CN108187065B - 抗5t4抗体与美登素衍生物dm4偶联复合物及制备方法和用途 - Google Patents

抗5t4抗体与美登素衍生物dm4偶联复合物及制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗体偶联药物制备领域，具体涉及一种抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物及制备方法和用途。本发明提供了一种抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物，其特征在于，其组成包括：抗5T4抗体，美登素衍生物DM4，偶联抗体与美登素衍生物DM4的连接分子，偶联抗体与美登素衍生物DM4的连接分子一端通过琥珀酰亚胺活化的羧酸酯与抗5T4抗体的氨基偶联，另一端通过形成二硫键与DM4的巯基偶联。本发明的抗体偶联复合物保留了抗5T4抗体的靶向结合5T4的高亲和能力又具有美登素衍生物DM4高效杀伤细胞的能力，在提高药物治疗效果的同时减少药物对机体的毒副作用，能够用于制备诊断和***的药物，具有良好的应用前景。

Description

抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物及制备方法和用途
技术领域
本发明属于抗体偶联药物制备领域，具体涉及一种抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物及制备方法和用途。
背景技术
抗体-化疗药物偶联物，也叫抗体偶联药物(Antibody-drug conjugates,ADC)，充分发挥了抗体的靶向安全性与化学药物的高效杀伤性，具有抗肿瘤活性高、毒副作用小的优点，是新一代针对难治性恶性肿瘤抗体靶向药物研发的方向。
ADC药物包括三个组成部分：针对肿瘤抗原的抗体、强效的细胞毒性化学药物(弹头药物)和连接抗体与弹头药物的连接分子(linker)。单克隆抗体的主要功能是药物载体同时也赋予ADC靶向性，其理想的肿瘤抗原为高特异表达于肿瘤细胞或者肿瘤微环境。靶抗原的选择是ADC药物设计中首要考虑的关键性因素。细胞毒性小分子化合物是ADC药物设计中第二个关键性参数，虽然ADC复合物仍然保留了单克隆抗体在体内的杀伤能力，但ADC的抗肿瘤效应主要取决于高细胞毒性弹头药物的杀伤效应。Linker的作用是桥梁作用，主要是将生物大分子与细胞毒性小分子化合物稳定的偶联形成ADC免疫复合物，linker承载了ADC的稳定性，水溶性，体内释放等多项功能，跟ADC体内代谢，药效和毒副作用也密切相关。
目前，国际知名制药企业Genentech、Wyeth、Pfizer和ImmunoGen等纷纷投入巨资加速研制ADC药物。全球进入临床试验阶段的ADC药物就有40余个，其中进入III期临床试验的有3个，2011年以来，已被美国FDA批准上市的就有3个。ADC药物对难治性复发性恶性肿瘤仍具有非常好的治疗效果。
5T4是由TPBG基因(滋养层糖蛋白基因)编码的N端高度糖基化的跨膜蛋白，人类5T4蛋白的分子量约为72kDa，包含420个氨基酸，N端低聚糖结构具有多样性，能够防止蛋白质水解，并且在细胞膜信号传导过程中与其它分子有交互作用。5T4糖蛋白总共包含7个重复亮氨酸结构域(LRR)，胞外部分为两个，可参与蛋白质与蛋白质的相互作用。5T4最早发现于胚胎发育，在整个怀孕过程中5T4高表达在胎盘滋养层细胞中，正常组织仅存在于某些特殊的上皮中，如基底层复层鳞状上皮腺体和导管上皮以及视网膜次级神经元和嗅球。后来相继发现5T4在卵巢癌、结肠癌、胃癌、肺癌、***、肾癌等有较高表达，随着分子生物学的不断发展，学者们也开始更加深入的探索5T4与肿瘤的联系。Griffiths RW等对20例肾癌和5个癌旁组织中5T4的存在情况进行分析，所有癌组织标本5T4均为阳性，75％为强阳性染色部位基本位于肿瘤细胞膜表面，而在周围的基质部分却没有明显着色。在5例癌旁组织中，4例显示了肾小球强阳性，分析可能是由于抗原从肿瘤中脱落，淤积在肾小球囊中造成的。后来，他们又取了5例尸检的正常肾脏进行研究，发现5T4阳性染色比此前要弱很多。上述的研究提示5T4与肿瘤的分期分级和不良预后密切相关。
美登素作为ADC中使用较为广泛的一类细胞毒分子，最早是从非洲一种灌木(Maytenus ovatus)的树皮的醇提物中分离得到的。美登素是第一个具有抗肿瘤活性的安莎大环内酯类抗生素，对它进行基团的变换研究，发现此类美登素衍生物的活性并未有显著的降低，因此可对美登素进行结构修饰，在保证抗肿瘤活性的前提下，提供适当的偶联反应位点。美登素衍生物DM4(Maytansinoid DM4,N2'-deacetyl-n2'-(4-Mercapto-4-Methyl-1-oxopentyl)-6-MethylMaytansine，N2'-去乙酰基-N2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素)便是基于此构效关系发现的美登素衍生物，DM4可在水溶液中高效并且高产率的与单克隆抗体反应，以稳定的共价键进行结合。美登素的主要作用机制是通过阻断微管蛋白的聚合作用，将细胞阻滞于细胞周期的G2/M期，从而抑制了细胞有丝***的进行，导致细胞凋亡。
在最近的报道中，研究者已选择美登素衍生物DM4类似物作为CD19靶向抗体-药物偶联物SAR3419的小分子药物组成部分，结果表明能够有效的抑制肿瘤的生长，目前已经进入Ⅱ期临床实验。但目前还没有将美登素衍生物DM4与抗5T4抗体偶联是否能够有效抗肿瘤的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物及其制备方法和用途。
