg/mL浓度时OD450值达到最低，但仍然是阴性对照的4.5倍。结果表明hEGFR全长抗体与hEGFR的作用呈现抗体浓度依赖性，并且抗体效价较高。

(2)PI染色检测细胞周期

经常规胰酶消化处理Control、anti-hEGFR和Cetuximab组A431细胞，用70％乙醇固定后并经PI染色后，进行流式细胞仪检测，细胞周期拟和软件ModFit分析结果如图10所示：未经蛋白处理的A431细胞中G1/G0期的细胞所占比重为62.43％，而anti-hEGFR组与Cetuximab组G1/G0期的细胞所占比重分别为77.96％和79.15％。anti-hEGFR组、Cetuximab组G1/G0期的细胞所占比重均显著低于空白对照组，差异显著(p<0.01)；而anti-hEGFR组与Cetuximab组相比，差异不显著。

(3)全长抗体对A431细胞侵袭的影响

1)Boyden法检测Anti-hEGFR对A431细胞侵袭的抑制作用

Boyden体外侵袭实验中，anti-hEGFR、Cetuximab分别作用A431细胞48h后检测细胞穿透Matrigel人工基底膜的能力，结果(图11)显示，anti-hEGFR能够明显地减少A431细胞的穿膜细胞数(穿膜细胞数由空白对照组的34.0±2.26个减少至27.3±3.05个，p<0.01)，而与Cetuximab组(穿膜细胞数为26.3±2.54个)相比无差异。结果表明，癌细胞可以移动并具有体外侵袭的能力，anti-hEGFR可以通过与癌细胞表面EGFR结合来降低A431细胞侵袭转移能力。

2)Anti-hEGFR调节A431细胞中MMP2、MMP9及TIMP2、TIMP1的表达

MMPs和TIMPs在多种组织和器官中均出现表达，主要参与细胞外基质的代谢作用，MMPs对细胞外机制有破坏性作用，而TIMPs则可以抑制MMPs的活性，如MMP2和MMP9在肿瘤细胞浸润、转移的过程中起关键性作用。MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1Real-time PCR结果(图12)可见，anti-hEGFR组中MMP2与MMP9表达的量高于Cetuximab组，但与空白对照相比，anti-hEGFR组中，MMP2与MMP9表达量分别是空白对照组的0.718756和0.0403273倍，差异达显著水平(p<0.05)；MMP2与MMP9对应的抑制剂TIMP2、TIMP1表达情况为：anti-hEGFR组TIMP2、TIMP1表达量分别为空白对照组的4.67576倍和757.155倍，且分别为Cetuximab组的1.93281倍和2.28798倍，差异均达极显著水平(p<0.01)。可以说明，anti-hEGFR能够通过调节细胞外基质破坏性酶类因子来维持细胞外基质的稳定，从而抑制肿瘤细胞的侵袭。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种含重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株、筛选方法及其生产工艺

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(798)

<400> 1

atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg 48

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc 96

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc 144

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc 192

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

ctg acc tac ggc gtg cag tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag 240

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag 288

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag 336

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc 384

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac 432

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

aac tac aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac 480

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

ggc atc aag gtg aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc 528

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc 576

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg 624

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc 672

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210 215 220

gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag tcc 720

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser

225 230 235 240

gga ctc aga tct cga gct caa gct tcg aat tct gca gtc gac ggt acc 768

Gly Leu Arg Ser Arg Ala Gln Ala Ser Asn Ser Ala Val Asp Gly Thr

245 250 255

gcg ggc ccg gga tcc acc gga tct aga taa 798

Ala Gly Pro Gly Ser Thr Gly Ser Arg

260 265

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 2

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Met Glu Thr Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu

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Gly Met Glu Thr Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Gly Leu Arg Ser Arg Ala

