CN108164619B - 一种超声辅助转化几丁质为壳聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超声辅助转化几丁质为壳聚糖的方法，该方法包括如下步骤：(1)向灵芝孢子粉中加入去离子水，水浴超声提取后再加入乙醇、在室温下超声处理，离心，再去离子水，浸泡，离心，烘干，得到粗料几丁质；(2)将粗料几丁质置于H2O2水溶液中，水浴维持使粗料几丁质完成脱色，用NaOH溶液调节脱色后的几丁质溶液的pH值至中性，离心得沉淀物；(3)向沉淀物加入碱溶液,使用超声波处理混合液完成去乙酰化反应，再用HCl溶液调节溶液的pH值至中性，然后离心得沉淀物，烘干，得到壳聚糖粗品。该方法以少量、低浓度的NaOH、在室温条件下结合超声工艺制备出壳聚糖，另外，也充分利用了残渣副产物、拓宽了壳聚糖的来源、适于壳聚糖的规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及壳聚糖领域，特别是涉及一种运用超声辅助将灵芝孢子粉提取活性物质后的残渣转化为壳聚糖的方法。
背景技术
几丁质是地球上第二大存量的生物高分子，仅次于纤维素，其大量存在于真菌、浮游生物、昆虫外骨骼和甲壳纲动物外壳中。据《自然》2015年第524卷发表的文章称，全球每年的几丁质生物合成量达1000亿吨，但由于几丁质在一般的溶液中很难溶解，所以往往将其经过去乙酰化转化为壳聚糖。壳聚糖是几丁质的一种衍生物，可由几丁质经去乙酰化处理后获得。由于其具有良好的生物相容性、可降解性及无毒等特点而被广泛应用于药物载体、组织工程、食品、化妆品等众多领域。
但目前商品化的壳聚糖几乎都是从虾、蟹壳等海产品的下脚料中获得，不同程度的存在金属残留、致过敏污染物等问题。同时，据相关报道称目前工业上生产壳聚糖的一般都是以虾壳为原料、用浓度为40％的氢氧化钠溶液处理，使之完成去乙酰化转化为壳聚糖，每生产1千克壳聚糖需要消耗1吨水。因此，需要探寻新的壳聚糖制备方法及原料来源，一方面能杜绝目前工业生产壳聚糖造成的资源浪费、环境污染等问题；另一方面能开拓壳聚糖的新来源，满足市场对壳聚糖与日俱增的需求。已有研究显示，真菌类细胞的细胞壁所含几丁质的比例为1％-40％。不过，几丁质难以消化的特性使得直接口服灵芝孢子粉的效果欠佳，且容易引起腹泻等不良反应。
目前，壳聚糖的规模化生产都是利用海鲜副产品在高浓度强碱、高温下完成几丁质的去乙酰化而实现的，存在耗时、废液污染环境等弊端。虽已有相关报道称可将灵芝子实体提取多糖后的残渣转化为壳聚糖，但提取时必须经过切片与破碎后在高浓度强碱、高温下处理进行反应，存在制备步骤繁多、效率低下等弊端。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种超声辅助几丁质转化为壳聚糖的方法，该方法高效、环保、低成本、充分利用副产物，适于规模化生产。
本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：一种超声辅助几丁质转化为壳聚糖的方法，本发明中所使用的各名词定义如下：
几丁质：指灵芝孢子粉经提取多糖、三萜和蛋白后剩余的残渣；
壳聚糖：指几丁质经超声辅助去乙酰化后的产物。
该方法包括如下步骤：
(1)取干燥的灵芝孢子粉按料液比1：15-30(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在45-65℃下水浴超声提取1-6次后再离心去除上清液得一次沉淀物；按料液比1:15-30(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温下超声处理1-3h，再离心得二次沉淀物；按料液比1：30-50(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，25-45℃下浸泡1-3h，离心，得到三次沉淀物，烘干，得到粗料几丁质；
(2)将粗料几丁质置于30wt％H2O2水溶液中，以料液比1:10-20(g:ml)混合，再置于50-70℃下水浴维持1-3h，使粗料几丁质完成脱色，用1wt％NaOH溶液调节脱色后的几丁质溶液的pH值至中性，然后离心得沉淀物；
(3)向步骤(2)离心得的沉淀物按料液比为1：5-25(g：ml)加入碱溶液,使用超声波处理混合液完成去乙酰化反应，再用1mol/L HCl溶液调节溶液的pH值至中性，然后离心得沉淀物，烘干，得到壳聚糖粗品。
进一步的，所述灵芝孢子粉的粒径范围为100纳米至30微米。
进一步的，所述室温的温度范围为25℃±1℃。
进一步的，所述步骤(1)中超声提取的功率为100-200W、频率为40kHz。