本发明提供了一种抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物，其组成包括：抗5T4抗体，美登素衍生物DM4，偶联抗体与美登素衍生物DM4的连接分子；连接分子一端通过琥珀酰亚胺活化的羧酸酯与抗5T4抗体的任意一个氨基偶联，另一端通过形成二硫键与DM4偶联。
优选的，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述的连接分子一端通过琥珀酰亚胺活化的羧酸酯与抗5T4抗体的赖氨酸残基偶联，另一端通过形成二硫键与DM4偶联。
其中，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述抗5T4抗体包括重链可变结构域、轻链可变结构域、恒定区；所述重链可变结构域为与该抗体的重链互补性决定区相同的结构域，所述轻链可变结构域为与该抗体的轻链互补性决定区相同的结构域。
其中，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述抗5T4抗体的重链可变结构域的氨基酸序列为Seq ID NO:1或Seq ID NO:2中的任意一种。
重链氨基酸序列Seq ID NO:1：
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFRNYAMSWVRQSPDKRLEWVAENSAGGSYTYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCAFYSYGSSYSMDYWGQGTSVTVSSQSMDY。
Seq ID NO:2：
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFRNYAMSWVRQSPDKRLEWVAEIRTGGSYTYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCAFRYYGSSYSMDYWGQGTSVTVSSMSMDY。
进一步的，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述抗5T4抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列为Seq ID NO:3或Seq ID NO:4中的任意一种。
轻链氨基酸序列Seq ID NO:3：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYHIILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGTTVLPT。
Seq ID NO:4：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASSDILWYLNWYQQKPDGTVKLLIYHLIILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGTTVLPTF。
进一步的，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述恒定区为天然抗体恒定区或基因工程改造后的抗体恒定区。
进一步的，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述的美登素衍生物DM4的分子结构为式1：
Figure BDA0001533177190000031
所示。
其中，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述的偶联抗体与美登素衍生物DM4的连接分子的结构为式2：
Figure BDA0001533177190000032
所示。
其中，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述的偶联复合物结构为式3：
Figure BDA0001533177190000041
所示。
其中，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述的抗5T4抗体与美登素衍生物DM4的摩尔比为1︰1～10，优选为1︰2.7。
本发明还提供了一种上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物的制备方法，包括以下步骤：
a、制备抗5T4抗体；
b、加入美登素衍生物DM4和偶联抗体与美登素衍生物DM4的连接分子，反应10～12h，制得抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物。
本发明要解决的第三个技术问题为提供了一种上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物在制备诊断或***药物中的用途。
本发明的有益效果为：本发明通过生物偶联技术将美登素衍生物DM4与抗5T4抗体交联得到抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物，既保留了抗5T4抗体的靶向结合5T4的高亲和能力又具有美登素衍生物DM4高效杀伤细胞的能力，在提高药物治疗效果的同时减少药物对机体的毒副作用；在体外抗5T4阳性肿瘤细胞的增殖活性高，具有抗肿瘤效果，毒副作用小，是一种靶向强和高效杀伤肿瘤的ADC候选药物，能够用于制备诊断和***的药物，具有良好的应用前景。
