CN108179188A - 一种检测基因突变的新型试剂盒 - Google Patents

一种检测基因突变的新型试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括：a)带有第一检测标记的突变区探针，所述突变区探针能与基因的热点突变区域的突变序列杂交；b)带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的突变区域野生型序列杂交。通过使用该试剂盒获得所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号，计算突变基因的拷贝数和突变频率，确定所述基因的热点突变区域中是否存在突变。

Description

一种检测基因突变的新型试剂盒
技术领域
本发明涉及检测基因突变的试剂盒及其方法，特别涉及检测在基因的热点突变区域的基因突变。
背景技术
突变基因的检测对于临床用药及个性化治疗均具有重要的指导意义。约70％的乳腺癌为***受体(Oestrogen recreptorα，ER)表达阳性，常规治疗使用内分泌疗法。然而，约25％的原发性乳腺癌和几乎所有转移性乳腺癌的病人具有或最终发展出内分泌抵抗。内分泌抵抗的病人使用它莫西芬或芳香酶抑制药等内分泌疗法进行治疗是无效的。近期临床实验数据显示，基因ESR1(编码ER的基因)激活突变是乳腺癌产生内分泌抵抗的一个重要原因，这些突变集中在ESR1上的配体结合区域。因此，乳腺癌患者检测ESR1基因的突变状态对是否使用内分泌疗法和病程监控具有关键的指导意义。
对肿瘤患者检测的金标准是使用从肿瘤组织中抽提的DNA进行检测。鉴于部分病人肿瘤组织很难获得，比如乳腺癌病人发现较晚不适合进行手术切除或组织活检，以及在治疗过程中需要多次取样进行病程监控，血液中的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是进行ESR1突变检测的另一个样本来源。由于ctDNA在血液中含量极低，使用常规PCR方法不再能够检测到。微滴数字PCR平台(Droplet digital PCR，ddPCR)是基于PCR技术的第三代检测方法，采用一种全新的方式对核酸分子进行绝对定量，与传统PCR、定量PCR相比，具有更高的精确度、准确度和灵敏性。ddPCR定量的结果不再依赖于Ct值，实现真正意义上的绝对定量。
发明内容
本发明提供了一种试剂盒，包括：
a)带有第一检测标记的突变型探针，所述突变型探针能与基因的突变区域杂交；
b)带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的突变区域野生型序列杂交；和
c)说明书，所述说明书提供了检测所述基因的热点突变区域中是否存在突变的说明，其中通过对样本进行数字PCR扩增，用所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号计算突变基因的拷贝数；
其中所述目的基因为ESR1基因，所述热点突变选自ESR1基因的E380Q、V392I、V534E、P535H、L536R、L536Q、Y537C中的一个或多个。
在一个实施例中，所述E380Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:1所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:12所示；所述V392I的突变型探针序列如SEQ ID NO:2所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:13所示；所述V534E的突变型探针序列如SEQ ID NO:4所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:15所示；所述P535H的突变型探针序列如SEQID NO:5所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:16所示；所述L536R的突变型探针序列如SEQ ID NO:6所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:16所示；所述L536Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:7所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:16所示；所述Y537C的突变型探针序列如SEQ ID NO:8所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:17所示。
在一个具体实施例中，所述试剂盒还包括一种或多种选自下组的试剂：
a)DNA聚合酶；b)核苷酸单体混合物；和c)能够扩增含有所述突变位点模板序列的一对引物。
在一个具体实施例中，扩增E380Q的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:19所示，反向引物序列为SEQ ID NO:24所示；扩增V392I的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:20所示，反向引物序列为SEQ ID NO:25所示；扩增V534E的突变点的正向引物序列如SEQ IDNO:22所示，反向引物序列为SEQ ID NO:27所示；扩增P535H的突变点的正向引物序列如SEQID NO:22所示，反向引物序列为SEQ ID NO:27所示；扩增L536R的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:22所示，反向引物序列为SEQ ID NO:27所示；扩增L536Q的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:22所示，反向引物序列为SEQ ID NO:27所示；扩增Y537C的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:28所示。
在本发明提供的试剂盒中，所述热点突变还包括S463P、Y537N、Y537S、Y538G中的一种或多种。
在一个具体实施中，所述S463P的突变型探针序列如SEQ ID NO:3所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:14所示；所述Y537N的突变型探针序列如SEQ ID NO:9所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:17所示；所述Y537S的突变型探针序列如SEQ IDNO:10所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:17所示；所述D538G的突变型探针序列如SEQ ID NO:11所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:18所示。