进一步的，所述步骤(1)和步骤(3)中烘干所使用的温度范围是55-65℃。
进一步的，所述碱溶液为NaOH溶液或KOH溶液，其浓度为5wt％-40wt％。
进一步的，离心处理参数是7000-10000rpm，5-10min。
进一步的，所述步骤(3)中所使用的超声处理条件分别为：超声频率20kHz，功率20-120W。
进一步的，所述步骤(3)中在超声处理为持续超声处理，处理总时间为5-75min。
进一步的，所述步骤(3)中在超声处理为间歇超声处理，处理总时间为60min，超声次数为2-5次，每两次超声处理间隔时长5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1)、利用提取多糖后灵芝孢子粉残渣为原料，省去了切片、破碎等前处理步骤，实现了副产物的再利用；
2)、借助超声波的空穴效应，可在常温条件下完成壳聚糖的制备，降低了去乙酰化过程中强碱的浓度和使用量，缩短了反应时间、提高了转化速率、降低了生产成本、保护了环境；
3)、以灵芝孢子粉为起始原料，开拓了壳聚糖的来源，既避免了部分消费者口服灵芝孢子粉引起的腹泻等不良反应，又可将副产物转化为有用物质，同时还拓宽了壳聚糖的来源。
附图说明
图1是本发明实施例1制备所得壳聚糖与市售壳聚糖的红外光谱图；
图2是实施实例1结果红外光谱图；
图3是实施实例2结果红外光谱图；
图4是实施实例3结果红外光谱图；
图5是实施实例4结果红外光谱图；
图6是实施实例5结果红外光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
实施例1：
(1)取干燥的灵芝孢子粉1g，按料液比1：15(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在45℃下水浴超声(100W)提取1次灵芝多糖后以7000rpm离心10min去除上清液得一次沉淀物；按料液比1：15(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温(25℃±1℃)下超声处理1h去除三萜类化合物，再以相同离心条件离心得二次沉淀物；按料液比1：30(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，25℃下浸泡3h以去除水溶性蛋白，以相同离心条件离心后将所得三次沉淀物，55℃烘干，得到粗料几丁质；
(2)取粗料几丁质1g，加30％H2O2 10ml，与70℃下水浴锅中恒温1h。加1wt％的NaOH溶液调节pH至中性，7000rpm离心10min，收集沉淀物。
(3)按料液比1:5(g：mL)向沉淀物加入20wt％NaOH溶液，分别在功率20、40、80、120、160w下超声15min，超声结束后，用1mol/L的HCl溶液调节混合溶液的pH值至中性，静置过夜，7000rpm离心10min，收集沉淀物，60℃下干燥至恒重，得壳聚糖粗品。
(4)通过FT-IR测定制备得到的壳聚糖的红外图谱，计算制备所得壳聚糖的去乙酰度。
对比市售壳聚糖与制备得到(功率160w下所得)壳聚糖的红外图谱，可确定该方法制备所得产物为壳聚糖，见图1；根据红外图谱(见图2)，计算产物的去乙酰度，因为去乙酰度的大小直接影响了壳聚糖的粘度、溶解性、分子量等理化指标制备所得壳聚糖的去乙酰度的计算公式如下：
A1320/A1420＝0.3822+0.03133DA (1)
DD(％)＝1-DA (2)
式中，A1320、A1420分别是波数1320cm-1、1420cm-1处的吸光值，DA、DD分别是乙酰化程度、去乙酰化程度。
结果显示，此次制备所得壳聚糖的去乙酰度分别是75.5％、79.9％、81.4％、82.1％、83.1％。结果说明，壳聚糖去乙酰度随着超声功率的增加而增加，功率越高的超声波可产生更强的空穴效应，有助于N-乙酰葡糖胺结构单元转化为葡萄糖胺结构单元。同时，去乙酰度随功率的增加而增加的幅度逐渐减小，说明超声功率对去乙酰化过程的辅助作用有一定限度。
实施例2：
(1)取干燥的灵芝孢子粉1g，按料液比1：25(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在55℃下水浴超声(150W)提取3次灵芝多糖后以10000rpm离心5min去除上清液得一次沉淀物；按料液比1：25(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温(25℃±1℃)下超声处理2h去除三萜类化合物，再以相同离心条件离心得二次沉淀物；按料液比1：40(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，35℃下浸泡2h以去除水溶性蛋白，以相同离心后将所得三次沉淀物，60℃烘干，得到粗料几丁质；
