CN108179137A - 一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法 - Google Patents
一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108179137A CN108179137A CN201810067455.3A CN201810067455A CN108179137A CN 108179137 A CN108179137 A CN 108179137A CN 201810067455 A CN201810067455 A CN 201810067455A CN 108179137 A CN108179137 A CN 108179137A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- serum
- plasmid
- preparation
- cells
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物工程领域,更具体地,涉及一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法。包括如下步骤:(1)在片状载体中使用无血清培养基培养293T细胞;(2)将腺相关病毒载体***质粒瞬时转染培养的293T细胞,得到转染后的细胞;所述腺相关病毒载体***质粒包括AAV表达载体质粒,辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8;(3)继续培养步骤(2)所述转染后的细胞,并按时收集和更换所述无血清培养基,得到含有重组腺相关病毒的培养基。本发明的腺相关病毒制备方法既能够保证生产稳定性,又节省了制备和纯化的步骤并显著降低了下游病毒纯化的难度,为一种特别适合工业化规模生产的血清8型腺相关病毒的制备方法。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,更具体地,涉及一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法。
背景技术
目前大规模制备重组AAV的方法主要有两种,一种是基于杆状病毒表达***生产AAV的方法,这种方法制备的重组AAV产量高,成本低,易于操作,但是由于采用昆虫细胞作为生产细胞,在AAV的制备过程中,容易将昆虫基因引入到病毒中,同时在下游纯化的过程中,难以除尽AAV中混杂的杆状病毒,给临床用药带来不可预知的风险。且杆状病毒表达***生产的AAV空壳率较高,已引起机体免疫反应,因此,此种方法在生物制药领域不受人们的青睐。另外的一种方法就是通过三质粒转染293T细胞的方法,制备AAV病毒,此种方法利用人源的细胞系为生产细胞,通过瞬时转染,将产生重组AAV病毒的三个质粒DNA转入到293T细胞中,不引入其他病毒作为辅助生产病毒,大大降低了下游纯化的难度,其缺点是,大规模培养需要消耗大量的人力和物力。目前已经发展出转瓶或细胞工厂、微载体以及无血清培养的方法大规模培养293T细胞,其中贴壁培养(包括转瓶、细胞工厂以及微载体)都要使用胎牛血清,由于血清成份复杂,且不同生产批次的质量差异大,对于细胞的生长状态影响较大,从而影响AAV的产率,且血清的使用容易带来动物源性的污染,大大增加了质量控制环节。无血清悬浮培养293T细胞制备AAV是目前最受欢迎的方法,无血清培养基成份明确,不会引入动物性来源的污染,且质量稳定,易于工艺放大。此种无血清培养动物细胞的方法在生物制药领域受到人们的青睐。
目前生产血清8型的重组相关病毒载体,主要还是以微载体和无血清悬浮培养为主,由于8型腺相关病毒主要分泌在培养基中,因此,在更换培养基和收集病毒液时去除细胞需要耗费大量的资源和设备,且微载体成本昂贵,细胞培养中需要添加血清,增加了下游纯化难度。
片状载体(FibraCel)是经医疗、医药当局认可的安全载体,技术易学实用,且轻松放大至300L,在生物制药领域收到人们的关注。目前使用片状载体培养细胞,主要采用有血清培养,不能很好的满足当前基因治疗药物的需求。
目前重组腺相关病毒的纯化方法主要是基于氯化铯或碘克沙醇密度梯度离心,以及离子交换纯化,或者两种方法结合使用。密度梯度离心的方法获得的重组腺相关病毒纯度高且可以去除空壳病毒,在基因治疗领域有效降低机体免疫反应,但其缺点是通量小,只适合小规模的纯化;离子交换纯化病毒获得的重组病毒纯度较高,适用大规模的纯化重组病毒,但不能去除空壳病毒,且成本昂贵,耗时较长。由于血清8型的重组腺相关病毒在制备的过程中,主要分泌在培养基中,且目前制备病毒多采用血清培养,收集的病毒液中含有大量的蛋白,使用离子交换或密度梯度离心将十分的费力。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种血清8型的腺相关病毒的制备方法,其中通过充分结合血清8型腺相关病毒的特性和腺相关病毒的制备及纯化工艺需求,针对性地对血清8型腺相关病毒的培养载体和培养基进行重新设计,并对关键制备工艺条件进行改进,相应获得的腺相关病毒制备方法既能够保证生产稳定性,又节省了现有腺相关病毒制备和纯化的步骤并显著降低了下游病毒纯化的难度,为一种特别适合工业化规模生产的血清8型腺相关病毒的制备方法。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法,包括如下步骤:
(1)在片状载体中使用无血清培养基培养293T细胞;