在一个具体实施例中，扩增S463P的突变点正向引物序列如SEQ ID NO:21所示，反向引物序列为SEQ ID NO:26所示；扩增Y537N的突变点正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列为SEQ ID NO:28所示；扩增Y537S的突变点正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列为SEQ ID NO:28所示；扩增D538G的突变点正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列为SEQ ID NO:28所示。
本发明的另一方面，还提供了一种用途，前述试剂盒能用于检测基因的热点突变区域中是否存在突变，优选检测临床样本中基因热点突变区域中是否存在突变，其中临床样本优选为包含基因突变型和野生型的混合样本。
在前述任一的试剂盒中，所述第一检测标记或所述第二检测标记选自由FAM、-四氯荧光素(Tetrachlorofluorescein，简称TET)、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、德克萨斯红(Texas Red)、Quasar FITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、罗丹明6G(rhodamine 6G，简称P6G)、四甲基罗丹明(tetramethyirhodamine，简称TMR)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate，简称TMRITC)、X-罗丹明(x-rhodamine)、生物素、和亲和素所组成的组，其中所述第一检测标记和所述第二检测标记不相同。
本发明还提供了一种探针组合物，包含：
a)带有第一检测标记的突变区突变型探针，所述突变型探针能与基因的突变区域杂交；和
b)带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的野生型序列杂交；
其中，所述目的基因为ESR1基因，所述热点突变选自ESR1基因的E380Q、V392I、V534E、P535H、L536R、L536Q、Y537C中的一个或多个。
在一个具体实施例中，探针组合中所述E380Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:1所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:12所示；所述V392I的突变型探针序列如SEQ IDNO:2所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:13所示；所述V534E的突变型探针序列如SEQ ID NO:4所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:15所示；所述P535H的突变型探针序列如SEQ ID NO:5所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:16所示；所述L536R的突变型探针序列如SEQID NO:6所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:16所示；所述L536Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:7所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:16所示；所述Y537C的突变型探针序列如SEQ ID NO:8所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:17所示。
在一个具体实施例中，所述探针组合物种所述热点突变还包括S463P、Y537N、Y537S、Y538G中的一种或多种。
其中，所述S463P的突变型探针序列如SEQ ID NO:3所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:14所示；所述Y537N的突变型探针序列如SEQ ID NO:9所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:17所示；所述Y537S的突变型探针序列如SEQ ID NO:10所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:17所示；所述D538G的突变型探针序列如SEQ ID NO:11所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:18所示。
本发明还提供了一种检测基因的拷贝数是否存在变异的方法，其中，该方法的步骤包括：
a)对目的基因突变区域进行数字PCR扩增，其中反应混合物包括：带有第一检测标记的突变型探针，所述突变型探针能与基因的突变区域杂交；带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的突变区域野生型序列杂交；和
b)检测所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号。
其中，所述目的基因为ESR1基因，所述热点突变选自ESR1基因的E380Q、V392I、V534E、P535H、L536R、L536Q、Y537C中的一个或多个。
所述E380Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:1所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:12所示；所述V392I的突变型探针序列如SEQ ID NO:2所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:13所示；所述V534E的突变型探针序列如SEQ ID NO:4所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:15所示；所述P535H的突变型探针序列如SEQ ID NO:5所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:16所示；所述L536R的突变型探针序列如SEQ IDNO:6所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:16所示；所述L536Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:7所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:16所示；所述Y537C的突变型探针序列如SEQ ID NO:8所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:17所示。
