CN108204962B - 一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法 - Google Patents
一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，包括如下步骤：步骤（1）、样品采集；步骤（2）、稀释样品；步骤（3）、洗脱细胞；步骤（4）、收集滤液；步骤（5）、收集沉淀物；步骤（6）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的标定；步骤（7）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位鉴定；步骤（8）、盲肠蛋白质水解细菌的丰度的确定及统计分析。本发明较大地降低了劳动强度，成本较低，操作过程简便，实验结果准确无误，能迅速提供给饲养人员相关的信息和数据，缩短筛选优质饲料配方的过程，能快速提供給饲养人员肉鸡盲肠蛋白质降解细菌的信息和数据，为确定特殊的饲料配方，在特殊的饲养条件下对肉鸡的生产性能和健康的影响程度。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测蛋白质水解细菌的方法，一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法。
背景技术
肉鸡的肠道健康是肉鸡生长所必须的条件之一。肠道菌群的平衡对维持健康的肠道取着重要的功能。肠道内稳态紊乱会影响肠道功能和健康，导致生理失调，危害肉鸡健康并导致生长性能下降。对无菌肉鸡的研究显示，肠道微生物能够促进肠道成熟，提高机体免疫力，抑制病原菌，促进肉鸡生长，降解不易消化的食物，能够产生挥发性脂肪酸、维生素，因此肠道微生物在肠道发育及功能发挥方面具有重要的作用。
近年来，随着肉鸡饲养周期的逐年下降，目前肉鸡在5周内食用3.0公斤饲料后，鸡体重可达2.0公斤。快速增长的肉鸡生长速度与过去几十年来人们选择高转化率的饲粮蛋白质而导致的高采食量有关。在实际肉鸡的饲养过程中，饲粮配方中的高转化率蛋白质常常含有一定量未能消化的蛋白质，这部分蛋白质一旦进入肉鸡的盲肠，盲肠微生物菌群就利用它们作为降解的底物并产生能源来促进微生物菌群自身的增殖。近年来，由于需要向快速生长的肉鸡提供含有高转化率蛋白质的饲粮，因而导致了饲粮中未经消化的蛋白质流入盲肠进而发酵的数量增加，这部分蛋白质发酵的产物对肉鸡肠道健康的影响越来越受到关注。
在肉鸡的小肠和盲肠中，氨基酸和蛋白质的代谢机制是不同的。小肠中的微生物菌群与宿主竞争饲粮中的氨基酸，并吸收氨基酸合成自身新的细胞；盲肠微生物菌群则仅利用逃脱宿主消化的蛋白质和氨基酸。前期研究证明最优质的饲粮配方也不能保证所有的饲粮蛋白质都在小肠内被宿主吸收，总是有一部分蛋白质会逃脱宿主消化而流入盲肠，通过盲肠微生物进行分解发酵。一般来说，流入盲肠的蛋白质包括饲粮中的抗性蛋白质(不能被宿主蛋白酶或小肠细菌消化的蛋白质，其数量取决于饲粮蛋白质的原料或饲料加工质量)、微生物蛋白质(小肠乳酸杆菌和其他细菌竞争氨基酸，不可避免地吸收一些膳食氨基酸并利用它们进行合成代谢)和宿主合成和分泌的蛋白质(内源蛋白)。
现代肉鸡的饲养过程中，通过利用高转化率的饲粮蛋白质来提高肉鸡生长速度的同时，不仅要减少小肠微生物和宿主竞争营养物质，同时也要监控盲肠中的蛋白质的数量，以便及时调整饲粮的组成结构，降低因盲肠蛋白质代谢产生的有毒物质而导致宿主健康问题的风险。在饲粮蛋白质转化率较高的情况下，蛋白质容易消化，小肠中的微生物蛋白质保持最低量，用于防御的内源蛋白质的分泌物不应过高。一旦饲粮蛋白质脱离了宿主消化，并且不能用于宿主，未经消化的饲粮蛋白质进入盲肠，增加了蛋白质在盲肠的分解发酵水平，导致了盲肠蛋白质发酵产生的有毒代谢产物对肉鸡肠道后端的功能、肉鸡健康、肉鸡生产性能的负面影响。
由于饲粮是肠道微生物最重要的生长基质，饲粮的组成和消化率对肠道微生物群体有着重要影响。现代肉鸡的饲养不仅要求符合营养需要的饲粮配方，还要考虑利用饲粮配方的组成来调控微生物菌群的代谢活性对宿主健康和生产性能的影响。当饲粮中的淀粉和可发酵的碳水化合物有限或蛋白质丰富时，未经消化的饲粮蛋白质进入肉鸡盲肠通过盲肠中的致腐细菌进行发酵反应，盲肠蛋白质发酵产物除了包括对肉鸡生长有益的氨基酸、挥发性脂肪酸(VFA)和支链脂肪酸(BCFA)等产品之外，同时还产生许多有害和有毒的化合物，包括氨、生物胺、吲哚、酚、甲酚等。氨很容易被肉鸡从肠道吸收到血液中，对肠内细胞具有毒性作用；生物胺虽然参与到肠道细胞中的各种生理过程，但高浓度的生物胺会降低肉鸡的生长速度并增加肉鸡的死亡率，肉鸡盲肠蛋白质代谢的有毒产物最终降低了饲料转化率，对肉鸡的生长和性能产生不利影响。
