CN108178785A - 一种具有ace抑制功能的羊乳清蛋白肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽及其应用，所述具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽由以下步骤制备而成：(1)羊乳清蛋白粉加水，在一定温度下处理得到羊乳清蛋白液；(2)超声处理羊乳清蛋白液；(3)加入复合蛋白酶酶解，一定温度下保温，冷却后，过滤分离，收集分离液；(4)分离液通过二步超滤法处理；(5)滤液过柱分离，收集洗脱峰，即得。本发明中的羊乳清蛋白肽具备较好的ACE抑制能力，食源性ACE抑制肽不会产生降压过度的问题，安全性高，无副作用，除降压功能外，往往同时具有免疫促进、易消化吸收等功能。本发明对开发具备ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽的食品、保健品或药物具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体地涉及一种具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽及其应用。
背景技术
血管紧张素转化酶(Angiotensin I converting enzyme，ACE)为肾素～血管紧张素***的关键酶。血管紧张素原在肾素的作用下转化为血管紧张素I，血管紧张素I在ACE的作用下转化为血管紧张素Ⅱ，刺激血管收缩，造成血压上升。抑制ACE的活性对降低血压有着积极的作用，因而开发有效的ACE抑制剂引起人们的极大关注。虽然来源于食物的ACE抑制肽比人工合成的ACE抑制剂作用弱，但是它有其独特的优点，不会产生降压过度的问题，安全性高，无副作用，除降压功能外，往往同时具有免疫促进、易消化吸收等功能。由于药物疗法存在副作用，天然食物中的降血压功能因子的开发利用将成为今后高血压非药物治疗的重要部分。
现有技术中关于ACE抑制肽开发的报道，主要是通过酶解的方法从水产动物体或植物蛋白源获得ACE抑制肽，酶解过程通常都需要通过添加酸或碱来调节体系的pH值，这无疑影响了获得的ACE抑制肽产品的功能特性，且增加了操作的繁琐程度，这些方法均不同程度地增加了操作步骤和生产成本，制约了产业化规模化ACE抑制肽的生产及蛋白肽的得率。
目前，国内外还未见有关利用羊乳清蛋白为原料制备具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽。
本发明针对目前羊乳清蛋白产品开发的现状，利用羊乳清蛋白粉为原料，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白酶复合酶解，通过膜分离和凝胶分离技术，开发了具有特定降血压功能的羊乳清蛋白肽，建立简单高效的羊乳清蛋白肽的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，由以下步骤制备而成：
(1)羊乳清蛋白粉加水，在一定温度下处理得到羊乳清蛋白液；
(2)超声处理羊乳清蛋白液；
(3)加入复合蛋白酶酶解，一定温度下保温，冷却后，过滤分离，收集分离液；
(4)分离液通过二步超滤法处理；
(5)滤液过柱分离，收集洗脱峰，即得。
进一步，步骤(1)中，水与羊乳清蛋白粉的质量比为13～16:1，所述一定温度下处理为40～60℃搅拌50～100分钟。
进一步，步骤(2)中，超声处理方法为将步骤(1)得到的羊乳清蛋白液调至55～65℃，40～60kHz的超声频率处理25～50min。
本发明通过大量实验发现，羊乳清蛋白液温度调至55～65℃进行40～60kHz超声处理，效果最好，能够较好地改变羊乳清蛋白的组织结构，使下面酶解步骤缩短酶解时间和使用较少的酶量，能够获得具有特定功能的优质蛋白肽。
进一步，步骤(3)中，按照步骤(1)羊乳清蛋白粉重量的1.0～1.5％加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶组成，四者质量比为1:1～2:1:1。
进一步，步骤(3)中，于50～65℃酶解0.5～2.0小时；酶解之后于90～100℃下保温10～20min，冷却至65～75℃，通过硅藻土过滤分离，收集分离液。
进一步，步骤(4)中，两步超滤法为先用孔径为5000D的膜超滤，再用孔径为3000D的膜超滤，得到分子量小于3000D的蛋白肽。
具体地，是利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
进一步，步骤(5)中，滤液过柱分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，浓缩、冷冻干燥得到羊乳清蛋白肽。
具体地，取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到羊乳清蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中第12～13分钟洗脱出来的肽液；将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到羊乳清蛋白肽粉。
通过LC-MS/MS对羊乳清蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为IHALPLP(Ile-His-Ala-Leu-Pro-Leu-Pro)、IHDIPLP(Ile-His-Asp-Ile-Pro-leu-Pro)、TPVVVPPF(Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe)的肽含量为86～90％，其中IHALPLP(26～34％)、IHDIPLP(28～35％)、TPVVVPPF(24～29％)。所述％均为质量百分比。
通过实验发现，上述方法制备得到的羊乳清蛋白肽具有优异的ACE抑制功能。进而，本发明提供了该羊乳清蛋白肽在食品、保健品或药物中的应用，尤其是在降血压药物中的应用。
本发明的优点在于：
(1)本发明所述羊乳清蛋白肽制备全过程简单，整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，较易实现产业化生产。
(2)开发的羊乳清蛋白肽具有很好的ACE抑制功能，制得的羊乳清蛋白肽ACE抑制活性(IC50值)低于233μg/mL，开发的羊乳IHALPLP肽ACE抑制活性(IC50值)为136.8μg/mL。
(3)本发明利用特定频率超声波技术处理的羊乳清蛋白液，可以明显改善羊乳清蛋白对酶的敏感性，降低酶的使用量。