(2)将腺相关病毒载体***质粒瞬时转染步骤(1)培养的293T细胞,得到转染后的细胞;所述腺相关病毒载体***质粒包括AAV表达载体质粒,辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8;
(3)继续培养步骤(2)所述转染后的细胞,并按时收集和更换所述无血清培养基,得到含有血清8型的重组腺相关病毒的多次收集的培养基。
优选地,所述的制备方法,还包括如下步骤:
(4)将步骤(3)得到的含有血清8型的重组腺相关病毒的多次收集的培养基的上清合并,通过切向截留***浓缩所述病毒,得到浓缩后的血清8型的重组腺相关病毒;
(5)将步骤(4)浓缩后的血清8型的重组腺病毒通过离子交换柱得到纯化的血清8型的重组腺相关病毒。
优选地,步骤(1)所述培养293T细胞具体包括如下步骤:在经过灭菌和浸泡处理后的片状载体上接种293T细胞,培养细胞至所述片状载体上的细胞量达1×108~3×108cells/g。
优选地,在所述片状载体上接种293T细胞,其接种量为0.5×107~2×107cells/g。
优选地,在温度为37℃、pH为6.8~7.6及DO为30%~60%,搅拌速度为60转/分的条件下培养细胞,至所述片状载体上的细胞量达1×108~3×108cells/g。
优选地,步骤(2)具体步骤包括:将质量比为1:1:1的AAV表达载体质粒、辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8与转染试剂聚乙烯亚胺按照1:2混合后,室温孵育15分钟,然后添加到生物反应器中,在温度为30~37℃、pH为6.8~7.8、DO为30%~60%,搅拌速度为60转/分条件下进行培养。
优选地,每1×108~3×108cells/g细胞转染所需的AAV表达载体质粒、辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8分别为120~200微克。
优选地,每1×108~3×108cells/g细胞转染所需的AAV表达载体质粒、辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8分别为170微克。
优选地,步骤(2)腺相关病毒载体***质粒的稀释液采用无血清的DMEM或PBS。
优选地,步骤(2)每1×108~3×108cells/g细胞转染配置的转染复合物的体积为10毫升;所述转染复合物包括腺相关病毒载体***质粒、转染试剂和腺相关病毒载体***质粒的稀释液。
优选地,步骤(3)所述继续培养所述转染后的细胞的条件为:温度为30~37℃、pH为6.8~7.8、DO为30~60%,连续培养4~6天,每24h收集一次培养基,同时更换新鲜的培养基;一共收集三次培养基,更换两次培养基,最后一次收集培养基2h之前,向培养基中添加氯化钠至氯化钠的终浓度为50mM,促进AAV病毒释放。
优选地,步骤(3)所述切向截流***截流孔径100KD,截流膜材质选用PVDF材质。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,能够取得下列有益效果:
本发明提供了一种新的无血清、片状载体(FibraCel)培养293T细胞生产血清8型重组腺相关病毒的方法,同时还提供了一种基于切向截流过滤与离子交换结合使用的方法纯化8型腺相关病毒的纯化工艺。由此解决现有的293T细胞大规模培养制备血清8型AAV病毒生产及纯化方法工艺复杂、条件设备苛刻等技术问题。
本发明提供了一种无血清、片状载体(FibraCel)培养293T细胞生产血清8型重组腺相关病毒的方法。采用片状载体和无血清培养基在生物反应器中培养293T细胞、然后进行瞬时转染,可以获得质量稳定的重组腺相关病毒。其一是因为片状载体为细胞生长及病毒繁殖提供了三维空间及更大的比表面积,细胞可以生长到更高的细胞密度;其二是采用生物反应器可以实现自动控制培养环境参数,从而使得细胞生长和病毒产生处于最佳的生产环境,极大地提高了病毒滴度,其三,片状载体对细胞强有力的吸附作用,可以在不同时段轻松便捷的多次收获8型的重组腺相关病毒,从而可保证病毒产量更大和质量更稳定。
本发明根据片状载体对细胞的吸附特性,改变传统的使用有血清的培养基培养293T细胞,而使用无血清的培养基。由于细胞被吸附在片状载体上,同时片状载体被固定在生物反应器的篮子中,更换或收集培养基时,十分便利。分多次收集细胞培养基,同时更改新鲜的无血清培养基,极大改善了细胞生长环境,将多次收集的培养基,合并纯化,有效提高病毒的的产率。
AAV8型病毒包装过程中基本上全部都释放到培养基中,如采用完全悬浮培养或者微载体培养,收获病毒液时需要过滤、离心等方法分离细胞,细胞碎片,增加了劳动量和设备成本。片状载体由于物理属性可以作为贴壁细胞的支持物,同时实验发现片状载体对细胞有较强的吸附作用,将293T细胞培养基更换为无血清培养,替代有血清培养,本发明实验发现293T细胞在无血清培养基中也可以很好的贴壁生长,保证了细胞培养的稳定性,及生物制品潜在危害。而且采用本发明的片状载体培养293T细胞制备血清8型AAV病毒,无需采用工业化时成分昂贵的离心分离方法,而仅仅采用切向截留浓缩以及离子交换柱即可实现病毒的纯化,大大降低了现有技术8型AAV病毒制备过程中的纯化难度,为一种能够实现大规模工业化生产的制备和纯化方法。
本发明采用无血清贴壁培养生产8型AAV,结合了血清8型AAV病毒的包装的属性、片状载体的特性,以及无血清培养的优势,既保证了生产的稳定性,又节省了细胞生产过程中的步骤,同时还减少了下游纯化的步骤和难度。
附图说明
图1是本发明采用的片状载体的外观图片;
图2是本发明采用的片状载体的高分辨图片显示的其表面形貌和结构;