为了降低盲肠中蛋白质发酵代谢产物-毒性的产生，近年来，国内外科学家开展了很多研究，主要集中在怎样通过改变肉鸡饲粮的配方来减少进入盲肠的饲粮中不能降解的蛋白质的总量：(1)促进小肠上段蛋白质的消化和增加抵抗回肠消化的可溶性碳水化合物的酶；(2)筛选使用各种不同的粗颗粒(600至900μm)饲料和/或使用饲料添加剂(例如益生菌和益生菌和有机酸，特别是丁酸)的饲料改善饲粮蛋白质消化；(3)筛选饲粮中最佳的可发酵的蛋白质和碳水化合物的比例，如果可发酵的碳水化合物不足，则可能发生盲肠蛋白质发酵，因为碳水化合物是盲肠微生物的优选能量来源；(4)筛选不同来源的蛋白酶在体外进行饲料预处理过程，提高肉鸡饲粮蛋白质的转化率。
一直以来，人们对将某些肉鸡盲肠功能菌群与肉鸡的健康和生产性能联系起来一直很感兴趣。现有的研究表明，通过特定的盲肠功能菌群来监控肉鸡肠道微生物菌群的变化，对维持肉鸡肠道健康进而提高肉鸡生产性能是有效的策略。由于肉鸡消化食糜在盲肠停留的时间最长，为微生物群体提供了稳定的环境，盲肠是饲粮中未经消化蛋白质发酵的主要场所。水解是蛋白质分解发酵的第一步，到目前为止，关于肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的信息很少，只有很少的纯培养研究结果揭示了盲肠中的蛋白质水解细菌包括乳酸菌属(Lactobacillus spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)和拟杆菌属(Bacteroides spp.)，梭菌属和肠球菌属的细菌参与氨的产生，拟杆菌属的细菌参与释放一些潜在的毒性的代谢产物，如生物胺，酚类和吲哚类，但是这些研究结果都没有在原位(insitu)(不需要通过纯培养分离菌株)状态下得到证实。由于盲肠中仅有20％的细菌能在培养基中生长，而且通过纯培养研究得到的微生物的生理生化信息不一定能反映微生物在复杂的生态***原位的作用和功能。
由于传统微生物纯培养技术的局限性，研究肉鸡盲肠微生物菌群的变化及探讨饲粮组成变化对盲肠微生物功能菌群的影响受到限制。而通过针对特定盲肠功能菌群调控整个肉鸡肠道菌群是维持肉鸡肠道健康进而提高肉鸡生产性能的有效策略。目前新一代DNA测序和生物信息学分析等新技术包括定量PCR、基于PCR的DNA图谱技术、流式细胞术、DNA测序、DNA微阵列和稳定同位素探针、Omics技术(包括宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学)等分子技术结合动物模型及生物信息学被广泛用于分析肉鸡盲肠功能菌群的组成和功能对肉鸡生产性能的影响。但是由于Omics技术过程复杂，费用昂贵，需要专业技能较强的操作分析人员，至今为止，并没有广泛应用于鉴定和定量肉鸡盲肠蛋白质水解细菌。
在优化肉鸡饲养过程中最重要的变量之一的饲粮配方时，由于研究方法的差异性和几十年来用于鉴定肉鸡盲肠功能细菌方法的不可比较性，研究结果出现了可变性和无比较性。
到目前为止，还没有一种有效、简便、容易操作的方法可以用来在原位状态下鉴定和定量肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，而肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的鉴定和定量可以间接用来监控肉鸡盲肠蛋白质发酵的水平，以便推测肉鸡盲肠蛋白质发酵对肉鸡生产健康和生产性能的影响,特别是对进一步优化不同的饲粮配方对肉鸡生产健康和生产性能的影响有着深远的意义。
发明内容
为了克服了现有的方法的不足，本发明提供一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，首先在原位状态下标定肉鸡盲肠蛋白质水解细菌，随后采用FISH(荧光原位杂交)回位鉴定肉鸡盲肠蛋白质水解细菌；最后通过DAPI染色回位定量肉鸡盲肠蛋白质水解细菌。可以快速获取肉鸡盲肠中的蛋白质水解细菌的组成和丰度的原位信息。
本发明的具体方案如下：
一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，包括如下步骤：
步骤(1)、样品采集：随机抽取试验鸡，屠宰后剖开鸡腹截取盲肠，清洗，剪开肠壁，刮取食糜样品并存于小烧杯中；
步骤(2)、稀释样品：称取大约10g步骤(1)的食糜样品，装入无菌过滤袋中，加入经预热的1×PBS缓冲液，混匀；
步骤(3)、洗脱细胞：将步骤(2)混匀的液体转入到BioRad匀浆袋中，在BioRad匀浆器高速档匀浆，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；