附图说明
图1示出检测ESR1基因中热点突变区域的突变分布示意图。在ESR1基因的配体结合区域，从380号氨基酸到538号氨基酸有11个突变热点。
图2示出检测V392I突变的第一套引物探针，其退火温度优化结果图。
图3示出检测V392I突变的第二套引物探针，其退火温度优化结果图。
图4示出检测V392I突变的第一套引物探针的纯野生模板背景、NTC背景和阳性信号。
图5示出检测V392I突变的第二套引物探针的NTC背景、纯野生模板背景和阳性信号。
如本文所述，术语“基因”是指在本发明中是指编码蛋白的DNA序列，例如，但不限于，存在于细胞基因组中的编码蛋白的DNA序列。本发明的方法可以用于检测特定基因，例如，ESR1基因(NM_000125.3)。
如本文所述，术语“热点突变区域”是指在基因中的一段连续的核苷酸序列，其中含有多个点突变位点。
如本文所述，术语“点突变”是指从野生型碱基改变为另一个不同的碱基，即突变型碱基。“点突变位点”是指具有点突变可能的一个特定的碱基位置，在这里既可能是野生型碱基也可能是突变型碱基。例如，在某基因的某个点突变位点处(例如第3位碱基)，野生型的碱基是A，但突变型的碱基是G，并且在该点突变位点处通常不会出现C或T碱基。在某些实施方式中，某个点突变位点的野生型碱基可能突变成不止一种的突变型的碱基。例如，在这种情况下，在某个点突变位点处，假设野生型的碱基是A，突变型的碱基可以有两种可能(例如可以是G或C，或者可以是G或T，或者可以是C或T)，或者有三种可能(例如可以是G、C或T)。因此，在热点突变区域中，每个点突变位点至少存在两种或更多种碱基的可能(即，野生型和至少一种突变型)。
在某些实施方式中，所述热点突变区域为ESR1基因的中的第380，392，463，534，535，536，537和538密码子。ESR1基因的热点突变区域的突变型序列如SEQ ID NO：1-11所示，热点突变区域的野生型序列如SEQ ID NO：12-18所示。在上述第380，392，463，534，535和538这6个密码子的碱基中，各存在1个点突变位点，即第380个密码子的第1碱基，第392个密码子的第1碱基，第463个密码子的第1碱基，第534个密码子的第2碱基，第535个密码子的第2碱基，和第538个密码子的第2位碱基。在某些点突变位点处，存在两种或以上突变型碱基，例如第536位密码子的第2位碱基处存在2种突变型碱基(即，A或G)，第537位密码子的第1位碱基处存在1种突变型碱基，第2位碱基处存在2种突变型碱基(即，C或G)。具体如表1所示。
表1.ESR1密码子380-538的示例性的突变
KRAS密码子 突变 氨基酸
密码子380 第1位的g突变为c E380Q
密码子392 第1位的g突变为a V392I
密码子463 第1位的t突变为c S463P
密码子534 第2位的t突变为a V534E
密码子535 第2位的c突变为a P535H
密码子536 第2位的t突变为g L536R
密码子536 第2位的t突变为a L536Q
密码子537 第2位的a突变成g Y537C
密码子537 第1位的t突变成a Y537N
密码子537 第2位的a突变成c Y537S
密码子538 第2位的a突变成g D538G
本发明的试剂盒涉及DNA扩增的反应混合物，其中含有突变区野生型探针和探针。探针通常具有适当的长度，例如10-50个核苷酸、10-45个核苷酸、10-40个核苷酸、10-35个核苷酸、10-30个核苷酸、10-25个核苷酸、10-20个核苷酸、或10-15个核苷酸。
如本文所述，术语“突变区野生型探针”是指，当所述热点突变区域的全长由野生型序列组成时，能够在所述热点突变区域的全长范围内与之特异性杂交的核酸探针。“特异性杂交”在本发明中是指，在严谨的条件下专一地与目标靶序列互补结合，而不与不希望的其他序列互补结合。就突变区野生型探针而言，其在严谨的条件下专一地与突变区的全长野生型序列互补结合，而不与突变区的任何一种突变序列互补结合。“严谨的条件”在本发明中是指，在由5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS、和100μg/mL变性的鱼精DNA组成的溶液中在42℃杂交，然后用包含0.5×SSC和0.1％SDS的溶液在42℃洗涤。
在某些实施方式中，突变区野生型探针包含与SEQ ID NO:12-18全长至少80％互补的序列。在某些实施方式中，突变区野生型探针包含SEQ ID NO:12-18全长100％互补的序列。
如本文所述，术语“突变区突变型探针”是指，能够与所述热点突变区域的突变位点特异性杂交的核酸探针。
在某些实施方式中，突变区突变型探针与SEQ ID NO:1-11的等长部分特异性杂交。在某些实施方式中，突变区突变型探针包含与SEQ ID NO:1-11的等长部分至少80％(例如，至少80％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)互补的序列。在某些实施方式中，突变区突变型探针包含与SEQ ID NO:1-11的等长部分100％互补的序列。
核酸探针在本发明中是指带有检测标记的寡核苷酸分子。本发明所述的突变区突变型探针带有第一检测标记，突变区野生型探针带有第二检测标记。“检测标记”在本发明中是指能够产生检测信号的分子或基团。
检测标记包括，但不限于，荧光分子(例如，参见欧洲专利EP144914)、放射性同位素(例如，参见美国专利US4358535和4446237)、抗体、酶和寡核苷酸(例如，寡核苷酸条形码)。
荧光分子的例子包括但不限于6-carboxyfluorescein(FAM)、Tetrachlorofluorescein(TET)、Alexa(例如Alexa 488,Alexa 532)、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G(P6G)及其衍生物(tetramethyirhodamine(TMR),tetramethylrhodamine isothiocyanate(TMRITC),x-rhodamine,Texas red,由位于美国俄勒冈州尤金市的分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)生产的商品名为"BODJPY FL"、"BODIPY FL/C3"、"BODIPY EL/C6"、"BODIPY 5-FAM"、"BODIPY TMR"、"BODIPY TR"、"BODIPY R6G"、"BODIPY 564"、"BODIPY 581"的探针及衍生物。
