CN108203695A - 一株杜鹃花类菌根真菌功能菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株杜鹃花类菌根真菌功能菌株及其应用。一株杜鹃花类菌根真菌功能菌株14‑16，属于子囊菌门（Ascomycota）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、黏毛菌科（Myxotrichaceae），该菌株于2017年6月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60282。本发明从野生蓝莓根系分离出菌株14‑16，将其接种至栽培品种蓝莓“蓝雨”的根系后，能侵染蓝莓毛根，并在根表皮细胞形成典型的菌丝圈结构；此外，通过接种试验表明，菌株能显著促进栽培蓝莓地上部的生长，具有较好的应用前景。

Description

一株杜鹃花类菌根真菌功能菌株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一株杜鹃花类菌根真菌功能菌株及其应用。

背景技术

蓝莓，学名越橘，为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）多年生灌木，是一种具有较高经济价值和广阔开发前景的新兴小浆果树种。目前，蓝莓在我国的发展十分迅速，但对于商业化栽培的蓝莓品种，对土壤条件要求较严格，栽培难度较大，国内在蓝莓的栽培中有不少失败案例。

菌根真菌（Ericoid mycorrhizal fungi, EMF）是一类能与植物根系形成一种特殊共生联合体的土壤真菌，实际上这种共生也可以认为是一种特殊的寄生现象，只是这种寄生的程度两者达到了高度的平衡。其中，有一些真菌对一种植物来说是共生的，而对另一种植物则是严重致病性的。另外，有研究表明，有些互利共生关系的菌根真菌可在侵染植物根系后，能提高植物对土壤中营养的吸收，提高植物对土壤中可溶性无机N、P的吸收和有机或者难溶N、P复合物的利用，提高植物幼苗的生长能力和质量。

因此高效菌根真菌的筛选与应用对于蓝莓栽培发展具有重要意义，发展应用菌根真菌一方面，能增强蓝莓抗逆性和养分吸收能力，从而提高栽培引种成功率；另一方面，菌根真菌可与适宜有机肥复配，形成功能性的生物有机肥，能减少化学肥料的施用量，对农业的可持续发展和生态环境保护有重要作用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，从野生蓝莓根系中分离筛选得到一株杜鹃花类菌根真菌，该菌株能侵染蓝莓毛根，并在根表皮细胞形成典型的菌丝圈结构；而且可显著促进栽培蓝莓地上部的生长。

本发明的第一个目的是提供一株新型杜鹃花类菌根真菌功能菌株14-16。

本发明的第二个目的是提供所述杜鹃花类菌根真菌功能菌株14-16在蓝莓栽培中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种蓝莓生长促进剂。

本发明的第四个目的是提供一种适用于蓝莓的生长促进肥。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一株杜鹃花类菌根真菌功能菌株14-16，属于子囊菌门(Ascomycota)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、黏毛菌科(Myxotrichaceae)、Oidiodendron sp.，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017 年6月1日，保藏编号为GDMCC No.60282，生物材料保藏分类命名为Oidiodendron sp.。

该菌株是通过真菌纯培养物形态学、分子手段和回接蓝莓根系侵染形态观察三种方法联合鉴定，从野生蓝莓根系中分离筛选得到。该菌株生物学特征为：丝状真菌，不产孢，菌丝有隔；在PDA平板上，菌落形态为圆形、扁平、全缘，颜色呈白色，毡状；该菌株纯培养条件下生长缓慢，最适生长温度为28℃，最适生长pH 6.0。

该菌株能侵染蓝莓毛根，并在根表皮细胞形成典型的菌丝圈结构；而且可显著促进栽培蓝莓地上部的生长。

因此，所述的杜鹃花类菌根真菌功能菌株14-16在蓝莓栽培中的应用也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述应用为促进蓝莓地上部的生长。

优选地，所述应用为提高生长量。

一种蓝莓生长促进剂，所述杜鹃花类菌根真菌功能菌株14-16或其代谢产物也在本发明的保护范围之内。

一种适用于蓝莓的生长促进肥，含有所述杜鹃花类菌根真菌功能菌株14-16或其代谢产物，还含有有机肥也在本发明的保护范围之内。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明从野生蓝莓根系分离出能菌株14-16，将其接种至栽培品种蓝莓“蓝雨”的根系后，能侵染蓝莓毛根，并在根表皮细胞形成典型的菌丝圈结构；此外，通过接种试验表明，菌株能显著促进栽培蓝莓地上部的生长，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明菌株Oidiodendron sp. strain 14-16侵染蓝莓根系表皮细胞菌丝圈照片。