步骤(4)、收集滤液：匀浆过程完成后，用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌离心管中，离心；
步骤(5)、收集沉淀物：去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于1×PBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，待用；
步骤(6)、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的标定
取上述细胞悬浮液转入到血清瓶中，加1×Tris-HCl缓冲液，再加入BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白BSA，随后加入电子传递链抑制剂，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动一段时间；将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取混合液涂布于用明胶涂层的载玻片上，避光风干；将上述风干的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光，记录每一个淀粉降解细菌的位置；
步骤(7)、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位鉴定
清洗、干燥载玻片，采用寡聚核苷酸探针，使用FISH，在原位条件下回位鉴定肉鸡盲肠淀粉降解细菌，其中，寡聚核苷酸探针的5’末端采用Cy3染料标记，得到淀粉降解菌的位置；
观察和拍照，根记录的淀粉降解细菌的位置回位到同一个视野下，通过Cy3激发快观察FISH染色图像，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌，被绿色荧光淀粉染亮的细菌同时又被寡聚核苷酸探针染亮说明以上述寡聚核苷酸探针为靶标的细菌具有在肉鸡盲肠中具有水解淀粉的功能；
步骤(8)、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位定量
清洗、干燥载玻片，用取一定量的DAPI的染液覆盖于风干的载玻片***，将载玻片上的DAPI染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20-30min，将染液倒去，并用蒸馏水小心冲洗2-3遍，避光并在无菌操作箱中风干，即可在显微镜下镜检；
将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的蛋白质降解细菌的位置回到同一个视野下，通过DAPI激发快观察DAPI染色图像，通过兰色荧光激发块观察所有细菌；
步骤(9)、盲肠蛋白质水解细菌的丰度的确定及统计分析
进一步地，步骤(1)之前还包括试验鸡的饲养，其中，饲养期包括前期和后期，饲养前期饲料配方如下：
饲料配方包括：玉米55-60％、玉米豆粕25-30％、玉米蛋白粉4-6％、鱼粉2-4％、大豆油1-3％、磷酸氢钙1-2％、细石粉1-2％、粗石粉0.01-0.05％、食盐0.1-0.5％、蛋氨酸0.1-0.2％、赖氨酸0.1-0.2％、预混料为0.8-1％；饲料营养水平如下：
ME 3000-3100％、CP 20-25％、Ca1-1.5％、P 0.5-1％、AP0.3-0.5％、NaCL0.3-0.5％、Lys 1-1.5％、Met 0.3-0.5％、Thr 0.5-1％、Trp 0.2-0.4％、Arg 1-1.1％；
饲料还包括益生元，益生元为菊粉10-40g/Kg和/或溶菌酶40-200mg/Kg。
进一步地，饲养后期饲料配方如下：
饲料配方的范围包括：玉米60-65％、玉米豆粕20-25％、玉米蛋白粉6-8％、鱼粉0.01-0.05％、大豆油3-5％、磷酸氢钙1-2％、细石粉0.5-1％、粗石粉0.3-0.6％、食盐0.1-0.5％、蛋氨酸0.01-0.1％、赖氨酸0.1-0.2％、预混料为0.8-1％；饲料营养水平如下：
ME 3100-3200％、CP 20-25％、Ca1-1.5％、P 0.7-1.2％、AP0.3-0.5％、NaCL0.3-0.5％、Lys 1-1.5％、Met 0.3-0.5％、Thr 0.5-1％、Trp 0.2-0.4％、Arg 1-1.2％。
饲料还包括益生元，益生元为菊粉10-40g/Kg和/或溶菌酶40-200mg/Kg。