(4)开发的产品安全，本发明采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量和肽组成的羊乳清蛋白肽，不加任何添加剂，为100％羊乳清蛋白肽。
(5)本发明开发的蛋白肽，具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品和营养食品。
(6)本发明开发蛋白肽中分子量小于2000的肽的比例为95％以上，具有非常明确的肽的组成。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。以下实施例的％均指质量百分比。羊乳清蛋白粉购自澳优乳业(中国)有限公司，中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶均购自诺维信(中国)投资有限公司，木瓜蛋白酶购自安琪酵母股份有限公司。
实施例1
本实施例之具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，由以下步骤制备而成：
(1)选用羊乳清蛋白粉100克，加入羊乳清蛋白粉总量13倍的水，在40℃条件下，搅拌50分钟；
(2)温度升高到55℃，利用超声波发生器经超声波(频率为40kHz)处理40分钟，得到羊乳清蛋白溶液；
(3)按照步骤(1)羊乳清蛋白粉重量的1.0％加入复合蛋白酶进行酶解(复合蛋白酶组成：碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，它们之间的质量比为1:2:1:1)，在55℃条件下，酶解反应2.0h；在95℃下，保温10分钟，冷却至75℃，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(2)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到羊乳清蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中第12～13分钟洗脱出来的肽液；将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到羊乳清蛋白肽粉。
通过LC-MS/MS对羊乳清蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为IHALPLP(ILE-HIS-ALA-LEU-PRO-LEU-PRO)、IHDIPLP(Ile-His-Asp-Ile-Pro-leu-Pro)、TPVVVPPF(Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe)的肽含量为87％，其中IHALPLP(30％)、IHDIPLP(31％)、TPVVVPPF(26％)。所述％均为质量百分比。
实施例2
本实施例之具有DPP～Ⅳ抑制和ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，由以下步骤制备而成：
(1)选用羊乳清蛋白粉500克，加入羊乳清蛋白粉总量16倍的水，在50℃条件下搅拌80分钟；
(2)温度升高到60℃，利用超声波发生器经超声波(频率为60kHz)处理25分钟，得到羊乳清蛋白溶液；
(3)按照步骤(1)羊乳请蛋白粉重量的1.5％加入复合蛋白酶进行酶解(复合蛋白酶组成：碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，它们之间的质量比为1:1:1:1)，在55℃条件下进行酶解反应0.5h；在95℃下保温15分钟，冷却至75℃，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(2)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到羊乳清蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中第12～13分钟洗脱出来的肽液；将步骤(4)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到羊乳清蛋白肽粉。
通过LC-MS/MS对羊乳清蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为IHALPLP(ILE-HIS-ALA-LEU-PRO-LEU-PRO)、IHDIPLP(Ile-His-Asp-Ile-Pro-leu-Pro)、TPVVVPPF(Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe)的肽含量为89％，其中IHALPLP(31％)、IHDIPLP(31％)、TPVVVPPF(27％)。所述％均为质量百分比。
实施例3
本实施例之具有DPP～Ⅳ抑制和ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，由以下步骤制备而成：
(1)选用羊乳清蛋白粉1000克，加入羊乳清蛋白粉总量15倍的水，在60℃条件下搅拌100分钟；
(2)温度升高到65℃，利用超声波发生器经超声波(频率为50kHz)处理80分钟，得到羊乳清蛋白溶液；
(3)按照步骤(1)羊乳清蛋白粉重量的1.2％加入复合蛋白酶进行酶解(复合蛋白酶组成：碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，它们之间的质量比为1:2:1:1)，在60℃条件下进行酶解反应1.0h；在95℃下保温15分钟，冷却至75℃，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(2)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到羊乳清蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中第12～13分钟洗脱出来的肽液；将步骤(4)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到羊乳清蛋白肽粉。
通过LC-MS/MS对羊乳清蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为IHALPLP(ILE-HIS-ALA-LEU-PRO-LEU-PRO)、IHDIPLP(Ile-His-Asp-Ile-Pro-leu-Pro)、TPVVVPPF(Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe)的肽含量为88％，其中IHALPLP(31％)、IHDIPLP(31％)、TPVVVPPF(26％)。所述％均为质量百分比。