附图说明
图1所示为5T4抗体亲和力检测；
用Biolayer interferometry技术分析4种抗5T4抗体，如图1-1所示：抗体R3-A5-D3的亲和力为KD＝7.85*10-10；图1-2所示：G5-A7-D10D亲和力最强，KD＝1.56*10-11；图1-3所示：抗体G4-G6-D12的亲和力为KD＝6.00*10-10；图1-4所示：抗体A2-D11-B3的亲和力为KD＝2.78*10-9；其中G5-A7-D10D的亲和力最强，KD＝1.56*10-11；命名为H6；
图2毛细管等点聚焦法检测抗体H6的PI值；
毛细管等点聚焦法用来检测抗体H6的PI值，经检测通过真核细胞表达并纯化的抗体H6的等电点为7.54；
图3所示为流式细胞术检测抗5T4抗体靶向性检测；
实验结果如图3-1所示，H6能较好识别并靶向5T4阳性胃肠道肿瘤细胞系HGC27,SW620,HT29,DLD-1,HCT-15,SW1990,PANC-1,BXPC-3，ASPC-1，HCT116，SW480，黑色箭头所示H6实验组，实验组左边为PBS对照组；其中细胞系AGS和LOVO不表达5T4，箭头所示PBS对照组与H6实验组重合。图3-2所示为各种细胞经H6检测后的5T4表达强度；
图4所示为流式细胞术检测抗5T4抗体H6的内化效应检测；
内化实验在5T4阳性细胞HGC27上经行，H6结合5T4后，81％的H6被内化入细胞内；1峰为PBS组,，2峰为H6抗体37摄氏度内化四小时后实验组，3峰为H6抗体4摄氏度四小时后实验组(内化效应只在37摄氏度进行)；
图5所示为质谱检测H6-DM4的药物抗体偶联比，平均抗体偶联比为2.7；
其中5-1所示5T4抗体H6和H6-DM4在细胞HGC27和SW620细胞上面的体外毒性；其中5-2所示5T4抗体H6和H6-DM4在细胞HCT15和SW1990细胞上面的体外毒性；其中5-3所示5T4抗体H6和H6-DM4在细胞ASPC-1和LOVO细胞上面的体外毒性；其中5-4所示5T4抗体H6和H6-DM4在细胞HT29和DLD-1细胞上面的体外毒性；其中5-5所示5T4抗体H6和H6-DM4在细胞PANC-1和BXPC-3细胞上面的体外毒性；
图6所示为流式细胞术检测抗5T4抗体和H6-DM4靶向性检测；
所用细胞模型为CHO细胞，CHO细胞本身不表达5T4，我们将5T4基因转入后建立了CHO高表达5T4细胞株，H6偶联DM4后对H6靶向结合5T4的靶向性没有改变，图中1峰为PBS组，2峰为实验组；
图7所示为H6和H6-DM4体内抗肿瘤活性；
如图7-1所示为用肿瘤细胞HGC27和HT29裸鼠荷瘤模型评价H6和H6-DM4的体内抗肿瘤活性；图7-2所示为用肿瘤细胞HCT15和PANC-1裸鼠荷瘤模型评价H6和H6-DM4的体内抗肿瘤活性；图7-3所示为用肿瘤细胞DLD-1和BXPC-3裸鼠荷瘤模型评价H6和H6-DM4的体内抗肿瘤活性；
图8所示为H6对心肝脾肺肾的毒性分析；
小鼠一般状况评价分为体重和主要器官的病理学变化决定，尾静脉给药后的第3天，取各个实验组的裸鼠的心、肝、脾、肺、肾，采用H&E染色，结果显示H6与对照组的正常器官比较，药组中各个器官没有发现明显的组织病变，说明无明显毒副作用。
具体实施方式
本发明提供了一种抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物，其组成包括：抗5T4抗体，美登素衍生物DM4，偶联抗体与美登素衍生物DM4的连接分子；连接分子一端通过琥珀酰亚胺(丁二酰亚胺)活化的羧酸酯与抗5T4抗体的氨基偶联，另一端通过形成二硫键与DM4偶联。
其中，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述抗5T4抗体包括重链可变结构域、轻链可变结构域、恒定区；所述重链可变结构域为与该抗体的重链互补性决定区相同的结构域，所述轻链可变结构域为与该抗体的轻链互补性决定区相同的结构域。
进一步的，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述恒定区为天然抗体恒定区或基因工程改造后的抗体恒定区。
进一步的，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述的美登素衍生物DM4的分子结构为式1：
Figure BDA0001533177190000061
所示。
其中，上述抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物中，所述偶联复合物的结构为式2：
Figure BDA0001533177190000062
所示。
本发明中的抗5T4抗体原则上是所有的能够与5T4靶向结合的抗体都可以，优选采用重链可变结构域的氨基酸序列为Seq ID NO:1或Seq ID NO:2中的任意一种和轻链可变结构域的氨基酸序列为Seq ID NO:3或Seq ID NO:4中的任意一种组合而成的抗5T4抗体，该抗体的恒定区可以为天然抗体恒定区或基因工程改造后的抗体恒定区。
特别的，抗5T4抗体可以通过常规杂交瘤细胞分泌获得，也可以通过常规的基因重组技术所构建。将得到的能够编码5T4抗体重链可变结构域和轻链可变结构域的基因克隆到带有抗体恒定区基因的表达载体中，所述载体包括pAZ-V5-hCH，pAZ-V5-hCH，pAZ-V5-hCH，pAZ-V5-hCH，pAZ-V5-hCL，pAZ-V5-hCL，pTT5，pCEP4Mammalian Expression Vector等，通过真核细胞表达***，如CHO和293等进行表达，再通过蛋白纯化方法获得抗5T4抗体。