进一步地，步骤(6)中，电子传递链抑制剂为叠氮化钠3mM、氟乙酸钠2mM和碘代乙酰胺钠4mM，按照总反应体积600μL计算。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明从肉鸡盲肠生态***混合微生物群落中回位鉴定和回位定量肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，和以前的纯培养方法、宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白组方法比较，较大地降低了劳动强度，成本较低，操作过程简便，操作人员不需要接收特殊的培训，对检测的地点无特殊的要求，实验结果准确无误，能迅速提供给饲养人员相关的信息和数据，缩短筛选优质饲料配方的过程，能快速提供給饲养人员肉鸡盲肠蛋白质降解细菌的信息和数据，为确定特殊的饲料配方，在特殊的饲养条件下对肉鸡的生产性能和健康的影响程度，并为饲养人员做出正确的决定提供快速准确的相关的数据。
附图说明
图1是本发明的快速检测肉鸡盲肠蛋白质降解细菌的方法流程图；
图2A和图2B是在同一个视野下采用不同的荧光激发块拍摄的图片，图2A中箭头所指示的细菌是在FITC荧光激发块条件下拍摄的被BODIPY小牛血清白蛋白(BSA)染液染亮的肉鸡盲肠蛋白质降解细菌，图2B中箭头所指示的细菌和图2A中箭头所指示的细菌是在同一个视野下拍摄的相同的细菌，图2B中箭头所指示的细菌在Cy3荧光激发块条件下拍摄FISH图片；
图3为饲料中菊粉和溶菌酶的添加对肉鸡盲肠蛋白质水解细菌相对丰度的影响。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、分析化学技术及相关领域的常规技术。
实施例1
实施方案：
1、实验试剂、仪器、设备
1.1实验试剂
1×PBS缓冲液(pH 7.0)、1×Tris-HCl缓冲液(10mM,pH 7.8)、BODIPY(boron-dipyrromethene)标记的绿色荧光淀粉染液、叠氮化钠100mM、氟乙酸钠100mM、碘代乙酰胺钠100mM、蒸馏水、超纯水、5mgDAPI、无水乙醇、明胶、十二水硫酸铬钾，洗洁精。
1.2实验仪器与设备
载玻片、载玻片架、载玻片盒、洗液瓶、试管架、移液枪、烧杯、匀质器、胶头滴管、煮锅、磁力震荡加热器，温度计、盒装铝箔、10ml的宽底血清瓶、50ml离心管、2mL eppendof离心管、BioRad匀浆袋、药勺、保温瓶、无菌收集袋、玻棒、广口瓶、莱卡荧光显微镜、eppendof离心机、BioRad匀浆机、旋转摇床。1.3实验药品配制
1.3.1：BODIPY(boron-dipyrromethene)标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液：
配制的过程根据DQTM BSAs:Self-Quenched
Dye Conjugates ofBovine Serum Albumin Kit[购自Thermo Fisher Scientific]中描述的方法进行；1.3.2：寡聚核苷酸探针：
本次实验中所有寡聚核苷酸探针配制的浓度和过程都是根据上海生工提供的数据和方法进行；如表1所示：
表1用于探测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的16S rRNA靶序列核苷酸探针及杂交液浓度
1.3.3：DAPI染液：
加5mgDAPI溶于1ml蒸馏水中:从5mg/ml的DAPI染液中取3ul加入到2997ul超纯水中，配制成最终浓度为0.005mg/ml的DAPI染液，储藏于5ml离心管中，混匀冷藏，避光待用。
2、检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌
如图1所示，本实施例的快速检测肉鸡盲肠蛋白质降解细菌的方法具体包括如下步骤：
2.1肉鸡的饲养
选取588羽1日龄狄高肉仔鸡随机分为七组，每组6个重复，每个重复14羽。各处理组之间鸡只平均始重(AIW)差异不显著(P>0.05)。试验采用封闭式鸡舍3层笼养，每笼7只鸡，室内温度按狄高肉鸡饲养标准控制。试验期42d，分前期(0～21d)和后期(22～42d)2个阶段饲养。试验1组是空白对照组饲喂基础日粮(表一)，试验2、3和4组是在基础日粮的基础上添加10、20、40g/kg菊粉；试验5、6和7组是在基础日粮的基础上添加40、100、200mg/kg溶菌酶；试验全程为42天。前期的饲料和后期饲料的成分及含量如表2所示：
表2狄高鸡的基础日粮组成及营养水平
2.2制作明胶涂片