图2为本发明菌株Oidiodendron sp. strain 14-16菌落形态。

图3为本发明菌株Oidiodendron sp. strain 14-16及相近菌株的***进化树；NJ树；只显示>50%的bootstrap系数。

图4为接种菌株Oidiodendron sp. strain 14-16及不接种对照培养6个月后蓝莓植株地上部和地下部生物量比较。

图5为接种菌株Oidiodendron sp. strain 14-16及不接种对照培养6个月后蓝莓植株总生物量比较。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 杜鹃花类菌根真菌菌株14-16的分离与筛选

1、菌株分离

采样地点为中国西南地区，云南省丽江市、玉龙纳西族自治县、鲁甸乡、三家村。立地类型为山地类型，土壤类型为森林土壤，地理范围N26°45′58″~N27°14′45″、E99°34′37″~E100°17′46″，海拔范围为2016 m~2647 m。采集样品为野生蓝莓云南越桔（V.duclouxii(Lev.l) Hand.-Mazz.）和乌鸦果（V.fragile Franc-h.）附土根系。

带回实验室后，根样先用自来水冲洗1h，在超净工作台中用30% H₂O₂处理5~7分钟进行表面灭菌，然后用无菌水清洗2次，毛根切成1~2 mm长的根段；将根段放到足量的PDA（内含有0.03 g·L^-1链霉素）平板上，每皿放置5个根段，放在25℃的培养箱中进行黑暗培养。每株植株根样培养15皿。培养2~4周后，待菌落从根段中长出，并用挑针挑取菌落边缘菌丝至新的PDA平板中进行纯化培养，直至菌落单一。

2、菌株筛选

利用纯培养菌根再合成鉴定进行菌株筛选：

（1）供试植株：用于纯培养菌根再合成的植株通过植物组织培养方法获得，品种为南高丛蓝莓“蓝雨”，诱导得到生根苗后作为供试植株。

（2）单菌落菌株液体菌剂：培养基为液体PDA培养基，将在平板上培养4周的单菌落分别接种到三角瓶中后，放置到摇床上进行摇菌，控温25℃，150 r·min^-1，摇2周。

（3）纯培养菌根合成试验过程：在超净工作台上，将摇好的单菌落菌液接种到瓶内生根苗中，菌液与蓝莓组培培养基体积比为1:3，共接5棵蓝莓苗，接种完成后25℃下培养2周。

（4）菌株侵染蓝莓根系检测

用改良的台盼蓝染色法进行染色，并且用光学显微镜观察根段是否有菌丝侵染及侵染的根表皮细胞内有无菌丝圈产生。具体过程如下：

1）取材：从培养瓶中取出幼苗将其根系剪下，冲洗干净，切成l cm左右的根段。

2）固定：将根段放入FAA固定液进行固定，在10℃左右温度下，可以长期保存（每100 mL的FAA固定液配方：38%的甲醛溶液5 mL+乙酸5 mL+50%的酒精90 mL）。

3）透明处理：用5% KOH处理固定好已洗净的根段，置于60℃水浴锅中处理30 min。用清水清洗根样后，浸入1% HCl中3~4 min，进行酸化处理，也可不经酸化，用蒸馏水清洗，直接染色。

4）台盼蓝染色：将上述处理样根投入0.2%的台盼蓝染液（每1000 mL 0.2%的台盼蓝染色液配方：300 mL乳酸+300 mL甘油+400 mL水+2.15 g台盼蓝+350 g苯酚）中，水浴锅加热至60℃恒温，持续30 min。

5）脱色：将染色后的根样取出，吸干表面染液后投入乳酸甘油中浸泡过夜，乳酸甘油体积比为1: 1。

6）制片：在洁净载玻片上滴一滴甘油，将脱好色的根端取出，用镊子将其放在载玻片上（30~40根）盖上盖片后轻轻压，使根舒展并挤出气泡。

7）镜检：选取60条根段，长度都约为1 cm，观察根段有无侵染及侵染的根表皮细胞内有无菌丝圈产生。

3、结果

根据纯培养菌根再合成试验结果，筛选有能力侵染蓝莓根系，且能在蓝莓根系表皮细胞内形成典型的杜鹃花类菌根真菌菌丝圈的菌株，选取其中一株较好的菌株命名为菌株14-16（菌株14-16的侵染结果如图1所示）。

实施例2：杜鹃花类菌根真菌菌株14-16的鉴定

1、形态鉴定

菌株14-16在PDA平板、25℃培养15天后，菌株14-16的菌落呈白色，圆形，扁平、全缘、毡状，菌株不产孢。该菌株在纯培养条件下生长缓慢，最适生长温度为28℃，最适生长pH 6.0。