图3是本发明实施例1的293T细胞在片状载体上培养7天后的图片;
图4是本发明实施例1的293T细胞在无血清片状载体培养条件下的贴壁速度;
图5是不同血清型重组腺相关病毒在不同培养方式的产率比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供了一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法,包括如下步骤:
(1)在片状载体中使用无血清培养基培养293T细胞。
在经过灭菌和浸泡处理后的片状载体上接种293T细胞,在温度为37℃、pH为6.8~7.6及DO为30%~60%,搅拌速度60转/分的条件下培养细胞,至所述片状载体上的细胞量达1×108~3×108cells/g。片状载体上接种动物细胞,在生物反应器控制培养条件下,检测营养消耗,进行补液或换液处理,培养细胞达到1×108~3×108cells/g时,片状载体上的细胞形成健康、致密的单层,有利于质粒的转染,过高的细胞密度需要消耗大量的培养基,同时瞬时转染时DNA-转染复合物无法被内层细胞吸收,过低的细胞密度则无法实现片状载体培养可实现高密度的优点,生产成本会增加。
片状载体的处理及消毒,浸泡处理采用本领域通用的技术手段处理即可,比如将片状载体首先用PBS缓冲液浸泡,然后高压蒸汽灭菌,排尽PBS后再用培养液浸泡。
片状载体上接种动物细胞,其接种量为0.5×107~2×107cells/g。接种量过高需要消耗大量的人力物力,或过低细胞生长周期会明显的延长,无法达到最佳病毒制备周期。
本发明根据片状载体对细胞的吸附特性,改变传统的使用有血清的培养基培养293T细胞,而使用无血清的培养基。由于细胞被吸附在片状载体上,同时片状载体被固定在生物反应器的篮子中,更换或收集培养基时,十分便利。本发明采用无血清培养基培养293T细胞,无血清培养基不仅限于life公司293free style Medium,Hyclone公司SFM4HEK293等无血清培养基。本发明的片状载体购买自Eppendorf公司,包括但不限于M、N、W、Z、星型、五角形、正方形、菱形等多边形状。
(2)将腺相关病毒载体***质粒瞬时转染步骤(1)培养的293T细胞,得到转染后的细胞;所述腺相关病毒载体***质粒包括AAV表达载体质粒,辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8。
将质量比为1:1:1的AAV表达载体质粒、辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8与转染试剂为聚乙烯亚胺按照1:2混合后,室温孵育15分钟,然后添加到生物反应器中,在温度为30~37℃、pH为6.8~7.8、DO为30~60%,搅拌速度60转/分的条件下进行培养。每1~3×108cells/g细胞转染所需的AAV表达载体质粒、辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8分别为120~200微克,优选分别为170微克。腺相关病毒载体***质粒的稀释液采用无血清的DMEM或PBS。每1~3×108cells/g细胞转染配置的转染复合物的体积为10毫升;所述转染复合物包括腺相关病毒载体***质粒、转染试剂和腺相关病毒载体***质粒的稀释液。
(3)继续培养步骤(2)所述转染后的细胞,并按时收集和更换所述无血清培养基,得到含有血清8型的重组腺相关病毒的培养基。
温度为30~37℃、pH为6.8~7.8、DO为30~60%,搅拌速度60转/分的条件连续培养4-6天,转染后每48h开始,每24h收集一次培养基,同时更换新鲜的培养基;一共收集三次培养基,更换两次培养基,最后一次收集培养基2h之前,向培养基中添加终浓度为50mM的氯化钠,促进AAV病毒释放。本发明可在步骤(3)中分两次或三次收集细胞培养基,同时更改新鲜的无血清培养基,极大改善了细胞生长环境,有效提高病毒的的产率,将多次收集的培养基,合并纯化。
(4)将步骤(3)得到的含有血清8型的重组腺相关病毒的培养基通过切向截留***浓缩所述病毒,得到浓缩后的血清8型的重组腺相关病毒。
合并多次收集的病毒培养基上清,采用切向截流过滤***,进行培养基浓缩,切向截流***不仅限于Pall公司等其他公司的切向截流***,截流孔径100KD,截流膜材质选用PVDF材质。其他操作按照供应商提供的操作方法操作。根据本发明,切向截流后的病毒浓缩液可以进行超速离心或者离子交换进行进一步的纯化,以达到所期望的标准。
(5)将步骤(4)浓缩后的血清8型的重组腺病毒通过离子交换柱得到纯化的血清8型的重组腺相关病毒。
在本发明中,若非特指,所有的份、百分比均为重量单位,所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明,实施例采用的方法为本领域通用技术。
培养基:Life公司生产的293Free style。
以下为实施例:
实施例1
以500ml的篮式生物反应器为例,培养基采用Life公司生产的293Free style无血清培养基,生产制备血清8型重组腺相关病毒。
片状载体使用量约10g左右,由聚酯纤维构成,圆形,直径1cm,图1是本发明采用的片状载体的外观图片;图2是本发明采用的片状载体的高分辨图片显示的其表面形貌和结构,首先用PBS浸泡,接着用PBS冲洗后,再用培养液过夜浸泡,然后用PBS浸泡高压灭菌,使用前除尽PBS。