在载玻片上覆上一层明胶的方法的目的是让样品均匀地分散和固定在载玻片上，使得肉鸡盲肠食糜样品在染色过程中不会从载玻片上脱落。取7个载玻片架，将载玻片填满于载玻片架中。用锅装3.5升蒸馏水，在水中加入4-5滴洗涤剂，放入载玻片架，煮沸约10分钟。10分钟后取出载玻片架，晾3分钟，然后用蒸馏水将洗涤剂冲洗干净，将载玻片保持直立状态晾干。在另外一口锅中加入3.5升蒸馏水，在水中加入2.5g的十二水硫酸钾铬和0.44g的明胶，加热至70℃左右，待明胶基本溶解后放入载玻片架，煮大约10分钟，温度控制在70℃，10分钟后取出载玻片架，将载玻片斜立于试管架边上，让它干燥，干燥后可以看到载玻片上均匀的覆上一层透明薄膜状的明胶。
2.3在无菌条件下收集肉鸡盲肠食糜中的总细菌
第一步、样品采集：试验分别进行至9d、16d、30d、42d，在各重复中随机抽取试验鸡各4羽，屠宰后用无菌的手术剪剖开鸡腹截取盲肠，将经37℃预热的0.9％Nacl溶液倒在一个500ml的无菌烧杯中，将鸡盲肠用无菌镊子夹住，在0.9％Nacl溶液中轻轻涮洗2-3次，将附着在肠壁上的血渍清洗干净。将清洗干净的盲肠放在灭菌锡纸上，用无菌手术剪剪开肠壁，用无菌的药勺刮取食糜样品并存于小烧杯中；
第二步、稀释样品：称取大约10g新鲜食糜，装入无菌过滤袋中，加入40毫升经37℃预热的1×PBS缓冲液(pH 7.0),混匀；
第三步、洗脱细胞：将混匀的液体转入到BioRad匀浆袋中，在BioRad匀浆器高速档匀浆8分钟，速度4，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；
第四步、收集滤液：匀浆过程完成后,用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌的50ml离心管中，离心10分钟(37℃、1000rpm)；
第五步、收集沉淀物(细菌细胞)：将上清液收集在10mL螺口离心管中，离心10分钟(37℃、8000rpm)，去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于5ml的1×PBS缓冲液(pH7.0)中，待用。在等待下一步的实验过程中，可将细胞悬浮液储存于4度的冰箱中。
2.4肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的标定
第一步、取100μL上述细胞悬浮液转入到10ml的宽底棕色的血清瓶中，加入300μL1×Tris-HCl缓冲液(10mM,pH 7.8)，再加入大约200μL BODIPY(boron-dipyrromethene)标记的绿色荧光小牛血清白蛋白BSA[购自ThermoFisher Scientific]，随后加入3种电子传递链抑制剂，电子传递链抑制剂为叠氮化钠、氟乙酸钠和碘代乙酰胺钠，浓度分别为3mM,2mM,4mM，按照总反应体积600μL计算，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；
第二步、将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动30分钟，速度保持在220r.p.m；
第三步、将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取10μL均匀涂布于用明胶涂层的载玻片上，并在黑暗的环境中风干20分钟，整个过程需要避光；
第四步、将干燥好的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，蛋白质降解细菌呈现绿色荧光,记录每一个蛋白质降解细菌的位置，如图2(A)所示。
2.5肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位鉴定
第一步、将载玻片从荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡DFC500数字照相机)载物台移到桌面上，轻轻移走盖玻片，轻柔用70％的酒精冲洗载玻片3分钟，将载玻片置于50％的酒精中浸泡4小时，将载玻片置于室温下干燥。
荧光原位杂交技术(FISH)的操作过程按照Amman(1995)描述的方法进行。在总结了现有的关于肉鸡盲肠蛋白质降解菌群纯培养研究的参考文献之后，我们搜集并采用了表二中的寡聚核苷酸探针来进行回位鉴定肉鸡盲肠蛋白质水解细菌。
所有的寡聚核苷酸探针均购置于上海生工，如表1所示，并在5’末端采用Cy3染料标记，所有寡聚核苷酸探针的甲胺浓度(％)均来自于Probe-Base网站(http://131.130.66.201/probebase_old/search.asp)。