检测标记的示例还可以参见美国专利号5,723,591和5,928,907；WO2011066476和WO2012149042；www.idahotech.com；Gudnason等人，NucleicAcids Res.，35(19)：e127(2007)，其全文通过引用并入本发明。
检测标记可以通过共价键或非共价键连接在寡核苷酸分子上。非共价键包括但不限于氢键、离子键、范德华力和疏水键。例如，在一些实施方式中，检测标记可以通过共价键连接在核苷酸分子上。例如，在合成寡核苷酸分子时可以掺入氨基烯丙基(amino-allyl)UTP，所产生的氨基烯丙基标记的核酸分子可以和含有NHS－酯(NHS-ester)的荧光分子(例如Alexa 488,Alexa 594,Alexa 647(Invitrogen)或Cy3(GE Healthcare))偶联形成共价键连接。
在某些实施方式中，所述第一检测标记或所述第二检测标记选自：FAM、Tetrachlorofluorescein(TET)、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G(P6G)、tetramethyirhodamine(TMR)、tetramethylrhodamine isothiocyanate(TMRITC)、x-rhodamine、Texas red、生物素、亲和素，其中所述第一检测标记和所述第二检测标记不相同。在某些实施方式中，第一检测标记可产生第一信号，第二检测标记可产生第二信号。本领域技术人员可以根据实际情况选择适当的第一检测标记和第二检测标记，只要第一检测标记的第一信号和第二检测标记的第二信号能够在同一个样品中被独立地且准确地检测即可。例如，在某些实施方式中，第一检测标记是能够通过红色荧光通道检测的荧光分子，例如，Cy5、Alex 594、Alex 633、Alex647、Texas Red、VIC，第二检测标记是能够通过绿色荧光通道检测的荧光分子，例如，6-FAM、Alex 488、FITC。在某些实施方式中，所述第一检测标记和所述第二检测标记分别选自FAM和VIC。在某些实施方式中，所述第一检测标记是FAM，所述第二检测标记是VIC。
在某些实施方式中，所述突变区突变型探针还带有可淬灭第一信号的第一淬灭剂，和/或所述突变区野生型探针还带有可淬灭第二信号的第二淬灭剂。“淬灭剂”在本发明中是指，当与检测标记在空间上足够靠近时，能够阻止检测标记产生检测信号的分子。当淬灭剂与检测标记距离较远时，淬灭剂不能阻止检测信号的产生。
淬灭分子的例子包括但不限于DDQ-I、DDQ-II、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、"QSY7"、"QSY-21"和"QSY33"(分子探针公司)、Ferrocene及其衍生物、methyl viologen、tetramethylrhodamine(TAMRA)、Minor groovebinding non-fluorescent quencher(MGBNFQ)和N,N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium。
在某些实施方式中，所述荧光分子是FAM，所述淬灭分子是MGBNFQ或DDQ-I。在某些实施方式中，所述荧光分子是TAMRA、Cy3、ROX、Cy5，所述淬灭分子是DDQ-II。在某些实施方式中，所述荧光分子是FAM、HEX、ROX、JOE，所述淬灭分子是Dabcyl。在一些实施方式中，所述探针在5'端具有荧光分子FAM或VIC，在3'端具有淬灭分子MGBNFQ。
可以通过本领域公知的方法将淬灭分子连接在突变区突变型探针和/或野生型探针上。例如，在合成寡核苷酸分子时可以掺入氨基烯丙基(amino-allyl)UTP，所产生的氨基烯丙基标记的核酸分子可以和含有NHS－酯(NHS-ester)的淬灭分子偶联形成共价键连接。又例如，可以在合成寡核苷酸的过程中在3’端通过和淬灭分子(例如Dabcyl)的亚磷酰胺衍生物反应将淬灭分子连接到寡核苷酸上。
在某些实施方式中，当所述突变区突变型探针是完整的时，所述第一信号被淬灭。在某些实施方式中，当所述突变区野生型探针是完整的时，所述第二信号被淬灭。在某些实施方式中，检测标记和淬灭剂分别连接在探针的5’端和3’端。例如，突变区突变型探针的5’端连接第一检测标记，3’端连接第一淬灭剂，或者3’端连接第一检测标记，5’端连接第一淬灭剂。再例如，突变区野生型探针的5’端连接第二检测标记，3’端连接第二淬灭剂，或者3’端连接第二检测标记，5’端连接第二淬灭剂。
在某些实施方式中，使用具有5’-3’外切酶活性的聚合酶扩增含有所述热点突变区域的模板序列，并在反应混合物中加入所述探针。在扩增过程中，如果所述探针与模板序列杂交，所述探针将会被聚合酶在聚合反应过程中降解，从而使所述探针上的荧光分子与淬灭分子分离，并产生荧光信号(参见美国专利US5210015和US5487972)。
本发明的方法涉及的反应混合物中包含含有所述基因的热点突变区域的DNA样品。所述样品可以是从对象采集的任何合适的生物材料，例如体液(如血液)和活检样品(如从疾病影响的部位获取的细胞或组织)。
可以使用本领域已知的方法获取样品中的核酸。可以使用本领域已知的从生物样品中提取核酸的方法(参见，例如Nucleic Acids Isolation Methods，Bowein(编)，American Scientific Publishers(2002))。样品中可以包括分离的DNA，例如分离的基因组DNA或从mRNA在体外反转录形成的cDNA。或者，样品中可以包括未纯化或未扩增的核酸。例如，样品中可以包括分离的细胞或组织。可选地，所述分离的细胞或组织通过预处理释放包含在其中的核酸。在进一步的实施方式中，样品中的核酸可以通过例如PCR或反转录进行扩增。
在某些实施方式中，所述样品来源于疾病患者，所述疾病与在所述热点突变区域的突变相关。在某些实施方式中，所述疾病是肿瘤、癌症或遗传疾病。在某些实施方式中，所述样品来源于肿瘤或癌症的细胞或组织。
本发明的方法涉及的反应混合物中还包含一对引物，所述引物能够扩增含有所述热点突变区域的模板序列。
本发明所述的“引物”是指能够和/或用于启动核酸模板的复制的寡聚核苷酸分子，其通常具有7-40个核苷酸、10-38个核苷酸、15-30个核苷酸、15-25个核苷酸，或者17-20个核苷酸。例如，引物可以是长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个的寡聚核苷酸。引物可以包含DNA、RNA、核酸类似物、或其任意的组合。示例性引物可以是化学合成的。在本发明所述的一对引物中，其中一条引物可以与突变区域的5’-3’链的第一位置结合，另一条引物可以与突变区域的3’-5’链的第二位置结合，当通过DNA扩增反应延伸这对引物时，可以扩增从第一位置开始到第二位置结束的区域，该区域也叫模板序列，扩增得到的核酸分子称为扩增产物。