进一步的，针对上述制备的靶向性强的抗5T4抗体，本发明将其与美登素衍生物DM4通过连接分子进行偶联，能够特异性靶向肿瘤细胞，与肿瘤细胞具有较强的亲和力，能够提高美登素衍生物DM4的利用效率和治疗效果。
在本发明中，通过筛选特定序列的抗5T4抗体，得到的抗体(如H6抗体)亲和力很高，达到了10-11，其是一株能介导高效内化的抗体，H6在细胞水平的内化效率为81％，这预示着，H6在体内与5T4结合后，能快速高效的把弹头药物通过内化效应导入肿瘤细胞内，起到杀伤肿瘤细胞的作用。
并且本发明选择DM4进行偶联，DM4是一种高效杀伤弹头，它的同系物DM1已作为ADC药物的弹头被用于临床，而DM4是一种比DM1杀伤效应更强的ADC药物弹头分子，本发明采用高特异性，高亲和力和高内化效应的H6抗体与高细胞毒性的弹头药物偶联，具有较好的临床应用前景。
本发明的抗体偶联物可以按照药剂学常规技术制备成各种形式的药物制剂，较优选的是注射剂，最优选的是冷冻干燥注射剂。
本发明的抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物可用于制备诊断和***药物。
下面通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中所用的各试剂与耗材均为普通市售产品。
实施例1制备5T4抗体偶联药物H6-DM4
1、制备抗5T4抗体
通过测序和序列分析，获得候选克隆的轻重链可变区氨基酸序列，选定各克隆对应的序列构建嵌合型表达载体进行人鼠嵌合抗体改造。将氨基酸序列如Seq ID NO:3所示的轻链可变区基因构建到pTT5表达载体上，EcoR I-Kozak序列-信号肽-VL-恒定区-终止密码子-Hind III，轻链恒定区基因序列为：NCBI Reference Sequence:NG_000834.1，EcoRI-信号肽-VL-Ig kappa chain C region-Hind III。将氨基酸序列如Seq ID NO:1所示的重链可变区基因克隆到表达载体为pTT5/抗5T4抗体-VH，组成为EcoR I-信号肽-VH-Iggamma-1chain C region-Hind III，重链恒定区序列为：NCBI Reference Sequence:NG_001019.6。根据哺乳细胞表达体系进行密码子优化并合成相关基因片段。通过以上构建的抗体命名为：抗5T4抗体H6，按常规方法制备得到抗5T4抗体H6。
2、抗5T4抗体H6性能测定
(1)BIACORE T200亲和力检测抗5T4抗体的亲和力
亲和力检测抗原为Recombinant Human 5T4胞外段，分子量为72kD，采用直接法，将抗原通过氨基偶联到CM5(BIACORE X100)或者sCM5(BIACORE T200)上；根据Rmax＝(MWanalyte/MWligand)×RL×Sm，实际偶联量为RL的1.5倍。算出同时适宜检测抗原偶联量为120Ru；偶联操作：偶联缓冲液为1×HBS-EPbuffer，50mM NaOH作为清洗液。使用pH 4.5的醋酸钠溶液配制抗原至10μg/mL。选择氨基偶联，在Target level中输入120Ru，将抗原样品、NaOH、乙醇胺、EDC、NSH以及空试管根据提示放到样品盘中相应的位置；再生条件摸索，最终选择pH 1.7甘氨酸盐酸再生10s；所有样品均设置复孔；程序设置，Kinetics/Affinity选项中的Flow pat选择2-1；Regeneration选择2；Contact time为180s；解离时间设置为5600s；再生条件：Gly 1.7、10s；重复检测的样品间隔开，并设置三个0浓度及3个start up。利用1:1计算模型进行拟合，进行动力学分析如图1(图1-1～1-4)所示：结果表明H6与5T4亲和力为KD＝1.56*10-11，是一株高亲和力抗体。
(2)毛细管等电聚焦电泳检测H6的等电点
毛细管电泳等电聚焦是根据样品的pI值的不同来进行样品分析分离的方法。两性电解质在两端直流电压的作用下，能够在毛细管内部形成一个pH梯度。带有两性基团的样品以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移。当其迁移到pH值为pI值时，其自身净电荷为零，停止移动。根据这一原理，可以达到分析pI值的目的。
在EP管中加入17.5μL 1％甲基纤维素MC(终浓度为0.35％)，2μLpH 3-10的两性电解质(终浓度为4％)，加入相应体积的蛋白样品(终浓度为0.2mg/ml)并用超纯水补足50μL，用涡旋混合器涡旋30s，在4℃离心机中13,000rpm/min离心5min。将样品加入到VialInsert Pack后在4℃离心机中13,000rpm/min离心1min。将Vial Insert Pack放入到VialPack，再将其放到机器上的样品盘中；按照操作规程操作；Focus Period 1设置为1500V,1min,Focus Period 2设置为3000V,8min。Carrier Amphplytes:4％pH 3-10,Additives:0.35％MC,Concentration:0.2mg/ml进行检测。经检测通过真核细胞表达并纯化的H6的等电点为7.54(如图2所示)。
(3)流式细胞术检测抗5T4抗体H6靶向性