FISH的操作步骤简述如下：将上述处理好的载玻片依次放入浓度为50％、80％、100％乙醇溶液中脱水3min，室温风干；按各个寡聚核苷酸探针的甲胺浓度分别配制杂化液和洗脱液，杂化液和洗脱液的配制过程也是根据Amman(1995)描述的方法进行；将配制好的洗脱液放入温度为48度的水浴锅中预热。在处理好的载玻片上滴加32μL配制好的杂化液和4μL探针(对于混合探针每种探针加入4μL)，立即将载玻片转入预热到46℃的培养箱中杂交3h；将载玻片取出，立即放入预热至48℃的洗脱液中洗脱15min(不同的探针对应不同浓度的洗脱液)，后用蒸馏水清洗3次，避光晾干备检。
第二步、将干燥好的载玻片置于荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡DFC500数字照相机)物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的蛋白质降解细菌的位置回位到同一个视野下，FISH染色图像通过Cy3激发快观察，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌(如图2(B))。被绿色荧光小牛血清白蛋白BSA染亮的细菌同时又通过FISH被表二中特殊的寡聚核苷酸探针染亮，就说明以这个特殊的寡聚核苷酸探针为靶标的细菌具有在肉鸡盲肠中水解蛋白质的功能。
2.6肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位定量
第一步、将载玻片从荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡DFC500数字照相机)载物台移到桌面上，轻轻移走盖玻片，轻柔用70％的酒精冲洗载玻片3分钟，将载玻片置于50％的酒精中浸泡4小时，将载玻片置于室温下干燥，用移液枪取80ul DAPI(0.005mg/ml)的染液覆盖于风干的载玻片***，用枪头将载玻片上的DAPI染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20-30min(由于DAPI的荧光会淬灭，因此染色时应避光),将染液倒去，并用蒸馏水小心冲洗2-3遍(每次1分钟)，避光并在无菌操作箱中风干20分钟,即可在显微镜下镜检；
第二步、将干燥好的载玻片置于荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡DFC500数字照相机)物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的蛋白质降解细菌的位置回到同一个视野下，DAPI染色图像通过DAPI激发快观察，通过兰色荧光激发块观察所有细菌。
2.7肉鸡盲肠蛋白质水解细菌丰度的确定
为了定量肉鸡盲肠蛋白质水解细菌丰度，每个样品至少需要采集30套(每套数据图片包括一张绿色荧光BSA染色图片和一张DAPI染色图片)数据图片。肉鸡盲肠蛋白质降解细菌的丰度采用图像分析软件ImageJ分别分析同一套数字图片中的绿色荧光BSA染色阳性蛋白质降解细菌的数量和DAPI染色阳性的细胞数(微生物总数)的数量来确定。绿色荧光BSA染色细胞采用ImageJ中提供的手动计数法计数，DAPI染色细胞采用自动计数法计数。盲肠蛋白质降解细菌的丰度为被绿色荧光BSA染色的细胞数占细胞总数的百分比，即：
蛋白质水解细菌的丰度＝绿色荧光蛋白质染色的细胞数/细胞总数×100％。2.8统计分析
t检验和方差分析均在excel中完成。
2.9结果与分析
如图2所示，图2(A)和图2(B)中箭头所指示的细菌是在同一个视野下采用不同的荧光激发块拍摄的图片，图2A中箭头所指示的细菌是在FITC荧光激发块条件下拍摄的被BODIPY小牛血清白蛋白(BSA)染液染亮的肉鸡盲肠蛋白质降解细菌，图2B中箭头所指示的细菌和图2A中箭头所指示的细菌是在同一个视野下拍摄的相同的细菌，图2B中箭头所指示的细菌在Cy3荧光激发块条件下拍摄FISH图片，即在FISH过程中图A中的被BODIPY(BSA)染液染亮的盲肠蛋白质降解细菌同样也被寡聚核苷酸探针Bdis656染亮。
通过FISH进行回位鉴定后，我们发现以大部分梭菌为靶标微生物的寡聚核苷酸探针Chis150；以拟杆菌为靶标微生物的寡聚核苷酸探针Bdis656；以台湾乳杆菌为靶标微生物的寡聚核苷酸探针Lab9057_570都染亮了绿色荧光小牛血清白蛋白BSA标定的肉鸡盲肠蛋白质水解细菌，确定了梭菌属、拟杆菌属、乳杆菌属的细菌都参与了肉鸡盲肠中的蛋白质降解过程；根据图片计数的结果，以拟杆菌为靶标微生物的寡聚核苷酸探针Bdis656，通过FISH染亮了大部分绿色荧光小牛血清白蛋白BSA标定的肉鸡盲肠蛋白质水解细菌，而以大部分梭菌为靶标微生物的寡聚核苷酸探针Chis150和以台湾乳杆菌为靶标微生物的寡聚核苷酸探针Lab9057_570，只染亮了小部分的绿色荧光小牛血清白蛋白BSA标定的肉鸡盲肠蛋白质水解细菌；因此拟杆菌是狄高肉仔鸡盲肠蛋白质水解过程中的主要功能菌群。