所述引物能够扩增的目标序列含有所述突变位点。本领域技术人员能够根据所述突变位点在基因序列上的具***置，结合考虑期望的扩增产物的长度，引物设计难易程度等因素，选择出适当的引物序列。在某些实施方式中，扩增产物的长度为100bp-1000bp(例如约50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp)、100bp－1500bp、100bp－2000bp。
在某些实施方式中，所述引物的序列为SEQ ID NO:19-23和SEQ ID NO:24-28。
本发明的方法涉及的反应混合物中还包含DNA聚合酶。“DNA聚合酶”在本发明中是指任何具有使用存在的DNA作为模板催化DNA合成功能的多肽。本领域公知的任何适合DNA合成或复制的聚合酶都可以使用。DNA聚合酶的例子包括，但不限于，Taq DNA聚合酶(例如，野生型酶、Stoffel片段和FastStart聚合酶等)、Pfu DNA聚合酶、S-Tbr聚合酶、Tth聚合酶、Vent聚合酶、或其组合。在一些实施方式中，可以使用一种或多种耐热的聚合酶来完成DNA扩增，例如Taq DNA聚合酶(例如，野生型酶、Stoffel片段和FastStart聚合酶等)、Pfu DNA聚合酶、S-Tbr聚合酶、Tth聚合酶、Vent聚合酶、或其组合。
在某些实施方式中，DNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性。具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶的例子包括，但不限于，E.coli DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(参见美国专利US4889818)。DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性可以被用来进行定量PCR检测样品中的目标核酸分子(参见美国专利US5210015)。
本发明的方法包括使用所述反应混合物进行DNA扩增。在某些实施方式中，通过聚合酶链式反应(PCR)进行DNA扩增。简单地说，通过使用交替加热和冷却的循环以进行DNA扩增，一个循环通常包括在变性温度下使模板DNA分子解链成单链、在退火温度下使引物与单链的模板DNA分子通过碱基互补结合、和在延伸温度下使DNA聚合酶延伸引物。根据具体的情况不同，退火温度和延伸温度可以相同或不同。
在某些实施方式中，所述扩增通过数字PCR的方法扩增。数字PCR的方法通过最终产物来定量检测样品中的目标核酸分子，而不需要像传统定量PCR方法那样测定扩增曲线。数字PCR的原理是将样品分成数个较小的亚体积(例如，微滴)进行PCR扩增，通过计数含有阳性扩增产物的所述亚体积(例如微滴)的数目，推导出起始样品中的目标核酸分子的拷贝数。关于数字PCR方法的综述，参见例如Pohl等人，Expert Rev.Mol.Diagn.，4(1)：41-7(2004)；Hindson等人，Anal.Chem.2011,83,8604-8610；Pinheiro等人，Anal.Chem.2012,84(2),1003-1011等，其全文在此参考并入。在一些实施方式中，可以使用QX100TM DropletDigital PCR System(QX100TM Droplet Generator，QX100TM Droplet，BIO-RAD)进行数字PCR扩增。
本发明的检测试剂盒还包括检测在扩增产物中所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号。
在扩增过程中，突变区突变型探针和突变区野生型探针可以分别与单链模板分子上的特定区域结合，形成双链区。当突变区突变型探针结合时，突变型探针产生第一检测信号。当突变区野生型探针结合时，突变区野生型探针产生第二检测信号。例如，当使用具有5'-3'的外切酶活性的DNA聚合酶和具有荧光检测标记和淬灭剂的探针时，DNA聚合酶会在引物延伸到双链区时切断与模板结合的探针，从而使探针中的荧光检测标记和淬灭剂分离，使得淬灭剂无法再淬灭荧光检测标记的信号，因此荧光检测标记能够发出检测信号。
所述第一信号和第二信号可以通过本领域公知的方法进行检测。例如，在某些实施方式中，第一检测标记是能够通过绿色荧光通道检测的荧光分子，例如，6-FAM、Alex488、FITC，第二检测标记是能够通过红色荧光通道检测的荧光分子，例如，Cy5、Alex 594、Alex 633、Alex 647、Texas Red、VIC。通过不同的荧光通道(例如，绿色荧光通道和红色荧光通道)可以检测PCR反应过程中或最终产物中的第一信号和第二信号。
当使用数字PCR进行DNA扩增时，可以对含有DNA扩增产物的每个亚体积进行检测。通过检测该信号，可确定被检测的亚体积(例如微滴)中是否存在感兴趣的PCR扩增产物，和/或感兴趣的PCR扩增产物的量。可以通过本领域公知的方法检测亚体积(例如微滴)中的可检测信号。例如，可以使用检测器对每个亚体积(例如微滴)进行成像，并将成像结果进行分析。示例的检测/成像装置例如WO2007091228、WO2007091230、WO2008038259、WO2010036352、Zhang等人Nucleic Acids Res.，35(13)：4223-4237(2007)、Wang等人，J.Micromech.Microeng.，15：1369-1377(2005)；Jia等人，38：2143-2149(2005)；Kim等人，Biochem.Eng.J.，29：91-97；Chen等人，Anal.Chem.，77：658-666；Chen等人，Analyst，130：931-940(2005)；Munchow等人，Expert Rev.Mol.Diagn.，5：613-620(2005)；Charbert等人，Anal.Chem.，78：7722-7728(2006)；和Dorfman等人，Anal.Chem，77：3700-3704(2005)中所描述的那些，其全文通过引用并入本发明。还可以对流动的或静态的微滴进行检测。
本发明的检测方法还包括确定所述基因的所述热点突变区域是否具有突变的步骤。根据对第一信号和第二信号的检测结果，可以确定所述基因的所述热点突变区域是否具有突变。突变区突变型探针产生的检测信号为第一信号，指示扩增产物中含有突变型序列的量。突变区野生型探针产生的检测信号为第二信号，指示在所述热点突变区域含有野生型序列的那部分扩增产物的量；当第一信号存在一定量时，可以确定所述热点突变区域具有突变。在某些实施方式中，检测方法还包括将第一信号和第二信号的检测结果同对照(例如，阳性对照和阴性对照)相比较。例如，在检测ESR1突变时，可以使用已知具有ESR1突变的样品作为阳性对照，使用正常人来源的样品作为阴性对照。如何使用对照来确定检测结果的可靠性是本领域常规技术人员已知的。