培养5T4阳性或阴性胃肠道肿瘤细胞系，收集对数生长期的癌细胞，再将细胞平均分成若干组，每组细胞个数为1×106；细胞分组：阴性对照组(PBS组)和实验组；用PBS缓冲盐重悬各组细胞，4℃，3500rmp离心3min，用枪尖吸取上清液；孵育一抗，向阴性对照组中加入100μLPBS，向实验组中加入100μL抗体(浓度为10μg/mL)，重悬后，4℃孵育30min；将各组细胞在3500rpm，离心3min，吸去上清液，向各组中加入300μLPBS缓冲盐，将细胞重悬吹打两次，而后将各组细胞在3500rmp转速下离心3分钟，吸去上清液，如此重复2次；孵育二抗，向各组细胞中加入山羊抗人IgG/FITC标记50-100μL(稀释比例为1:200)，重悬混匀，将细胞在4℃孵育30min；4℃孵育30min结束后，向各组中加入300μL PBS缓冲盐，将细胞重悬吹打两次，而后将各组细胞在3500rpm，离心3min，吸去上清液，如此重复2-3次；加入400μLPBS缓冲液重悬各组细胞检测；在流式细胞仪上，将各项参数设置好，用对照组的细胞调试且作为阴性对照，而后顺序测取各组细胞样品。实验结果如图3(图3-1、3-2)所示，显示H6能较好识别并靶向5T4阳性胃肠道肿瘤细胞系HGC27,SW620,HT29,DLD-1,HCT-15,SW1990,PANC-1,BXPC-3，ASPC-1，HCT116，SW480。
(4)流式细胞术检测抗5T4抗体H6与5T4结合后的内化效应
培养5T4阳性肺癌细胞系，收集对数生长期细胞，再将细胞平均分成若干组，每组细胞个数为1×106细胞分组：阴性对照组(PBS组)和实验组用PBS缓冲盐重悬各组细胞，4℃，3500rmp离心3min，用枪尖吸取上清液。内化时将与抗体结合的细胞分为两组，用500μLPBS重悬细胞后，一组4℃放置4h，另一组在37℃内化4h，内化结束后，4℃，3500RMP离心3分钟，用枪尖吸取上清液，向各组中加入300μL 50mM PBS缓冲盐，将细胞重悬吹打两次，而后将各组细胞在3500RMP转速下离心3分钟，吸去上清液。如此重复上一步骤，向各组细胞中加山羊抗鼠IgG/FITC标记二抗(稀释比例为1:200)，重悬混匀，将细胞在4℃孵育30min，备注一抗为H6，二抗为山羊抗人IgG/FITC标记，向各组中加入300μLPBS缓冲液，将细胞重悬吹打两次，而后将各组细胞在3500rpm转速下离心3分钟，吸去上清液；如此重复2次，加入400μLPBS缓冲液重悬各组细胞检测，在流式细胞仪上，将各项参数设置好，用对照组的细胞调试且作为阴性对照，而后顺序测取各组细胞样品。实验结果如图4所示，显示H6与5T4结合介导的内化效率在HGC27细胞系中的分别是81％。该结果提示H6具有较好的5T4靶向性，且同时具有向5T4阳性细胞内输送药物的能力。
(5)抗5T4抗体H6的活性检测
用CCK-8检查抗5T4抗体H6的体外活性
用含20％胎牛血清的RPMI1640培养基培养人胃肠道肿瘤细胞系HGC27,SW620,HT29,DLD-1,HCT-15,SW1990,PANC-1,BXPC-3，ASPC-1和LOVO，置5％CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养；收集对数生长期的5T4阳性肺癌细胞，计数并调整细胞密度；铺96孔板，根据不同细胞的生长速度，NCI-H526和NCI-H69细胞密度为10000个/孔，体积为100μL/孔；细胞置于培养箱中培养24小时，进行加药处理。抗体H6用含20％胎牛血清RPMI 1640培养基稀释至起始浓度2.4μM，0.22μm滤器过滤，4℃保存；往铺有细胞的96孔板中加入梯度稀释的样品。每个药物设计8个浓度梯度，每个浓度梯度设置3个复孔，使抗体的最终浓度梯度为1μM、200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM、0.064nM、0.0128nM，加药体系为100μL/孔。加入样品轻轻拍打孔板边缘混匀，置于5％CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养72小时。每24h置于显微镜下观察细胞生长情况；96孔板中加入0.22μm滤膜过滤的CCK-8试剂(Dojindo公司)，20μL/孔；37℃避光孵育1-3h；将孔板置于酶联免疫检测仪中450nm处，测取各孔的OD值，并计算每组的平均值。抑制率(％)＝(对照组-给药组)/对照组×100％。IC50用GraphPad Prism 6.0计算。实验结果如图5(5-1～5-5)所示，抗5T4抗体对5T4阳性细胞HGC27的IC50为14.16,SW620的IC50为16.39,HT29的IC50为3.89,DLD-1的IC50为0.53,HCT-15的IC50为74.76,SW1990的IC50为28.28,PANC-1的IC50为37.58,BXPC-3的IC50为1.74，ASPC-1的IC50为23.26。
H6体内抗肿瘤活性
细胞培养和接种用细胞用含20％胎牛血清的DMEM培养基培养5T4阳性胃肠道肿瘤细胞HGC-27,HT29,DLD-1,HCT-15,PANC-1,BXPC-3，置于5％CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养；接种前24小时换一次液；收集对数生长期细胞，用无血清无抗生素的DMEM培养基清洗细胞两次，进行细胞计数。用无血清无抗生素的DMEM培养基和基质胶(终浓度大于4mg/mL)将细胞密度调整为108个活细胞/ml。
实验动物为BALB/c无胸腺裸鼠(简称裸鼠，北京华阜康)，5-6周龄，体重16-18克；实验动物饲养管理：每周更换一次繁殖用饲料、饮用水、垫料和笼具，同时要观察动物生理状态。
