CN108187049A - 含Bromo功能域蛋白4及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用 - Google Patents

含Bromo功能域蛋白4及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了含Bromo功能域蛋白4及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。本发明以不同的肝细胞（L02细胞、HepG2细胞为实验对象，分别用BRD4抑制剂——JQ1和OTX015处理，DMSO作对照，再用（棕榈酸酯/油酸）PA/OA处理，之后对细胞进行油红O染色，染色结果都显示出：与DMSO对照组相比，抑制剂处理组颜色明显变浅。这表明BRD4被抑制后，可以抑制脂肪堆积，能够改善脂肪肝及相关疾病的发生。因此BRD4为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物提供靶标。

Description

含Bromo功能域蛋白4及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾 病药物中的应用
技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种BRD4作为药物靶标在筛选治疗脂肪肝药物中的应用，以及BRD4的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物中的应用。
背景技术
随着人们生活水平的不断提高，饮食结构也发生了很大的变化，逐渐趋向于高蛋白，高脂肪，但是人类的代谢水平有限，这就造成了脂肪在肝脏中的不断积累，从而引发脂肪肝。近年来，脂肪肝的发病率日益增高，发病群体将会伴随有脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化的发生，并会发展成为肝细胞癌。目前，尚无防治脂肪肝的特效药物。所以寻找制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病的药物的新靶点，就显得尤为重要。
Bromodomain-containing protein 4(BRD4)属于Bromodomain and extra-terminal(BET)家族成员。BRD4是一种普遍存在于有丝***细胞的转录调控蛋白，通过把转录调控复合物招募到乙酰化的染色质上而发挥转录调节作用，激活下游靶基因的转录，从而在调控细胞周期、肿瘤发生中发挥着重大作用[1]。BRD4还能与一些重要的转录因子(如p53等)相互作用，来影响下游基因的转录。近年来的研究表明，BRD4的表达失调和功能紊乱能明显的影响炎症反应以及肿瘤的发生发展[2][3]。目前，以BET Bromodomain蛋白为靶标，进行炎症、肿瘤等疾病的科学研究，寻找选择性好、安全性高、生物活性强的小分子抑制剂更是热点中的热点。近年来，针对BRD4抑制剂的研究也有一些成果，如甲基***-1,4苯并二氮型的Bromodomain抑制剂(+)-JQ1[4]，以及OTX015，它们对BRD4拥有非常高的亲和力。但关于BRD4及其抑制剂在脂肪肝中的作用并不明确。
参考文献：
1.Asangani I A,Dommeti V L,Wang X,et al.Therapeutic targeting of BETbromodomain proteins in castration-resistant prostate cancer[J].Nature,2014,510(7504):278-82.
2.French C A,Miyoshi I,Kubonishi I,et al.BRD4-NUT Fusion Oncogene[J].Cancer Research,2003,63(2):304-7.
3.Segura M F,Fontanalscirera B,Gazielsovran A,et al.BRD4sustainsmelanoma proliferation and represents a new target for epigenetic therapy.[J].Cancer Research, 2013,73(20):6264.
4.Filippakopoulos P,Qi J,Picaud S,et al.Selective inhibition of BETbromodomains.[J].Nature,2010,468(7327):1067.
发明内容
本发明的目的在于提供含Bromo功能域蛋白4及其抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
本发明以不同的肝细胞(L02细胞、HepG2细胞为实验对象，分别用BRD4 抑制剂——JQ1和OTX015处理，DMSO作对照，再用(棕榈酸酯/油酸)PA/OA 处理，之后对细胞进行油红O染色，染色结果都显示出：与DMSO对照组相比，抑制剂处理组颜色明显变浅。这表明BRD4被抑制后，可以抑制脂肪堆积，能够改善脂肪肝及相关疾病的发生。
在此基础上，本发明第一方面，提供含Bromo功能域蛋白4作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。
本发明第二方面，提供含Bromo功能域蛋白4的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。
优选的，所述含Bromo功能域蛋白4的抑制剂是抑制BRD4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂、或者抑制BRD4的mRNA水平的抑制剂，其抑制活性是可逆的或不可逆的。
优选的，所述抑制BRD4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂包括BRD4的抗体、抑制BRD4蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、天然化合物、合成化合物、有机物、无机物；所述抑制BRD4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂是指可以结合BRD4但在结合时不产生生物应答的物质，或者所述抑制剂可以阻断、抑制或减弱由激动剂介导的应答，并可与激动剂竞争结合BRD4。
优选的，所述BRD4的抑制剂是JQ1或OTX015或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其代谢产物。
本文所用术语“药学上可接受的盐”是指药物活性化合物的衍生物，其中通过制备其酸式盐或碱式盐来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于，碱性残基(如胺类)的无机酸盐或有机酸盐，酸性残基(如羧酸)的碱性盐或有机盐，等。药学上可接受的盐包括由诸如无毒性的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒性的盐或季铵盐。例如，这些常规的无毒性盐包括那些源自无机酸的盐，如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有机酸制备的盐，如，乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、延胡索酸、甲磺酸、甲苯磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸等。
本发明的药学上可接受的盐可以通过常规的化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这种盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸在水或有机溶剂或二者的混合物中反应制备。
优选的，所述BRD4的抑制剂是JQ1或OTX015及药学上可接受的辅料。
优选的，所述药学上可接受的辅料是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、pH调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。
