CN108218998A - 一种突变型人源IgG的Fc片段及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种突变型人源IgG的Fc片段及其制备方法与应用。在Fc片段的CH2和CH3结构域分别引入一对二硫键，进而提高分子的稳定性和抗聚集能力。突变型人源IgG的Fc片段相对于野生型的Fc，其稳定性更好，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本；其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。

Description

一种突变型人源IgG的Fc片段及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种突变型人源IgG的Fc片段及其制备方法与应用。

背景技术

抗体以其特异性强、灵敏度高，广泛应用于各个领域，尤其是生命科学研究和临床治疗如ELISA、Western blot、免疫荧光分析、疾病快速诊断以及作为生物制剂治疗各种疾病。因此，进入21世纪以来，人们也开始越来越关注治疗性抗体药物的研发与临床应用，这是因为它对人体毒副作用小、具有天然和高度特异性的疗效，并且创造出了巨大的社会效益和经济效益。

同时，基于Fc片段的融合蛋白不仅以其分子量相对较小而具有很好的组织渗透性，而且偶联的Fc片段可与Fc受体(FcRn)等效应分子相互作用，因而延长了药物的血浆半衰期以及可诱导ADCC、CDC效应或者吞噬作用。

然而，这些抗体药物以及Fc融合蛋白作为生物活性大分子，它也有自身的局限性，如稳定性差、抗聚集能力弱，在其表达、纯化、贮存等过程中，会倾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所导致的免疫原性，不仅降低了药效，同时也给临床应用带来很大的风险。因此，提高抗体热稳定性与抗聚集能力是该领域亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中Fc片段稳定性差、抗聚集能力弱的缺陷，提供一种突变型人源IgG的Fc片段及其制备方法与应用，与野生型Fc相比，其稳定性与抗聚集能力均有提高，在抗体或者Fc融合蛋白的研发、生产、临床应用上具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供了一种所述突变型人源IgG的Fc片段是通过在人源IgG的Fc片段的CH2结构域和CH3结构域中引入二硫键后获得。

上述方案中优选地，所述突变型人源IgG的Fc片段的氨基酸序列中第242位、第334位、第343位和第431位的氨基酸为半胱氨酸(氨基酸位置编号参见http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHG nber.html中的Eu numbering，以下同)。

优选地，所述突变型人源IgG的Fc片段，命名为S23，其氨基酸全长序列为Seq IDNo.1。

可选地，所述突变型人源IgG的Fc片段的编码基因序列为Seq ID No.2。

本发明还提供了上述突变型人源IgG的Fc片段的制备方法，其步骤如下：

(1)获取人源IgG的Fc片段的基因；

(2)设计引物将Fc中的指定氨基酸碱基突变成编码半胱氨酸的碱基，扩增出得到突变型Fc；

(3)以突变型Fc基因序列构建真核表达载体，转染哺乳动物细胞，进行真核表达，纯化得到目标Fc片段。

本发明还揭示了上述突变型人源IgG的Fc片段在制备Fc融合蛋白中的应用以及在制备单克隆抗体中的应用。

本发明通过CD、分子筛、荧光检测仪、紫外分光光度计、ELISA等方法对S23的二级结构、存在形式、稳定性、抗聚集性进行了鉴定，用野生型Fc进行对照。相关实验也证明S23能够与Fc受体相结合，因此，修饰改造后的S23提高了自身理化性质的同时并没有破坏自身生物学效应。

本发明的有益效果：

1)相对于野生型的Fc，其稳定性更好，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本；

2)相对于野生型的Fc，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。

附图说明

图1为Fc、S23蛋白的表达纯化后蛋白免疫印迹检测图。

图2为Fc、S23蛋白的表达纯化后SDS电泳图。

图3为Fc、S23蛋白分子的存在形式分析图(单体、二聚体等)。

图4为圆二色谱分析Fc、S23分子构象的分析图。

图5为Fc、S23蛋白在变性剂条件下的稳定性比较图。

图6为Fc、S23蛋白热稳定性比较图。

图7为Fc、S23蛋白抗聚集性比较图。

图8为Fc、S23蛋白抗聚集性实验中蛋白分子存在形式比较图。

图9为Fc、S23蛋白与Fc受体(FcγRI)结合后的流式图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：扩增Fc、S23片段基因