细胞接种：接种量大于1-2×107个cell/只，接种体积为100-150μL/只，接种部位为裸鼠右上肢背部皮下；裸鼠接种肿瘤细胞7-15天后，每隔3天观察一次肿瘤体积大小。待肿瘤体积达到200mm3，可进行分组和给药；挑取肿瘤大小均一的裸鼠，并按照实验目的进行随机分组，在以上细胞皮下模型中体内抗肿瘤实验分组如下表1所示：
表1体内评价皮下模型分组
模型分组 数目(只)
对照组 6
H6(或IgG-DM4，在HGC27模型中)(10mg/kg) 6
H6-DM4(10mg/kg) 6
H6-DM4(2.5mg/kg) 6
称量各组裸鼠体重，测量肿瘤体积，开始以尾静脉注射方式给药；每隔三天给药一次，连续给药3次；裸鼠肿瘤生长情况监测：从给药开始，每三天使用游标卡尺测量肿瘤长短径，单位为mm，计算肿瘤体积大小，计算公式为V＝长径×短径×短径/2。实验结果如图7(7-1～7-3)所示，显示H6和H6-DM4体内都有一定抗5T4阳性肿瘤的活性。
实施例2制备抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物H6-DM4
1、摸索反应条件
抗体与美登素衍生物DM4按照一定的摩尔比，将溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中的SPDB-DM4直接加入抗体，加入偶联抗体与美登素衍生物DM4的连接分子，充分混匀后，室温，80rpm，反应一定时间，具体反应摩尔比和反应时间按下表2进行摸索。
表2摸索反应条件设置表
Figure BDA0001533177190000101
Figure BDA0001533177190000111
取出反应液，采用脱盐柱HiTrap TM Desalting 5mL去除反应体系中残留的未反应的小分子；将收集的洗脱液加入到润洗后的超滤管中，4000rpm/min转速离心15-20min后倒掉超滤管下层液体，向上层管内加入新的置换缓冲液，充分混匀内管中的蛋白样品，重复上述步骤1-2次，将ADCs样品的缓冲液置换为ADCs样品保存液；所得样品送于Waters公司通过质谱分析其DAR，得出最适的投料比和偶联反应时间。
通过摸索可知：按照上述条件还原抗体链间二硫键后，H6与小分子药物DM4的摩尔比按照1:10进行偶联反应12小时以上效果更佳。
2、制备抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物H6-DM4
购买市售的连接分子-DM4产品(连接分子与DM4按摩尔比1:1偶联后的成品)，抗体H6(5mg/mL，0.03125mmol/L)与连接分子-DM4摩尔比为1：10充分混匀后，室温，80rpm，反应12h；偶联结束后取出反应液，采用脱盐柱HiTrapTM Desalting 5mL去除反应体系中残留的未反应的小分子；将收集的洗脱液加入到润洗后的超滤管中，4000rpm/min转速离心5-10min后倒掉超滤管下层液体，向上层管内加入新的置换缓冲液，充分混匀内管中的蛋白样品，重复上述步骤1-2次，将ADCs样品的缓冲液置换为ADCs样品保存液，剩余样品用于后续实验。制得抗5T4抗体偶联复合物H6-DM4，其偶联率经质谱检测为2.7。
实施例3抗5T4抗体偶联药物H6-DM4结合力和纯度检测
1、流式细胞术检测5T4抗体偶联药物H6-DM4靶向性
培养5T4阳性小细胞肺癌细胞系，收集对数生长期的胃肠道肿瘤细胞系，再将细胞平均分成若干组，每组细胞个数为1×106；细胞分组：阴性对照组(PBS组)、实验组(H6-DM4)；用PBS缓冲盐重悬各组细胞，4℃，3500rmp离心3min，用枪尖吸取上清液；孵育一抗，向阴性对照组中加入100μLPBS，向实验组中加入100μL抗体H6-DM4(浓度为10μg/mL)，重悬后，4℃孵育30min；将各组细胞在3500rpm，离心3min，吸去上清液，向各组中加入300μLPBS缓冲盐，将细胞重悬吹打两次，而后将各组细胞在3500rmp转速下离心3分钟，吸去上清液，如此重复2次；孵育二抗，向各组细胞中加入山羊抗人IgG/FITC标记50-100μL(稀释比例为1:200)，重悬混匀，将细胞在4℃孵育30min；4℃孵育30min结束后，向各组中加入300μLPBS缓冲盐，将细胞重悬吹打两次，而后将各组细胞在3500rpm，离心3min，吸去上清液，如此重复2-3次；加入400μL PBS缓冲液重悬各组细胞检测；在流式细胞仪上，将各项参数设置好，用对照组的细胞调试且作为阴性对照，而后顺序测取各组细胞样品。
实验结果如图6所示：偶联小分子药物DM4后，抗体H6结合5T4和靶向5T4阳性细胞的能力未改变，H6-DM4与H6同CHO细胞系的结合能力相同，偶联小分子药物未影响抗体的结合能力。
实施例5 5T4抗体偶联药物抗肿瘤活性
1、H6-DM4体外细胞毒性检测
用含20％胎牛血清的DMEM培养基培养人胃肠道肿瘤细胞系HGC27,SW620,HT29,DLD-1,HCT-15,SW1990,PANC-1,BXPC-3和ASPC-1和Lovo，置5％CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养；收集对数生长期的细胞，计数并调整细胞密度；铺96孔板，根据不同细胞的生长速度，HGC27,SW620,HT29,DLD-1,HCT-15,SW1990，Lovo细胞密度为3000个/孔，PANC-1和BXPC-3细胞密度为4000个/孔，体积为100μL/孔；细胞置于培养箱中培养24小时，进行加药处理。