所述稀释剂例如：乳糖、淀粉、纤维素衍生物、无机钙盐、山梨醇等。所述粘合剂例如：淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。所述抗氧化剂例如：维生素E、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、丁羟基茴香醚等。所述pH调节剂例如：盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸、Tris、乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。所述防腐剂例如：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、间甲酚、苯扎氯铵等。所述润滑剂例如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。所述崩解剂例如：淀粉、甲基纤维素、黄原胶、交联羧甲基纤维素钠等。
优选的，所述BRD4的抗体包括但不限于单克隆抗体、合成抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)(包括双特异性scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和任何上述的表位结合片段。特别地，用于本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。用于本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。优选地，抗体是人或人源化单克隆抗体。
如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从由人基因表达抗体的小鼠或其它动物分离的抗体。
优选的，抑制BRD4的mRNA水平的抑制剂可以是其反义核酸序列、siRNA、 miRNA、shRNA、dsRNA，或者其它能够抑制BRD4的mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、化合物。
本发明药物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。
本发明的药物可施用于会发生或已经发脂肪肝及相关疾病的任何动物。这些动物包括人类和非人类的动物，例如宠物或牲畜等。
本发明的药物可以本领域已知的途径施用于受试者，包括但不限于口服，胃肠外，皮下，肌内，静脉内，腹腔内，肝内，心肌内，肾内，***，直肠，颊，舌下，鼻内，透皮方式等。
施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，或者总日剂量以每天两次，三次或四次的分开剂量施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。
所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发现BRD4基因的新功能，即BRD4基因具有恶化脂肪肝及相关疾病的作用。
(2)基于BRD4在恶化脂肪肝及相关疾病中的作用，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物提供靶标。
(3)BRD4的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物。
(4)本发明发现BRD4特异性抑制剂JQ1或OTX015的新功能，其可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物。
附图说明
图1是L02细胞经抑制剂处理3h，0.2/0.4mM PA/OA处理12h后的油红O 染色结果图；A为对照DMSO组，B为0.5μM JQ1处理组，C为0.5μM OTX015 处理组。
图2是HepG2细胞经抑制剂处理3h，0.1/0.2mM PA/OA处理12h后的油红 O染色结果图；A为对照组DMSO组，B为0.5μM JQ1处理组，C为0.5μM OTX015处理组。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实验用细胞系及培养：
L02：人肝细胞系，购自中国科学院细胞库，目录号GNHu6。
HepG2：人肝癌细胞系，
细胞均培养于DMEM高糖培养基(含10％FBS)中。培养环境：37℃，5％ CO2。
实验用抑制剂：
(+)-JQ1购自sigam公司，货号：SML1524
OTX015购自sigam公司，货号：SML1605
细胞油红O染色：
1.取出细胞，吸出培养基，加PBS漂洗3次，洗净后尽量吸干PBS。
2.4％多聚甲醛37℃固定15min。
3.结束后，弃甲醛，加入PBS漂洗3次，每次3分钟。
4.加入60％异丙醇作用30s，完成后用PBS洗3次。
5.超净台内吹干水分，水分完全干透后，皿底呈白色。
6.准备油红O的工作液，Red Oil：PBS＝3:2配置。油红配置好后室温静置 10min，然后用0.45μM滤器过滤，即可使用。
7.吹干后加工作液，染色过程中及时观察，达到要求后吸弃染色液。
8.用PBS洗3次，加PBS浸润拍照观察。
【实施例1】BRD4抑制剂处理对L02细胞脂质堆积的影响
L02细胞分为三组培养，待细胞贴壁后，分别加入DMSO、0.5μM JQ1、0.5 μM OTX015处理3h后，用0.2/0.4mM PAOA处理12h，进行油红O染色。
染色结果如图1所示，与对照组DMSO组相比，抑制剂处理组颜色明显变浅。该结果说明，经BRD4抑制剂处理后的L02细胞，脂质堆积受到明显抑制。【实施例2】BRD4抑制剂处理对HepG2细胞脂质堆积的影响
HepG2细胞分为三组培养，待细胞贴壁后，分别加入DMSO、0.5μM JQ1、 0.5μMOTX015处理3h，然后用0.1/0.2mM PA/OA处理12h后，进行油红O染色。
染色结果如图2所示，与对照组DMSO组相比，抑制剂处理组颜色明显变浅。该结果说明，经BRD4抑制剂处理后的HepG2细胞，脂质堆积受到明显抑制。
上述结果显示，BRD4的表达被抑制后，可显著改善PA/OA刺激诱导的肝脏脂质堆积，说明BRD4基因对恶化脂肪肝及相关疾病的发生发展具有显著作用。BRD4可用于筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物，BRD4的抑制剂如JQ1、OTX015可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.含Bromo功能域蛋白4作为药物靶标在筛选制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物是抑制含Bromo功能域蛋白4表达的药物。
3.含Bromo功能域蛋白4的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Bromo功能域蛋白4的抑制剂是抑制Bromo功能域蛋白4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂、或者抑制Bromo功能域蛋白4的mRNA水平的抑制剂，其抑制活性是可逆的或不可逆的。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制Bromo功能域蛋白4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂包括Bromo功能域蛋白4的抗体、抑制Bromo功能域蛋白4蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、天然化合物、合成化合物、有机物、无机物；所述抑制Bromo功能域蛋白4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂是指可以结合Bromo功能域蛋白4但在结合时不产生生物应答的物质，或者所述抑制剂可以阻断、抑制或减弱由激动剂介导的应答，并可与激动剂竞争结合Bromo功能域蛋白4。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Bromo功能域蛋白4的抑制剂是JQ1或OTX015或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其代谢产物。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制Bromo功能域蛋白4的mRNA水平的抑制剂是其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者其它能够抑制Bromo功能域蛋白4的mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、化合物。
8.权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，脂肪肝及其相关疾病包括但不限于：单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
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