在某些实施方式中，所述热点突变区域的点突变与疾病相关。例如，14-54％的转移性ER阳性的乳腺癌中有ESR1激活性基因突变，其中突变主要集中在第536-358密码子。
在某些实施方式中，所述热点突变区域的点突变与个体对某种疗法的反应性相关。例如，ESR1热点区域突变个体对针对ER的内分泌药物(如tamoxifen/aromataseinhibitor)具有降低的敏感性。
本发明还提供了用于诊断个体在基因的热点突变区域中是否具有突变的方法，包括：使用反应混合物进行DNA扩增，所述反应混合物含有：含有来自所述个体的基因的热点突变区域的DNA样品、DNA聚合酶、核苷酸单体混合物、扩增缓冲液、能够与所述热点突变区域的突变型序列特异性杂交的带有第一检测标记的突变型探针、能够在所述热点突变区域与野生型序列特异性杂交的带有第二检测标记的突变区野生型探针、以及一对引物，其能够扩增含有所述突变区域的模板序列；检测在扩增产物中所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号，其中所述第一信号指示突变型序列的量，所述第二信号指示在所述突变区域含有野生型序列的那部分扩增产物的量；确定所述个体在所述基因的热点突变区域是否具有突变。在某些实施方式中，所述基因是ESR1。在某些实施方式中，所述个体被怀疑为或被诊断为患有疾病或状况。在某些实施方式中，所述疾病或状况是癌症。在某些实施方式中，所述癌症是乳腺癌。
本发明还提供了用于识别个体是否对疗法具有反应性的方法，包括：根据前述方法确定所述个体在所述基因的热点突变区域是否具有突变，并确定所述个体对所述疗法是否具有反应性。在某些实施方式中，所述基因是ESR1。所述个体被诊断为患有疾病或状况。在某些实施方式中，所述疾病或状况是癌症。在某些实施方式中，所述癌症是乳腺癌。
本发明还提供了核酸探针，包含：能够与所述热点突变区域的突变区域杂交的带有第一检测标记的突变型探针；和能够在基因的热点突变区域与野生型序列杂交的带有第二检测标记的突变区野生型探针。在某些实施方式中，突变区野生型探针包含与SEQ IDNO:12-18全长至少80％互补的序列。在某些实施方式中，突变区野生型探针包含SEQ IDNO:12-18全长100％互补的序列。
在某些实施方式中，突变区突变型探针与SEQ ID NO:1-11的等长部分特异性杂交。在某些实施方式中，突变区突变型探针包含与SEQ ID NO:1-11的等长部分至少80％(例如，至少80％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)互补的序列。在某些实施方式中，突变区突变型探针包含与SEQ ID NO:1-11的等长部分100％互补的序列。
本领域技术人员可以根据实际情况选择适当的第一检测标记和第二检测标记，只要第一检测标记的第一信号和第二检测标记的第二信号能够在同一个样品中被独立地且准确地检测即可。例如，在某些实施方式中，第一检测标记是能够通过绿色荧光通道检测的荧光分子，例如，6-FAM、Alex 488、FITC，第二检测标记是能够通过红色荧光通道检测的荧光分子，例如，Cy5、Alex 594、Alex 633、Alex 647、Texas Red、VIC。
在某些实施方式中，所述基因是ESR1。在某些实施方式中，所述连续突变区域包含ESR1的第380到538个密码子。
在某些实施方式中，所述核酸探针还带有可以在足够靠近的空间距离内淬灭所述荧光分子的淬灭分子。当所述突变型探针是完整的时，所述第一信号被淬灭。在某些实施方式中，当所述突变区野生型探针是完整的时，所述第二信号被淬灭。在某些实施方式中，检测标记和淬灭剂分别连接在探针的5’端和3’端。例如，突变区突变型探针的5’端连接第一检测标记，3’端连接第一淬灭剂，或者3’端连接第一检测标记，5’端连接第一淬灭剂。再例如，突变区野生型探针的5’端连接第二检测标记，3’端连接第二淬灭剂，或者3’端连接第二检测标记，5’端连接第二淬灭剂。
本发明还提供了用于检测基因的热点突变区域中是否存在突变的试剂盒，包含：能够与所述热点突变区域的突变序列杂交的带有第一标记的突变型探针；能够在所述连续突变区域与野生型序列杂交的带有第二标记的突变区野生型探针，和说明书，所述说明书提供了用所述突变型探针和所述突变区野生型探针检测所述基因的热点突变区域中是否存在突变的说明。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括至少一种标准对照品。标准对照品可以是阳性对照，即在所述热点突变区域中具有突变的对照序列，也可以是阴性对照，即在所述热点突变区域中全部为野生型序列的对照序列。标准对照品可以是分离的DNA分子。在某些实施方式中，所述试剂盒中包括阳性对照和阴性对照。例如，在检测ESR1突变时，可以使用已知具有密码子突变的样品作为阳性对照，使用正常人来源的样品作为阴性对照。如何使用对照来确定检测结果的可靠性是本领域常规技术人员已知的。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包含至少一种选自下组的试剂：DNA聚合酶，核苷酸单体混合物，和能够扩增含有所述连续突变区域和所述热点突变区域的模板序列的一对引物。在某些实施方式中，DNA聚合酶为Taq聚合酶。在某些实施方式中，所述正向引物的序列为SEQ ID NO:19-23，反向引物的序列为SEQ ID NO:24-28。
本发明的优势包括，但不限于，使用核酸探针引物对、在一个反应中准确地确定在一段具有多种突变可能的热点突变区域中是否存在突变。
实施例1试剂盒的精确度和灵敏度检测
该试剂盒完整包含11个位点的检测，且检测结果显示都高于QPCR技术，数据主要包括四个方面：退火温度优化，实验背景值，线性范围和检测下限LOQ(Limit ofquantification)。
其中LOQ有两种指标，1)检测CV值小于理论CV值时最小检测样本值；2)检测CV值小于20％时最小检测样本值。数据汇总中使用的是第一种指标。
表2示出检测各个突变位点的探针序列，表3示出扩增突变位点的引物序列。
表2
表3
表4示出了11个突变位点的检测的LOD。MCF7背景拷贝数显示了该检测在纯野生型模板中的背景值，NTC背景显示了在无模板情况下各检测的自身背景。表4可见各检测的纯野生型背景均不高于10拷贝，NTC背景低于2拷贝，远低于临床使用要求的20-30拷贝，说明各检测的背景清晰，不易产生假阳性结果。LOD数值显示了拷贝数在10左右时各检测的平均值和检测误差。总体来看，各检测的背景清晰，检测敏感度高。
表4
实施例2V392I探针优化
在突变位点的检测中，每一个位点使用的探针和引物均是经过大量设计和筛选获得的，其中以V392I为例，多次优化设计得出第一套引物和探针组合，其中
引物序列如下
正向引物：ATGTGCCTGGCTAGAGATCC