抗体和ADCs复合物分别用含20％胎牛血清RPMI 1640培养基稀释至起始浓度2.4μM，0.22μm滤器过滤，4℃保存；往铺有细胞的96孔板中加入梯度稀释的样品。因每孔中装有100μl培养基，使得待测样品的起始浓度均为1.2μM。每个药物设计8个浓度梯度，每个浓度梯度设置3个复孔，使抗体和ADCs复合物的最终浓度梯度为1μM、200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM、0.064nM、0.0128nM，加药体系为100μL/孔。加入样品轻轻拍打孔板边缘混匀，置于5％CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养72小时。每24h置于显微镜下观察细胞生长情况；向上述步骤96孔板中加入0.22μm滤膜过滤的CCK-8试剂(Dojindo公司)，20μL/孔；37℃避光孵育1-3h；将孔板置于酶联免疫检测仪中450nm处，测取各孔的OD值，并计算每组的平均值。抑制率(％)＝(对照组-给药组)/对照组×100％。IC50用GraphPad Prism6.0计算。
H6-DM4和H6对胃肠道肿瘤细胞体外抗增殖实验研究，是通过体外作用胃肠道肿瘤细胞系72h后，肉眼观察细胞杀伤效果并采用CCK-8检测。
结果表明，H6-DM4对小细胞肺癌细胞系HGC27,SW620,HT29,DLD-1，HCT-15，SW1990，PANC-1，BXPC-3，ASPC-1具有较强的细胞杀伤作用，其IC50分别为14.16nmol/L,16.39nmol/L,3.89nmol/L,0.53nmol/L,74.76nmol/L,28.28nmol/L,37.58nmol/L,1.74nmol/L,23.26nmol/L。(如图5和表3所示)。
表3 H6-DM4体外细胞毒性检测结果
Figure BDA0001533177190000121
Figure BDA0001533177190000131
H6-DM4能有效杀伤5T4阳性的胃肠道肿瘤细胞，对5T4阴性细胞没有明显效果。这些结果表明在体外，H6-DM4具有较强的体外杀伤5T4阳性胃肠道肿瘤细胞系活性。
2、H6-DM4体内抗肿瘤活性
用含20％胎牛血清的DMEM培养基培养人胃肠道肿瘤细胞HGC-27,HT29,DLD-1,HCT-15,PANC-1,BXPC-3，置于5％CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养；接种前24小时换一次液；收集对数生长期细胞，用无血清无抗生素的DMEM培养基清洗细胞两次，进行细胞计数。用无血清无抗生素的DMEM培养基和基质胶(终浓度大于4mg/mL)将细胞密度调整为108个活细胞/ml。
实验动物为BALB/c无胸腺裸鼠(简称裸鼠，北京华阜康)，5-6周龄，体重16-18克；实验动物到货时一般为4-5周龄，需要在动物房适应性饲养1周；实验动物饲养管理：每周更换一次繁殖用饲料、饮用水、垫料和笼具，同时要观察动物生理状态。
细胞接种：接种量大于1-2×107个cell/只，接种体积为100-150μL/只，接种部位为裸鼠右上肢背部皮下；裸鼠接种肿瘤细胞7-15天后，每隔3天观察一次肿瘤体积大小。待肿瘤体积达到200mm3，可进行分组和给药；挑取肿瘤大小均一的裸鼠，并按照实验目的进行随机分组，在所有的胃肠道肿瘤细胞皮下模型中，H6-DM4体内抗肿瘤实验分组如下表4所示。
表4胃肠道肿瘤细胞皮下模型分组
6皮下模型分组 数目(只)
Control 6
H6(10mg/kg) 6
H6-DM4(10mg/kg) 6
H6-DM4(2.5mg/kg) 6
称量各组裸鼠体重，测量肿瘤体积，开始以尾静脉注射方式给药；每隔三天给药一次，连续给药3次；裸鼠肿瘤生长情况监测：从给药开始，每三天使用游标卡尺测量肿瘤长短径，单位为mm，计算肿瘤体积大小，计算公式为V＝长径×短径×短径/2，测量肿瘤时，应用酒精棉球擦拭肿瘤的轮廓，在量长短径的时候，以尺子正好能通过肿瘤为宜，注意不能卡紧，将测量的各组数据求平均值并计算出标准误差；裸鼠体重监测，使用电子天平称量动物体重，单位为g，将测量的各组数据求平均值并计算出标准差；观察裸鼠生理和生活状态，有无感染等治疗期限：治疗期限根据治疗效果与裸鼠生长情况而定。一般出现显著治疗效果，对照小鼠肿瘤体积大于2000mm3情况下，结束治疗，处死小鼠。
5T4阳性人胃肠道肿瘤细胞HGC-27,HT29,DLD-1,HCT-15,PANC-1,BXPC-3裸鼠皮下瘤模型用以研究H6和H6-DM4的体内抗肿瘤活性。结果如图7(7-1～7-3)所示：H6-DM4在2.5mg/kg或10mg/kg下能彻底清除肿瘤。在DLD-1,HCT-15,PANC-1,BXPC-3皮下模型中，H6-DM4(10mg/kg和2.5mg/kg)剂量组，给药三次后均能使肿瘤完全消退。在HGC-27和HT29模型中，H6-DM4(10mg/kg)剂量组能使裸鼠肿瘤完全消退。因此，本发明制备的H6-DM4复合物具有良好的体内抗5T4阳性肿瘤活性。
3、病理检测H6-DM4在体内的毒性
小鼠一般状况评价分为体重和主要器官的病理学变化决定。肿瘤裸鼠的主要器官的H&E染色用于H6-DM4潜在的毒副作用研究。取对照组、抗体组和ADCs药物处理组裸鼠的心、肝、脾、肺和肾的组织样品在4％磷酸盐缓冲的甲醛中固定，并根据常规方法石蜡包埋。将组织切片用苏木精和曙红(H&E)染色后镜下分析。尾静脉给药后的第20天，取各个实验组的裸鼠的心、肝、脾、肺、肾，采用H&E染色，结果如图8所示，同对照组的正常器官比较，给药组中各个器官没有发现明显的组织病变，说明无明显毒副作用。