我们同时测定了对照组和六个不同的处理组的肉鸡盲肠蛋白质水解细菌在42天饲养周期中丰度的变化，如图3所示，结果显示：
对照组和添加菊粉的试验2、3和4组，肉鸡的盲肠蛋白质水解细菌的丰度都出现了增加的趋势。对照组的增加量较小，从2.7％增加到6.5％。添加菊粉的试验2、3和4组是在基础日粮的基础上添加10、20、40g/kg菊粉，对比对照组的肉鸡，均较大的促进了盲肠蛋白质水解细菌的丰度的增加量，分别从从3％增加到12.7％；从2.1％增加到31％；从3.8％增加到11.5％；相反在添加溶菌酶的试验5、6和7组，是在基础日粮的基础上添加40、100、200mg/kg溶菌酶，均出现了盲肠蛋白质水解细菌的丰度下降的趋势，分别从从3％下降到1％；从3％下降到1.4％；从3.2％下降到1.8％。我们的结果指出：添加不同种类的益生元(例如：溶菌酶和菊粉)导致了盲肠蛋白质水解细菌的丰度变化的差异性；添加不同浓度的相同种类的益生元(例如：菊粉)也导致了盲肠蛋白质水解细菌的丰度增加的差异性，因此在肉鸡饲养过程中，在添加不同种类的益生元，或者添加相同种类的不同浓度的的益生元的条件下，原位定量监控盲肠淀粉水解细菌丰度的变化具有重要的意义。
另外，我们发现对照组和6个试验组的盲肠蛋白质水解细菌的组成是一致的，说明益生元(菊粉和溶菌酶)的添加并没有改变肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的组成。早期的纯培养研究已经证实了肉鸡盲肠蛋白质水解细菌主要包括梭菌属、拟杆菌属和乳杆菌属等菌群，而我们在原位条件下获得的研究结果也再次验证了纯培养研究的结果。
以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (4)
1.一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，用于提供给饲养人员肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的信息和数据，以确定饲料配方，其特征在于：包括如下步骤：
步骤（1）、样品采集：试验分别进行至9 d、16 d、30 d、42 d，在各重复中随机抽取试验鸡，屠宰后用无菌的手术剪剖开鸡腹截取盲肠，将经预热的0.9%Nacl溶液倒在无菌烧杯中，将鸡盲肠用无菌镊子夹住，在0.9%Nacl溶液中轻轻涮洗2-3次，将附着在肠壁上的血渍清洗干净；将清洗干净的盲肠放在灭菌锡纸上，用无菌手术剪剪开肠壁，用无菌的药勺刮取食糜样品并存于小烧杯中；
步骤（2）、稀释样品：称取大约10 g 步骤（1）的食糜样品，装入无菌过滤袋中，加入经预热的1×PBS缓冲液，混匀；
步骤（3）、洗脱细胞：将步骤（2）混匀的液体转入到BioRad 匀浆袋中，在BioRad匀浆器高速档匀浆，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；
步骤（4）、收集滤液：匀浆过程完成后，用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌离心管中，离心；
步骤（5）、收集沉淀物：去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于1×PBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，待用；
步骤（6）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的标定
取上述细胞悬浮液转入到血清瓶中，加1×Tris-HCl缓冲液，再加入BODIPY 标记的绿色荧光小牛血清白蛋白BSA，随后加入电子传递链抑制剂，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动一段时间；将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取混合液涂布于用明胶涂层的载玻片上，避光风干；将上述风干的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，蛋白质水解细菌呈现绿色荧光，记录每一个蛋白质水解细菌的位置；
步骤（7）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位鉴定