反向引物：GCAAACAGTAGCTTCCCTGG
探针序列为
FAM：TTGGTCTCATCTGGCGCT
VIC：TTGGTCTCGTCTGGCGCT
第二套优化的引物和探针序列如下：
引物序列如下
正向引物：AATGTGCCTGGCTAGAGATCC
反向引物：TAGGAGCAAACAGTAGCTTCCC
探针序列为
FAM：TTGGTCTCATCTGGC
VIC：TTGGTCTCGTCTGGC
在获得优选的设计中经过实验结果发现，两套探针引物的最适退火温度都是59℃(见图2和图3)，在59℃条件下同时检测NTC背景、MCF7纯野生型背景和少量阳性模板的信号，结果如图4和图5所示。虽然在无模板和MCF7纯野生型模板扩增后，第一套引物探针的背景稍高于第二套(第一套NTC背景2拷贝，MCF7背景12拷贝；第二套NTC背景0拷贝，MCF7背景9拷贝)，但在阳性模板存在情况下，突变探针的信号更强，与背景值的差异更明显，易于划线分析，检测灵敏度较高。综合考虑，选择第一套引物探针进行检测。
除检测V392I突变的探针进行过优化之外，E380Q、S463P、V534E、P535H、L536Q、L536R、Y537S、Y537N、Y537C、D538G对应的检测探针和野生型探针均进行了相应的优化，结果显示表2和表3中使用的探针和引物获得了更好的效果，其突变探针的信号更强，与背景值的差异更明显，易于划线分析，检测灵敏度较高。
通过引用并入
本文引用的每个专利文献和科学文献的全部公开内容通过引用并入本文用于所有目的。
等效
本发明可以在不脱离其基本特征的情况下以其他具体形式实施。因此，前述实施例被认为是说明性的，而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示，并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。

Claims (11)

1.一种试剂盒，包括：
a)带有第一检测标记的突变型探针，所述突变型探针能与基因的突变区域杂交；
b)带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的突变区域野生型序列杂交；和
c)说明书，所述说明书提供了检测所述基因的热点突变区域中是否存在突变的说明，其中通过对样本进行PCR扩增，用所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号计算突变基因的拷贝数；
其中所述目的基因为ESR1基因，所述热点突变选自ESR1基因的E380Q、V392I、V534E、P535H、L536R、L536Q、Y537C中的一个或多个。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，
所述E380Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:1所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:12所示；
所述V392I的突变型探针序列如SEQ ID NO:2所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:13所示；
所述V534E的突变型探针序列如SEQ ID NO:4所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:15所示；
所述P535H的突变型探针序列如SEQ ID NO:5所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:16所示；
所述L536R的突变型探针序列如SEQ ID NO:6所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:16所示；
所述L536Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:7所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:16所示；
所述Y537C的突变型探针序列如SEQ ID NO:8所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:17所示。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括至少一种选自下组的试剂：
a)DNA聚合酶；
b)核苷酸单体混合物；和
c)能够扩增含有所述突变位点模板序列的一对引物。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，
扩增E380Q的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:19所示，反向引物序列为SEQ IDNO:24所示；
扩增V392I的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:20所示，反向引物序列为SEQ IDNO:25所示；
扩增V534E的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:22所示，反向引物序列为SEQ IDNO:27所示；
扩增P535H的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:22所示，反向引物序列为SEQ IDNO:27所示；
扩增L536R的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:22所示，反向引物序列为SEQ IDNO:27所示；
扩增L536Q的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:22所示，反向引物序列为SEQ IDNO:27所示；
扩增Y537C的突变点的正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，其突变区野生型探针序列为SEQ ID NO:28所示。
5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述热点突变还包括S463P、Y537N、Y537S、Y538G中的至少一种。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其中，
所述S463P的突变型探针序列如SEQ ID NO:3所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:14所示；
所述Y537N的突变型探针序列如SEQ ID NO:9所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:17所示；