形态特征：菌株菌落呈白色，生长缓慢，为丝状真菌，不产孢（如图2）。

2、分子鉴定

本研究选用天根植物基因组DNA提取试剂盒，提取真菌基因组DNA；使用ITS1-F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）引物扩增真菌rRNA基因ITS区段。并对扩增的ITS区段进行测序。该菌株的真菌核糖体脱氧核糖核酸内部转录间隔区序列如SEQ ID NO:1所示：

TCTCGTAGGTGACCTGCGGAGGGACATTACAGAGTTCGTGCCCTCCGGGTAGATCTCCCACCCACTGTTATCACTACTCTCGTTGCTTTGGCGGGCCGCTGGGCCCTGCCCGGCCGCCGGCTCCGGCTGGCGCGTGCCCGCCAGAGGCTCCGCAAACTCTGAATCTCAGTGTCGTCCGAGTACTATGTAATCATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGCGAATTGCAGAATTCAGTGAGTCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTGTGGTATTCCGCAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCGGCTTGGTGTTGGGCCCCGCCCGCTGCGGCCGGCCCTAAAGACAGTGGCGGCGCCGCCTGGCCCTCAGCGTAGTACAGCTCTCGCTCCAGGGTCCGGCGGTGGCCCGCCAGAACCCCCAACTCTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA。

使用MEGA 7.0.25、Kimura 2-parameter模型、NJ和ML算法进行进化树分析（bootstrap重复1000次），最终得到的进化树结果如图3。

在NCBI数据库中通过比对发现，菌株14-16的ITS rRNA基因序列与锤舌菌纲的物种Leotiomycetessp. EMF31 具有最高的相似性（96%），其次是锤舌菌纲树粉孢属的物种Oidiodendron maius isolate TR088（96%），Oidiodendron sp. shylmf12（96%），Oidiodendronsp. isolate TTC252（95%）等。

综上菌株14-16的鉴定结果显示，其属于子囊菌门（Ascomycota）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、黏毛菌科（Myxotrichaceae），该菌株于2017年6月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No. 60282。

实施例3：杜鹃花类菌根真菌菌株14-16在蓝莓盆栽苗上接种效果研究

1、供试植株

“蓝雨”蓝莓（Bluerain）组培苗，在苔藓基质上经驯化后已培养了8个月（2015.11~2016.06）。

2、菌株14-16液体菌剂制备

选取菌株14-16的PDA平板（25℃暗培养4周），挑取菌落边缘生长旺盛的菌丝，接种到盛有70 ml PDA培养液的三角瓶中。包上黑布在摇床上，25℃下，120 r·min^-1培养2周。

3、接种方法

采用蘸根法，菌株14-16为丝状真菌，摇菌发酵菌丝易聚成大块球状菌团，所以接种前用磁力搅拌器处理30 min把菌丝团打破后再进行蘸根。

试验栽培基质为红壤、苔藓和草炭的混合基质（体积比为1:1:2），均进行高温高压灭菌，121℃下1 h，两次。每个处理设置4个重复，对照不接菌；水分管理为：浇pH=4.5的酸化水；施肥管理为：每半个月浇20ml营养液（配方：N:P:K=4:1:2，N 1.34 g·L^-1，微量元素和铁盐与1/2 WPM培养基一致）培养6个月后采收（2016.12.10）。样品采收后，检测植株地上地下部鲜重、总生物量，接种蓝莓苗的侵染情况观察方法，同实施例2中的菌株14-16侵染蓝莓根系检测方法相同。

4、结果

与对照相比，接种菌株14-16对蓝莓植株的地上地下部生长均有促进作用（图4和5），其中地上部生长提高了12.72%，且达到了显著水平，植株的总生长量也提高了9.02%。

通过试验可以看出菌株14-16对蓝莓生长体现出了较高的促生效果，具有良好的应用前景和市场价值。

Claims (6)

1. 一株杜鹃花类菌根真菌功能菌株14-16，其特征在于，该菌株于2017年6月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No. 60282。

2.权利要求1所述杜鹃花类菌根真菌功能菌株14-16在蓝莓栽培中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述应用为促进蓝莓地上部的生长。

4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述应用为提高生长量。

5.一种蓝莓生长促进剂，其特征在于，含有权利要求1所述杜鹃花类菌根真菌功能菌株14-16或其代谢产物。

6.一种适用于蓝莓的生长促进肥，其特征在于，含有权利要求1所述杜鹃花类菌根真菌功能菌株14-16或其代谢产物，还含有有机肥。