清洗、干燥载玻片，采用寡聚核苷酸探针，使用FISH，在原位条件下回位鉴定肉鸡盲肠蛋白质水解细菌，其中，寡聚核苷酸探针的5’末端采用Cy3染料标记，得到蛋白质水解细菌的位置；
观察和拍照，根据记录的蛋白质水解细菌的位置回位到同一个视野下，通过Cy3激发快观察FISH染色图像，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌，被绿色荧光蛋白质染亮的细菌同时又被寡聚核苷酸探针染亮说明上述寡聚核苷酸探针为靶标的细菌在肉鸡盲肠中具有水解蛋白质的功能；
步骤（8）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位定量
清洗、干燥载玻片，用取一定量的DAPI的染液覆盖于风干的载玻片***，将载玻片上的DAPI 染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20-30min，将染液倒去，并用蒸馏水冲洗2-3遍，避光并在无菌操作箱中风干，即可在显微镜下镜检；
将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的蛋白质水解细菌的位置回到同一个视野下，通过DAPI激发快观察DAPI染色图像，通过兰色荧光激发块观察所有细菌；
步骤（9）、盲肠蛋白质水解细菌的丰度的确定及统计分析。
2.根据权利要求1所述的快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，其特征在于：步骤（1）之前还包括试验鸡的饲养，其中，饲养期包括前期和后期，饲养前期饲料配方如下：
饲料配方包括：玉米 55-60%、玉米豆粕 25-30%、玉米蛋白粉 4-6% 、鱼粉 2-4%、大豆油 1-3% 、磷酸氢钙 1-2% 、细石粉 1-2% 、食盐 0.1-0.5% 、蛋氨酸 0.1-0.2% 、赖氨酸0.1-0.2%、预混料为0.8-1%；饲料营养水平如下：
CP 20-25%、Ca 1-1.5%、P 0.5-1%、AP 0.3-0.5%、NaCl 0.3-0.5%、Lys 1-1.5%、Met0.3-0.5%、Thr 0.5-1%、Trp 0.2-0.4%、Arg 1-1.1%、ME 3000-3100，单位为KC/kg；
饲料还包括益生元，益生元为菊粉10-40g/Kg和/或溶菌酶40-200mg/Kg。
3.根据权利要求2所述的快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，其特征在于：饲养后期饲料配方如下：
饲料配方的范围包括：玉米 60-65%、玉米豆粕 20-25%、玉米蛋白粉 6-8%、大豆油 3-5% 、磷酸氢钙 1-2% 、细石粉0.5-1% 、粗石粉0.3-0.6%、食盐 0.1-0.5% 、蛋氨酸 0.01-0.1% 、赖氨酸 0.1-0.2%、预混料为0.8-1%；饲料营养水平如下：
CP 20-25%、Ca1-1.5%、P 0.7-1.2%、AP0.3-0.5%、NaCl 0.3-0.5%、Lys 1-1.5%、Met0.3-0.5%、Thr 0.5-1%、Trp 0.2-0.4%、Arg 1-1.2% 、ME 3100-3200 KC/kg；
饲料还包括益生元，益生元为菊粉10-40g/Kg和/或溶菌酶40-200mg/Kg。
4.根据权利要求1所述的快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，其特征在于：
步骤（6）中，电子传递链抑制剂为叠氮化钠3mM、氟乙酸钠2mM和碘代乙酰胺钠4mM，按照总反应体积600μL计算。
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Effective date of registration: 20200901 Address after: 650214 Kunming economic and Technological Development Zone, Yunnan Pu Road, No. 2 Applicant after: KUNMING University Address before: 650118 No. 2 Pu Xin Road, Kunming economic and Technological Development Zone, Yunnan, China Applicant before: Xia Yun |
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20201009 Termination date: 20211214 |