所述Y537S的突变型探针序列如SEQ ID NO:10所示，其突变区野生型探针序列为SEQID NO:17所示；
所述D538G的突变型探针序列如SEQ ID NO:11所示，其突变区野生型探针序列为SEQID NO:18所示。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其中，
扩增S463P的突变点正向引物序列如SEQ ID NO:21所示，反向引物序列为SEQ ID NO:26所示；
扩增Y537N的突变点正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列为SEQ ID NO:28所示；
扩增Y537S的突变点正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列为SEQ ID NO:28所示；
扩增D538G的突变点正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列为SEQ ID NO:28所示。
8.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，该试剂盒能用于检测基因的热点突变区域中是否存在突变，优选检测临床样本中基因热点突变区域中是否存在突变，其中临床样本优选为包含基因突变型和野生型的混合样本。
9.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述第一检测标记或所述第二检测标记选自由FAM、四氯荧光素、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、德克萨斯红、Quasar FITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、罗丹明6G、四甲基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、X-罗丹明、生物素、和亲和素所组成的组，其中
所述第一检测标记和所述第二检测标记不相同。
10.一种探针组合物，包含：
a)带有第一检测标记的突变区突变型探针，所述突变型探针能与基因的突变区域杂交；和
b)带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的野生型序列杂交；
其中，所述目的基因为ESR1基因，所述热点突变选自ESR1基因的E380Q、V392I、V534E、P535H、L536R、L536Q、Y537C中的一个或多个；
所述E380Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:1所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:12所示；
所述V392I的突变型探针序列如SEQ ID NO:2所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:13所示；
所述V534E的突变型探针序列如SEQ ID NO:4所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:15所示；
所述P535H的突变型探针序列如SEQ ID NO:5所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:16所示；
所述L536R的突变型探针序列如SEQ ID NO:6所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:16所示；
所述L536Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:7所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:16所示；
所述Y537C的突变型探针序列如SEQ ID NO:8所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:17所示。
11.一种检测基因的拷贝数是否存在变异的方法，其中，该方法的步骤包括：
a)对目的基因突变区域进行数字PCR扩增，其中反应混合物包括：带有第一检测标记的突变型探针，所述突变型探针能与基因的突变区域杂交；带有第二检测标记的突变区野生型探针，所述突变区野生型探针能与基因的突变区域野生型序列杂交；和
b)检测所述第一检测标记的第一信号和所述第二检测标记的第二信号；
其中，所述目的基因为ESR1基因，所述热点突变选自ESR1基因的E380Q、V392I、V534E、P535H、L536R、L536Q、Y537C中的一个或多个，
所述E380Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:1所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:12所示；
所述V392I的突变型探针序列如SEQ ID NO:2所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:13所示；
所述V534E的突变型探针序列如SEQ ID NO:4所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:15所示；
所述P535H的突变型探针序列如SEQ ID NO:5所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:16所示；
所述L536R的突变型探针序列如SEQ ID NO:6所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:16所示；
所述L536Q的突变型探针序列如SEQ ID NO:7所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:16所示；
所述Y537C的突变型探针序列如SEQ ID NO:8所示，其突变区野生型探针序列为SEQ IDNO:17所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112301096A (zh) * 2019-07-26 2021-02-02 杭州丹威生物科技有限公司 一种新型核酸探针标记方法
CN115775591A (zh) * 2023-01-10 2023-03-10 华测检测认证集团股份有限公司 一种引物设计方法、装置、设备及可读存储介质

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