采取人源血样，用Trizol Reagent(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，得到的细胞总RNA溶解于50μL无RNA酶的水中。然后用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)，采用随机引物，逆转录得到cDNA。

根据IgG的Fc的基因序列(GenBank:KJ905798.1)，分析其氨基酸序列，设计Fc基因的正、反向引物扩增目的片段：正向引物5-GACGCGGCCCAGCC G GCCGCACCTGAA CTCCTGGGGGGA C-3，(横线标注为Sfi I酶切位点)；反向引物5-GCCCTC C TCGAG TCA TTT ACCCGG AGA CAG GGA G-3，(横线标注为Xho I酶切位点)。先用正向引物与反向引物以cDNA为模板进行PCR，得到Fc基因片段，再利用点突变试剂盒将Fc片段四个氨基酸突变成半胱氨酸，得到S23基因片段(基因序列为Seq ID No.2，氨基酸序列为Seq ID No.1)。

琼脂糖凝胶电泳回收Fc、S23基因片段，用Sfi I和Xho I酶切Fc、S23基因和载体Psectag2A，胶回收后将Fc、S23基因与载体Psectag2A连接、转化E.coli Top10感受态，随后挑取单克隆送测序。根据测序结果，挑取序列正确的单克隆用于后续实验。

实施例2:表达并纯化Fc、S23

将Fc、S23质粒各40ug利用PEI(2mg/mL PEI)(Polyethylenimine“Max”,(Mw 40,000)-High Potency Linear PEI,Polysciences,Inc.,Catalog No.:24765-2,2g)转染293F细胞，分别用293F表达培养基(invitrogen)40ml于37℃、150rpm摇床培养6天。

随后，离心(6000g，4℃，15min)收集293F细胞上清(上清以鼠抗人IgG Fc为第一抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗为进行蛋白免疫印迹检测，结果如图1所示，泳道1：Marker；泳道2：Fc细胞上清；泳道3：S23细胞上清。从图中明显可见Fc、S23蛋白的表达)，将收集的上清过滤后，用Protein G填料(GE公司)纯化Fc、S23蛋白。随后用截留分子量为10kD的超滤离心管(Merck Millipore公司)超滤浓缩该目的蛋白，经SDS-PAGE验证其纯度，结果如图2所示，泳道2为Fc片段、泳道3为S23片段。

实施例3：Fc、S23存在形式与分子构象

AKTA分析Fc、S23存在形式：将纯化后的Fc、S23蛋白浓缩到1mg/ml，PBS(pH7.4)为洗脱缓冲液，过Column Superdex 75Increase 10/300 GL，其中，流速为0.5ml/min，进而对其存在形式进行检测，如图3，对照标准曲线可以发现，这两者蛋白分子量约为56kDa，结果表明它们以二聚体形式存在。

CD检测蛋白分子构象：将Fc、S23蛋白稀释到50ug/ml，PBS(pH7.4)为对照，在近紫外端(波长λ＝190nm～260nm)不同波长条件下检测其圆二色性，进而分析蛋白二级结构，通过Column Superdex 75Increase 10/300 GL(GE公司)进行分析，对照标准曲线可以发现，这两者蛋白分子量约为56kDa，结果如图4所示，在λ＝218nm处有一个明显波谷，表明上述蛋白二级结构为β-折叠。

实施例4：Fc、S23稳定性与抗聚集性比较

变性剂条件下稳定性分析：配置浓度为0M到10M的尿素溶液，浓度梯度为0.5M，共21个样品；然后将Fc、S23蛋白加入不同浓度梯度的尿素溶液中室温过夜处理，体积为200ul，Fc、S23蛋白终浓度均为100ug/ml。随后，用荧光检测仪器在280nm激发，340nm处检测各个样品荧光强度，结果如图5，从图中可以发现相比Fc，S23的荧光信号下降趋势更缓慢，表明S23在变性剂条件下更加稳定。