羊乳清蛋白肽血管紧张素转化酶(ACE)抑制能力的测定试验
试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3制备的羊乳清蛋白肽，样品4为实施例1羊乳清蛋白粉。ACE抑制能力按照如下方法进行：
ACE抑制率的方法。用高效液相色谱可以在228nm下定量检测释放出的Hip量，从而计算出多肽的ACE抑制率。
(1)试剂的配置
pH8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/L，NaCl 300mmol/L，调整pH到8.3；
ACE酶液：将2mL的磷酸盐缓冲液加入1U的ACE中，使其浓度变为0.5U/mL。
HHL溶液：使用磷酸缓冲液溶解HHL，使其终浓度为5mmol/L。
样品溶液：称取适量样品，用磷酸盐缓冲液所需浓度的溶液。
(2)ACE抑制率测定的色谱条件
检测波长：228nm；流速：1mL/min；流动相A:超纯水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B:甲醇(含0.1％三氟乙酸)；进样量：10μL，手动进样；
(3)测定ACE抑制活性的方法
取120μL HHL底物溶液，加入20μL的样品混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μL ACE酶液在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μL1mol/L的HCl终止反应，得到反应液。该反应液利用HPLC进行分析，同时设置空白对照组。ACE抑制活性计算公式如下：
ACE抑制活性％＝(M-N)/M×100，
式中，M为对照组中马尿酸的峰面积，N为添加的样品组中马尿酸的峰面积。
(4)马尿酸标准曲线的绘制方法
用双蒸水将马尿酸溶解为1mmol/L、0.5mmol/L、0.25mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.01mmol/L和0.005mmol/L的标准浓度，经0.22ul的滤膜过滤后在HPLC仪器上经行进样分析后，可求得不同浓度马尿酸的面积，然后建立马尿酸峰面积与浓度的线性关系。马尿酸的浓度与峰面积能够反应样品中马尿酸的含量，进而反应ACE抑制剂的抑制活性。
(5)半抑制浓度的测定
按照ACE抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出IC50值。
结果(见表1)本发明羊乳清蛋白肽具有较好的ACE抑制能力，ACE抑制活性(IC50值)低于233μg/mL，显著低于同类复合蛋白肽的IC50值，其中IHALPLP肽ACE抑制活性(IC50值)为136.8μg/mL，具有很好的ACE抑制能力。
表1本发明羊乳清蛋白肽的ACE抑制活性
| 产品蛋白肽 | ACE抑制活性(IC50值)μg/mL |
| 样品1 | 223.6 |
| 样品2 | 228.8 |
| 样品3 | 232.4 |
| 样品4 | 1465 |
| IHALPLP(合成肽) | 136.8 |
| IHDIPLP(合成肽) | 228.9 |
| TPVVVPPF(合成肽) | 308.9 |
Claims (9)
1.一种具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，其特征在于，由以下步骤制备而成：
(1)羊乳清蛋白粉加水，在一定温度下处理得到羊乳清蛋白液；
(2)超声处理羊乳清蛋白液；
(3)加入复合蛋白酶酶解，一定温度下保温，冷却后，过滤分离，收集分离液；
(4)分离液通过二步超滤法处理；
(5)滤液过柱分离，收集洗脱峰，即得。
2.根据权利要求1所述的具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，其特征在于，步骤(1)中，水与羊乳清蛋白粉的质量比为13～16:1，所述一定温度下处理为40～60℃搅拌50～100分钟。
3.根据权利要求1或2所述的具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，其特征在于，步骤(2)中，超声处理方法为将步骤(1)得到的羊乳清蛋白液调至55～65℃，40～60kHz的超声频率处理25～50min。
4.根据权利要求1或2所述的具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，其特征在于，步骤(3)中，按照步骤(1)羊乳清蛋白粉重量的1.0～1.5％加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶组成，四者质量比为1:1～2:1:1。
5.根据权利要求1或2所述的具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，其特征在于，步骤(3)中，于50～65℃酶解0.5～2.0小时；酶解之后于90～100℃下保温10～20min，冷却至65～75℃，通过硅藻土过滤分离，收集分离液。
6.根据权利要求1或2所述的具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，其特征在于，步骤(4)中，两步超滤法为先用孔径为5000D的膜超滤，再用孔径为3000D的膜超滤，得到分子量小于3000D的蛋白肽。
7.根据权利要求1或2所述的具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，其特征在于，步骤(5)中，滤液过柱分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，浓缩、冷冻干燥得到羊乳清蛋白肽。
8.根据权利要求1或2所述的具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽，其特征在于，通过LC-MS/MS对羊乳清蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为IHALPLP、IHDIPLP、TPVVVPPF的肽含量为86～90％，其中IHALPLP 26～34％、IHDIPLP 28～35％、TPVVVPPF 24～29％；所述％均为质量百分比。
9.根据权利要求1-8任一权利要求所述的具有ACE抑制功能的羊乳清蛋白肽在食品、保健品或药物中的应用。
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