(2)取粗料几丁质1g，加30％H2O2 20ml，与60℃下水浴锅中恒温2h。加1wt％的NaOH溶液调节pH至中性，10000rpm离心5min，收集沉淀物。
(3)分别按料液比1:5、1：10、1：15、1：20、1：25(g：mL)向沉淀物加入20wt％NaOH溶液，在功率140w下超声15min，超声结束后，用1mol/L的HCl溶液调节混合溶液的pH值至中性，静置过夜，7000rpm离心10min，收集沉淀物，60℃下干燥至恒重，得壳聚糖粗品。
(4)通过FT-IR测定制备得到的壳聚糖的红外图谱，计算制备所得壳聚糖的去乙酰度。
根据红外图谱(见图3)，计算出产物的去乙酰度。结果显示，此次制备所得壳聚糖的去乙酰度分别是81.0％、81.2％、81.3％、82.2％、82.5％。结果说明，同一浓度下的NaOH溶液在不同料液比条件下对壳聚糖去乙酰化过程有影响，增加料液比可促进去乙酰化过程的进行，虽然促进幅度不是特别明显。说明去乙酰化过程的实现更加倚重碱溶液的浓度和超声功率或频率等因素。
实施例3：
(1)取干燥的灵芝孢子粉1g，按料液比1：30(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在65℃下水浴超声(200W)提取1次灵芝多糖后以8000rpm离心10min去除上清液得一次沉淀物；按料液比1：30(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温(25℃±1℃)下超声处理3h去除三萜类化合物，再以相同条件离心得二次沉淀物；按料液比1：50(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，45℃下浸泡1h以去除水溶性蛋白，以相同离心后将所得三次沉淀物，60℃烘干，得到粗料几丁质；
(2)取粗料几丁质1g，加30ml浓度为30％的H2O2，与50℃下水浴锅中恒温3h。加1wt％的NaOH溶液调节pH至中性，7000rpm离心10min，收集沉淀物。
(3)按料液比1:20(g：mL)向沉淀物分别加入5、10、20、30、40wt％NaOH溶液，在功率140w下超声15min，超声结束后，用1mol/L的HCl溶液调节混合溶液的pH值至中性，静置过夜，7000rpm离心10min，收集沉淀物，60℃下干燥至恒重，得壳聚糖。
(4)通过FT-IR测定制备得到的壳聚糖的红外图谱，计算制备所得壳聚糖的去乙酰度。
根据红外图谱(见图4)，计算出产物的去乙酰度。结果显示，此次制备所得壳聚糖的去乙酰度分别是67.2％、77.6％、81.4％、82.7％、83.2％。结果说明，不同浓度的NaOH溶液对去乙酰化过程有明显影响，浓度增加可促进去乙酰化进程有助于几丁质转化为壳聚糖。但过高的碱溶液，则需要更多的酸溶液才能调节pH至中性，对环境及操作人员的负担相应增加，所以需要根据实际情况综合考虑选择碱溶液的浓度。
实施例4：
(1)取干燥的灵芝孢子粉1g，按料液比1：15(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在45℃下水浴超声(200W)提取5次灵芝多糖后以7000rpm离心10min去除上清液得一次沉淀物；按料液比1：15(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温(25℃±1℃)下超声处理1h去除三萜类化合物，再以相同条件离心得二次沉淀物；按料液比1：30(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，25℃下浸泡3h以去除水溶性蛋白，以相同离心后将所得三次沉淀物，55℃烘干，得到粗料几丁质；
(2)取粗料几丁质1g，加30％H2O2 10ml，与70℃下水浴锅中恒温1h。加1wt％的NaOH溶液调节pH至中性，7000rpm离心10min，收集沉淀物。
(3)按料液比1:15(g：mL)向沉淀物加入20wt％NaOH溶液，在功率180w下分别超声5、15、30、45、60、75min，超声结束后，用1mol/L的HCl溶液调节混合溶液的pH值至中性，静置过夜，7000rpm离心10min，收集沉淀物，60℃下干燥至恒重，得壳聚糖。
(4)通过FT-IR测定制备得到的壳聚糖的红外图谱，计算制备所得壳聚糖的去乙酰度。
根据红外图谱(见图5)，计算产物的去乙酰度。结果显示，此次制备所得壳聚糖的去乙酰度分别是59.2％、70.6％、81.4％、82.5％、81.8％、82.9％。结果说明，超声时间对去乙酰化过程有显著影响，超声时间延长可促进去乙酰化进程有助于几丁质转化为壳聚糖，但也有相关文献表明过度超声也会导致分子链的解聚。