生物反应器中的片状载体上接种5×107个293T细胞,DO控制在30~60%,pH值维持在7.0-7.2,温度37℃的条件下培养生长5~7天时间,搅拌桨速度60rpm/min期间检测葡萄糖消化,根据糖耗情况进行换液处理,以使糖量维持在日耗糖量为1g/L以上为准,随着细胞密度的提高,日耗糖量逐渐增加直到达到2.5g/L以上。图3是293T细胞在片状载体上培养7天后的图片。图4是293T细胞在无血清片状载体培养条件下的贴壁速度,可以看出本发明的细胞在无血清培养基中也可以很好的贴壁生长。
转染293T细胞,细胞接种篮式反应持续培养5-7天后,细胞量达到109左右,开始转染,转染前更换新鲜的培养基,转染需要用的质粒1:1:1的AAV表达载体质粒、辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8,经过QiaGEN质粒提取试剂盒提取,OD260/280=1.8左右,OD260/230>2.0.质粒使用用量按照1-3E+08cell,使用的质粒总量在510ug,此案例中三种AAV***质粒总量在6mg左右(每种质粒2mg),PEI使用量在12mg,转染体系的总体积在60ml左右,使用无血清的DMEM或PBS作为溶剂。混匀PEI和质粒后,室温孵育15min,然后添加到反应器中,12h后更换培养基。DO控制在30-60%,pH值维持在7.0-7.2,温度37℃的条件下培养,搅拌桨速度60rpm/min。
转染后48h收集一次培养基,并添加新的培养基,继续培养24h后再次收集一次培养基,并更换新的培养基,继续培养24h,在收集上清前的2h向培养基中添加终浓度为500mM的氯化钠,此为最后一次收集培养基,整个病毒生产过程一共收集三次培养基,500ml篮式生物反应器,每次使用的培养基大约在400ml左右,三次收集的培养基一共在1200ml。
病毒纯化,将收集的1200ml培养基,通过Pall公司的切向截流***,浓缩病毒至40ml左右,使用截流膜选取PVDF材质,孔径100KD,其他操作按照使用手册操作,将浓缩的病毒液进行超速离心,或者离子交换皆可。
本发明也比较了相同条件下,不同血清型重组腺相关病毒在不同培养方式中的产率,图5是不同血清型重组腺相关病毒在不同培养方式的产率比较结果图,可以看出,与血清2型、5型和9型重组腺相关病毒相比,血清8型病毒产率在无血清片状载体培养方式下,结合特定的培养条件,其产率最高,其总病毒基因组拷贝数达到了8×1012VG,表明了血清8型重组腺相关病毒更适合无血清片状载体的培养方式。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)在片状载体中使用无血清培养基培养293T细胞;
(2)将腺相关病毒载体***质粒瞬时转染步骤(1)培养的293T细胞,得到转染后的细胞;所述腺相关病毒载体***质粒包括AAV表达载体质粒,辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8;
(3)继续培养步骤(2)所述转染后的细胞,并按时收集和更换所述无血清培养基,得到含有血清8型的重组腺相关病毒的多次收集的培养基。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,还包括如下步骤:
(4)将步骤(3)得到的含有血清8型的重组腺相关病毒的多次收集的培养基的上清合并,通过切向截留***浓缩所述病毒,得到浓缩后的血清8型的重组腺相关病毒;
(5)将步骤(4)浓缩后的血清8型的重组腺病毒通过离子交换柱得到纯化的血清8型的重组腺相关病毒。
3.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述培养293T细胞具体包括如下步骤:在经过灭菌和浸泡处理后的片状载体上接种293T细胞,培养细胞至所述片状载体上的细胞量达1×108~3×108cells/g。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,在所述片状载体上接种293T细胞,其接种量为0.5×107~2×107cells/g。
5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)具体步骤包括:将质量比为1:1:1的AAV表达载体质粒、辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8与转染试剂聚乙烯亚胺按照1:2混合后,室温孵育15分钟,然后添加到生物反应器中,在温度为30~37℃、pH为6.8~7.8、DO为30%~60%,搅拌速度为60转/分的条件下进行培养。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,每1×108~3×108cells/g细胞转染所需的AAV表达载体质粒、辅助质粒pHelper和AAV衣壳质粒pRC8分别为120~200微克,优选分别为170微克。
7.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)腺相关病毒载体***质粒的稀释液采用无血清的DMEM或PBS。
8.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)每1×108~3×108cells/g细胞转染配置的转染复合物的体积为10毫升;所述转染复合物包括腺相关病毒载体***质粒、转染试剂和腺相关病毒载体***质粒的稀释液。
9.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述继续培养所述转染后的细胞的条件为:温度为30~37℃、pH为6.8~7.8、DO为30~60%,连续培养4~6天,每24h收集一次培养基,同时更换新鲜的培养基;一共收集三次培养基,更换两次培养基,最后一次收集培养基2h之前,向培养基中添加氯化钠至氯化钠的终浓度为50mM,促进AAV病毒释放。