由实施例可知，本发明制备的抗5T4抗体复合物既保留了靶向结合5T4的高亲和能力，又具有美登素衍生物DM4高效杀伤细胞的能力，在提高药物治疗效果的同时减少药物对机体的毒副作用；在体外抗5T4阳性肿瘤细胞的增殖活性高，具有抗肿瘤效果，毒副作用小，为ADCs提供了一种全新的选择。
                         序列表
<110>  广东众生药业股份有限公司
<120>  抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物及制备方法和用途
<130>  A171579K
<141>  2017-12-29
<160>  4
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  125
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Asn Ser Ala Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Tyr Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gln Ser Met Asp Tyr
        115                 120                 125
<210>  2
<211>  125
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Arg Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Met Ser Met Asp Tyr
        115                 120                 125
<210>  3
<211>  96
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr His Ile Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Thr Thr Val Leu Pro Thr
                85                  90                  95
<210>  4
<211>  98
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Asp Ile Leu Trp Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr His Leu Ile Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Thr Thr Val Leu Pro
                85                  90                  95
Thr Phe

Claims (7)

1.抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物，其特征在于，其组成包括：抗5T4抗体，美登素衍生物DM4，偶联抗体与美登素衍生物DM4的连接分子；连接分子一端通过琥珀酰亚胺活化的羧酸酯与抗5T4抗体的任意一个氨基偶联，另一端通过形成二硫键与DM4的巯基偶联；所述抗5T4抗体包括重链可变结构域、轻链可变结构域、恒定区；所述抗5T4抗体的重链可变结构域的氨基酸序列为Seq ID NO:1；所述抗5T4抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列为Seq ID NO:3；
所述的偶联复合物的结构为式3：
Figure FDA0004094574850000011
所示。
2.根据权利要求1所述的抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物，其特征在于：所述恒定区为天然抗体恒定区或基因工程改造后的抗体恒定区。
3.根据权利要求1所述的抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物，其特征在于：所述的美登素衍生物DM4的分子结构为式1：
Figure FDA0004094574850000012
所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物，其特征在于：所述的抗5T4抗体与美登素衍生物DM4的摩尔比为1︰1～10。
5.根据权利要求4所述的抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物，其特征在于：所述的抗5T4抗体与美登素衍生物DM4的摩尔比为1︰2.7。
6.权利要求1～5任一项所述的抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、制备抗5T4抗体；
b、加入美登素衍生物DM4和偶联抗体与美登素衍生物DM4的连接分子，反应10～12h，制得抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物。
7.权利要求1～5任一项所述的抗5T4抗体与美登素衍生物DM4偶联复合物在制备诊断或***药物中的用途。
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