热稳定性分析：利用圆二色谱仪比较Fc、S23蛋白(50ug/ml)热稳定性，PBS溶液为空白对照，设置温度梯度条件为每2min升高1℃，终止反应温度为94℃，每30s在波长λ＝218nm处检测并记录数据，如图6所示，分析在不同温度下检测其左右圆偏振光的摩尔吸光系数之差，进而比较其热稳定性差异，可以发现修饰改造后的S23的热稳定性比Fc高很多。

抗聚集性分析：

a)将Fc、S23蛋白终浓度调整为2mg/ml，在60℃水浴锅处理，每隔一定时间取样，在λ＝320nm处检测吸光度并记录数据，其中，PBS溶液为空白对照，比较Fc、S23蛋白的抗聚集性强弱，从图7中可以发现S23信号上升趋势较缓，表明其抗聚集能力更好。

b)将60度水浴锅处理551小时的Fc、S23蛋白样品经过13000rpm，4℃，15min离心，取上清过Column Superdex 75 Increase 10/300GL，其中，流速为0.5ml/min，进而对其存在形式进行检测。结果如图8，分析发现，此时Fc蛋白明显出现两个峰，一个聚集峰，一个二聚体峰，而S23则只有一个均一的二聚体峰，与刚表达纯化时的存在形式一样，说明蛋白没有出现聚集。

实施例5：流式细胞测定Fc、S23和FcγRI的结合

U937细胞表面会表达FcγRI，因此用流式细胞实验来比较Fc、S23蛋白与FcγRI亲和力。梯度稀释的Fc、S23蛋白与U937细胞(U937细胞表面会表达FcγRI)在4度孵育1小时。用培养基洗掉未结合蛋白。用荧光标记的羊抗人IgG Fc抗体(Sigma-Aldrich)作为二抗与细胞在4度孵育1小时。用1％PBSA清洗并重悬细胞，再将样品放置于流式细胞仪上(BectonDickinson)测定其结合力。图9中数据表明，经过修饰改造的S23依旧保持与FcγRI结合活性。

序列表

<110> 武汉班科生物技术股份有限公司

<120> 一种突变型人源IgG的Fc片段及其制备方法与应用

<130> 2017

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 217

<212> PRT

<213> S23

<400> 1

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ser Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Ser Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ser Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 2

<211> 651

<212> DNA

<213> S23

<400> 2

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttctgcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300

cccatcgagt gcaccatctc caaagccaaa gggcagtgcc gagaaccaca ggtgtacacc 360

ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

tgtctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

Claims (7)

1.一种突变型人源IgG的Fc片段，其特征在于：所述突变型人源IgG的Fc片段是通过在人源IgG的Fc片段的CH2结构域和CH3结构域中引入二硫键后获得。

2.根据权利要求1所述突变型人源IgG的Fc片段，其特征在于：所述突变型人源IgG的Fc片段的氨基酸序列中第242位、第334位、第343位和第431位的氨基酸为半胱氨酸。

3.根据权利要求2所述突变型人源IgG的Fc片段，其特征在于：所述突变型人源IgG的Fc片段的氨基酸全长序列为Seq ID No.1。

4.根据权利要求3所述突变型人源IgG的Fc片段，其特征在于：所述突变型人源IgG的Fc片段的编码基因序列为Seq ID No.2。

5.一种权利要求2所述突变型人源IgG的Fc片段的制备方法，其步骤如下：

(1)获取人源IgG的Fc片段的基因；

(2)设计引物将Fc中的指定氨基酸碱基突变成编码半胱氨酸的碱基，扩增出得到突变型Fc；

(3)以突变型Fc基因序列构建真核表达载体，转染哺乳动物细胞，进行真核表达，纯化得到目标Fc片段。

6.权利要求1所述突变型人源IgG的Fc片段在制备Fc融合蛋白中的应用。

7.权利要求1所述突变型人源IgG的Fc片段在制备单克隆抗体中的应用。