10.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述切向截流***截流孔径100KD,截流膜材质选用PVDF材质。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810067455.3A CN108179137B (zh) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810067455.3A CN108179137B (zh) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108179137A true CN108179137A (zh) | 2018-06-19 |
CN108179137B CN108179137B (zh) | 2020-11-06 |
Family
ID=62551306
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810067455.3A Active CN108179137B (zh) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108179137B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108866011A (zh) * | 2018-07-31 | 2018-11-23 | 深圳生生凡非基因技术有限公司 | 一种同步包装rAAV的方法 |
CN108866013A (zh) * | 2018-08-06 | 2018-11-23 | 武汉赛科成科技有限公司 | 一种大规模生产慢病毒的方法 |
CN112280801A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-01-29 | 武汉枢密脑科学技术有限公司 | 一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法及试剂盒 |
CN113308492A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-08-27 | 北京中因科技有限公司 | 一种用于复制性aav的检测方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20080062374A (ko) * | 2006-12-29 | 2008-07-03 | 박기랑 | 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2 벡터의 대량 생산및 정제 방법 |
KR20110098261A (ko) * | 2010-02-26 | 2011-09-01 | 주식회사 에스씨티 | 아데노 연관 바이러스 혈청형 벡터의 대량 생산 및 정제 방법 |
CN102205116A (zh) * | 2010-03-29 | 2011-10-05 | 杭州安普生物工程有限公司 | 一种培养动物细胞生产疫苗的方法 |
CN107142279A (zh) * | 2017-05-12 | 2017-09-08 | 山东维真生物科技有限公司 | 一种aav6型腺相关病毒体外高效感染t细胞的方法 |
-
2018
- 2018-01-24 CN CN201810067455.3A patent/CN108179137B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20080062374A (ko) * | 2006-12-29 | 2008-07-03 | 박기랑 | 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2 벡터의 대량 생산및 정제 방법 |
KR20110098261A (ko) * | 2010-02-26 | 2011-09-01 | 주식회사 에스씨티 | 아데노 연관 바이러스 혈청형 벡터의 대량 생산 및 정제 방법 |
CN102205116A (zh) * | 2010-03-29 | 2011-10-05 | 杭州安普生物工程有限公司 | 一种培养动物细胞生产疫苗的方法 |
CN107142279A (zh) * | 2017-05-12 | 2017-09-08 | 山东维真生物科技有限公司 | 一种aav6型腺相关病毒体外高效感染t细胞的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
曲伟红: "腺相关病毒载体纯化技术的研究进展", 《中国药房》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108866011A (zh) * | 2018-07-31 | 2018-11-23 | 深圳生生凡非基因技术有限公司 | 一种同步包装rAAV的方法 |
CN108866013A (zh) * | 2018-08-06 | 2018-11-23 | 武汉赛科成科技有限公司 | 一种大规模生产慢病毒的方法 |
CN108866013B (zh) * | 2018-08-06 | 2021-03-23 | 武汉赛科成科技有限公司 | 一种大规模生产慢病毒的方法 |