245 250 255

Gln Ala Ser Asn Ser Ala Val Asp Gly Thr Ala Gly Pro Gly Ser Thr

260 265 270

Gly Ser Arg

275

<210> 3

<211> 1385

<212> DNA

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<400> 3

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acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420

aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480

gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540

gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gatatatggc cacaaccatg gtgagcaagg 600

gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg 660

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tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct 840

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gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg 960

agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca 1020

actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga 1080

acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc 1140

agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc 1200

agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg 1260

tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtccgga ctcagatctc 1320

gagctcaagc ttcgaattct gcagtcgacg gtaccgcggg cccgggatcc accggatcta 1380

gataa 1385

<210> 4

<211> 645

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(645)

<400> 4

gac atc ttg ctg acc cag tct cca gtc atc ctg tcc gtg agt cca gga 48

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag agt att ggc aca aac 96

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

ata cac tgg tat cag caa aga aca aat ggt tct cca agg ctt ctc ata 144

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

aag tat gct tct gag tct atc tct ggg atc cct tcc agg ttt agt ggc 192

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

agt gga tca ggg aca gat ttt act ctt agc atc aac agt gtg gag tct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

gaa gat att gca gat tat tac tgt caa caa aat aat aac tgg cca acc 288

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

cca tct gtc ttc atc ttc cct cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 384

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc 528

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

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Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 5

<211> 214

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 5

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

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195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 6

<211> 1350

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1350)

<400> 6

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35 40 45

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc ctc 528

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc 576

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc 624

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa 1008

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc 1104

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag 1152

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag 1248

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

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Lys

<210> 7

<211> 457

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<213> Artifical sequence

<400> 7

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Glu Thr Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

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115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

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180 185 190

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245 250 255

Glu Thr Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

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275 280 285

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

Cys Ser Val Met Glu Thr His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

Claims

1.一种含有重组人表皮生长因子受体抗体基因(质粒为Peedual-IRES-EGFP-hEGFR)的CHO悬浮细胞株。

2.根据权利要求1所述的CHO细胞株，其宿主细胞为CHO-K1。

3.根据权利要求1所述的质粒Peedual-IRES-EGFP-hEGFR，其包含IRES(内部核糖体进入位点)序列、EGFP(增强型绿色荧光蛋白)序列和EGFR(重组人表皮生长因子受体抗体)序列。

4.根据权利要求3所述的质粒，其中EGFP编码基因序列为SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示；IRES EGFP片段编码基因序列为SEQ ID NO:3所示。EGFR包括LC和HC片段，其中LC编码基因序列为SEQ ID NO:4所示，氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示；HC编码基因序列为SEQ ID NO:6所示，氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示。

5.根据权利要求1-4任一所述的CHO细胞株的构建方法，包括以下步骤：

(1)提取重组质粒Peedual-IRES-EGFP-hEGFR；

(2)将质粒转入CHO-K1中。取纯化后且不含内毒素的peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒DNA 20μg加入400μL细胞悬液中进行电转，电转参数为250V、1 000Ω、1 000μF；

(3)利用GS抑制物甲硫胺酸亚砜(L-Methionine sulfoxide，MSX)进行加压筛选，利用流式细胞仪多次筛选得到混合克隆细胞；

(4)利用流式细胞仪分选得到单克隆细胞株，流式细胞仪检测阳性率，SDS-PAGE检测单克隆细胞株的表达量，Dot blot检测，筛选得到高效表达重组hEGFR单克隆抗体的CHO细胞株。

6.根据权利要求5所述的构建方法，获得含有重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株。

7.根据权利要求5所述的构建方法，所述甲硫胺酸亚砜的最终浓度为50μM。

8.根据权利要求1-5任一所述CHO细胞株在生产重组hEGFR单克隆抗体药物中的应用。

9.根据权利要求1-7所述CHO细胞株在生产重组hEGFR单克隆抗体的方法，其特征在于培养8天，分别于培养第3天、第5天和第7天补加10％培养体积的含1g/L Pluronic F-68OptiCHO无血清培养基。