实施例5：
(1)取干燥的灵芝孢子粉1g，按料液比1：15(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在45℃下水浴超声(200W)提取1次灵芝多糖后以7000rpm离心10min去除上清液得一次沉淀物；按料液比1：15(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温(25℃±1℃)下超声处理1h去除三萜类化合物，再以相同条件离心得二次沉淀物；按料液比1：30(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，25℃下浸泡3h以去除水溶性蛋白，以相同离心后将所得三次沉淀物，55℃烘干，得到粗料几丁质；
(2)取粗料几丁质1g，加30％H2O2 10ml，与70℃下水浴锅中恒温1h。加1wt％的NaOH溶液调节pH至中性，7000rpm离心10min，收集沉淀物。
(3)按料液比1:10(g：mL)向沉淀物加入20wt％NaOH溶液，在功率120w，分别在间歇次数0、1、2、3、4次下超声60min(具体为：持续超声处理60min，间歇0次；每次超声处理30min，暂停间歇5min，间歇1次；每次超声处理20min，暂停间歇5min，间歇2次；每次超声处理15min，暂停间歇5min，间歇3次；每次超声处理12min，暂停间歇5min，间歇4次)，超声结束后，用1mol/L的HCl溶液调节混合溶液的pH值至中性，静置过夜，7000rpm离心10min，收集沉淀物，60℃下干燥至恒重，得壳聚糖。
(4)通过FT-IR测定制备得到的壳聚糖的红外图谱，计算制备所得壳聚糖的去乙酰度。根据红外图谱(见图6)，计算产物的去乙酰度。结果显示，此次制备所得壳聚糖的去乙酰度分别是是81.8％、82.9％、82.6％、82.2％、80.9％。结果说明，间歇次数对去乙酰化过程有一定影响，持续超声和间歇次数过多(≥2次)对去乙酰化进程的促进作用不如间歇1次明显。持续超声可能会导致超声波发生装置温度过高，进而影响超声波的输出；间歇次数过多则单次超声持续时间缩短又影响去乙酰化进程。
Claims (4)
1.一种超声辅助几丁质转化为壳聚糖的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）取干燥的灵芝孢子粉按料液比1：15-30（g:ml）向灵芝孢子粉中加入去离子水，在45-65℃下水浴超声提取1-6次后再离心去除上清液得一次沉淀物；按料液比1:15-30（g:ml）向一次沉淀物加入95 v/v%的乙醇、在室温下超声处理1-3h，再离心得二次沉淀物；按料液比1：30-50（g:ml）向二次沉淀物加入去离子水，25-45℃下浸泡1-3h，离心，得到三次沉淀物，烘干，得到粗料几丁质；
（2）将粗料几丁质置于30 wt% H2O2水溶液中，以料液比1:10-20（g:ml）混合，再置于50-70℃下水浴维持1-3h，使粗料几丁质完成脱色，用1wt% NaOH溶液调节脱色后的几丁质溶液的pH值至中性，然后离心得沉淀物；
（3）向步骤（2）离心得的沉淀物按料液比为1：5-25 （g：ml）加入碱溶液,使用超声波处理混合液完成去乙酰化反应，再用1 mol/L HCl溶液调节溶液的pH值至中性，然后离心得沉淀物，烘干，得到壳聚糖粗品；
所述灵芝孢子粉的粒径范围为100纳米至30微米；
步骤（1）中超声提取的功率为100-200W、频率为40kHz；
步骤（1）和步骤（3）中烘干所使用的温度范围是55-65℃；
所述碱溶液为NaOH溶液或KOH溶液，其浓度为5 wt%-40 wt%；
离心处理参数是7000-10000rpm，5-10min；
步骤（3）中所使用的超声处理条件分别为：超声频率20kHz，功率20-200W。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述室温的温度范围为25℃±1℃。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中在超声处理为持续超声处理，处理总时间为5-75min。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中在超声处理为间歇超声处理，处理总时间为60min，超声次数为2-5次，每两次超声处理间隔时长5min。
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