CN112280801A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-01-29 | 武汉枢密脑科学技术有限公司 | 一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法及试剂盒 |
CN113308492A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-08-27 | 北京中因科技有限公司 | 一种用于复制性aav的检测方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108179137B (zh) | 2020-11-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108179137A (zh) | 一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法 | |
US9957485B2 (en) | Systems and methods for virus propagation in cell cultures for vaccine manufacture | |
CN107312746A (zh) | 一种猪圆环病毒2型的大规模全悬浮培养方法 | |
CN107267466B (zh) | 一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法 | |
CN106085946B (zh) | 可以悬浮培养的猪睾丸细胞株st-s及其获得方法与应用 | |
CN105744952A (zh) | 病毒疫苗及其制备方法 | |
CN104480143A (zh) | 一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法 | |
CN106540249A (zh) | 一种禽流感(h5n1)或猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法 | |
CN115725660B (zh) | 一种重组流感亚单位疫苗的制备方法 | |
CN104004720B (zh) | 一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法 | |
CN104873966A (zh) | 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法 | |
CN108866013A (zh) | 一种大规模生产慢病毒的方法 | |
CN107523555A (zh) | 获得病毒的方法 | |
CN104027800A (zh) | 一种人用狂犬病疫苗的制备方法 | |
CN105396129B (zh) | 一种利用脊髓灰质炎减毒株生产的灭活疫苗 | |
US20210268405A1 (en) | Method for producing recombinant adenovirus | |
WO2022262206A1 (zh) | Gmp级逆转录病毒载体的纯化方法与应用 | |
CN106701793A (zh) | 一种猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆在间接elisa检测方法中的应用 | |
CN112679586A (zh) | H5、h7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用 | |
CN110339351A (zh) | 一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法及该疫苗包含的稳定剂 | |
CN111662881B (zh) | 新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液及其生产方法 | |
CN105396128A (zh) | 一种纯化脊髓灰质炎病毒液的方法 | |
CN110128545A (zh) | 一种融合基因、重组表达载体、抗原及其制备方法和应用 | |
CN102154220B (zh) | 超高密度大规模产猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法及设备 | |
CN101633912A (zh) | 适合于大规模生产人用禽流感疫苗的裂解方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Preparation method of a recombinant adeno-associated virus with serum type 8 Effective date of registration: 20230921 Granted publication date: 20201106 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN BRAINVTA SCIENCE AND TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023980058096 |
|
PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |