CN108164494A - 一种检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针及其制备方法与应用，其结构式为：将该双光子荧光探针命名为TPNIR‑FP，该双光子荧光探针以尼罗红衍生物为荧光团，以α‑酮酰胺官能团作为ONOO‑反应基团，与ONOO‑能快速响应(<10s)，且灵敏度高、选择性好。能应用于蒽环类抗生素诱导的心肌细胞和心肌组织损伤中ONOO‑的成像研究中。
Description
技术领域
本发明属于合成与检测技术领域，具体涉及一种检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
在生物体内，过氧亚硝酸根(ONOO-)由超氧自由基阴离子和一氧化氮反应生成，能同时代表氧化应激和硝化应激的水平。作为反应活性最高的内源性毒素之一，ONOO-能够通过氧化或硝化生物分子，调控细胞信号通路，诱导细胞凋亡或坏死，进而导致组织器官功能障碍。研究表明，ONOO-与多种疾病的发病和进展密切相关，包括神经退行性疾病、糖尿病、癌症等。此外，在蒽环药物诱导心脏毒性的病理进程中，ONOO-发挥着非常关键的作用。然而，ONOO-在生理条件下的半衰期短且稳态浓度极低，使得检测活细胞及活体组织中的ONOO-变得十分困难。
由于其高分辨和无损伤特性，基于探针的荧光分析法能够在细胞和动物模型中实时可视化分子事件，为上述问题的解决提供了有效的分析方法。新型荧光成像传感器的发展极大地促进了细胞生物学以及医学诊断成像等的进步。而近红外发射的双光子荧光探针由于组织穿透深、背景荧光干扰小，在活体组织成像中更为适用。但是目前双光子性质良好且具有近红外荧光发射，对ONOO-灵敏的荧光探针较少。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针及其制备方法和应用。将该双光子荧光探针命名为TPNIR-FP，该双光子荧光探针以尼罗红衍生物为荧光团，以α-酮酰胺官能团作为ONOO-反应基团，与ONOO-能快速响应(<10s)，且灵敏度高、选择性好。能应用于蒽环类抗生素诱导的心肌细胞和心肌组织损伤中ONOO-的成像研究中。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
一种检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针，其结构式为：
上述双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
反应方程式为：
1)将化合物TPNIR-NH2溶于惰性溶剂中，并向其中加入三乙胺，搅拌均匀后，得混合液；
2)将化合物1的二氯甲烷溶液逐滴滴加到步骤1)的混合液中，反应设定时间后，即得。
惰性溶剂为不与酰氯反应的溶剂。
优选的，步骤1)中，所述惰性溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃或二氧六环，进一步优选为无水二氯甲烷。
优选的，化合物TPNIR-NH2、化合物1和三乙胺的物质的量之比为1:2-10:2-5。
优选的，步骤2)中，反应的温度为0-35℃，反应的时间为1-3h。
进一步优选的，步骤2)中，反应的温度为25-30℃，反应的时间为1.5h。
优选的，步骤2)中还包括将反应产物溶液进行旋干、提纯的步骤。
进一步优选的，步骤2)中，采用硅胶柱层析对反应产物进行提纯。
更进一步优选的，所述硅胶柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合液，二氯甲烷和甲醇的体积比为150-250:1；优选为200:1。
上述双光子荧光探针在活细胞和组织成像中的应用；尤其在蒽环类抗生素诱导的心肌细胞和心肌组织损伤中ONOO-的成像中的应用。
上述双光子荧光探针在心肌细胞中的成像方法，包括如下步骤：将培养好的心肌细胞用刺激剂刺激后再用TPNIR-FP的二甲亚砜溶液孵育，孵育设定时间后，除掉TPNIR-FP的二甲亚砜溶液，并用PBS清洗，然后进行激光共聚焦成像。
优选的，所述刺激剂为阿霉素和表阿霉素。
优选的，孵育的时间为20-40min。
上述双光子荧光探针在小鼠心肌组织中的成像方法，包括如下步骤：
在小鼠腹腔注射设定浓度的药物，然后在小鼠的尾静脉注射探针溶液，一定时间后，将小鼠麻醉后摘除心脏，取左心室组织切片用于双光子荧光成像。
本发明的有益效果是：
1)探针分子最大荧光发射波长位于近红外区域(～630nm)，具有适中的斯托克斯位移(～50nm)，有效地降低了自吸收，提高了成像准确度和组织穿透深度。
2)探针对ONOO-能快速响应(10s内反应完毕)。
3)探针对ONOO-具有高灵敏度和选择性。
4)探针在活细胞内染色效果良好，染色时间较短(30min)，染色效率较高。
5)探针能准确靶向线粒体，指示心肌细胞在蒽环抗生素刺激下ONOO-浓度的升高。
6)探针能在药物诱导损伤的心肌组织中实现ONOO-的浓度差异成像。
7)探针合成步骤相对简单、产率较高、容易纯化。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1是本发明新型荧光探针对不同浓度的ONOO-的荧光响应光谱图；横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。
图2是本发明新型荧光探针在630nm处的荧光强度与不同浓度的ONOO-的线性关系；横坐标为ONOO-浓度(μM)，纵坐标为探针630nm处的荧光发射强度。
图3是本发明新型荧光探针在630nm处的荧光强度随时间的实时变化图；横坐标为不同时间(s)，纵坐标为探针630nm处的荧光发射强度。
图4是在不同种类物质存在时，本发明新型荧光探针630nm处的荧光强度情况。横坐标为不同种类物质，纵坐标为探针630nm处的荧光发射强度。
图5是本发明新型荧光探针与商品化线粒体染料在人肝癌细胞(HepG2)中的荧光染色图。
图6是本发明新型荧光探针在心肌细胞(H9c2)中的荧光成像图。
图7是本发明新型荧光探针在心肌组织中的荧光成像图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明利用之前已有存在的原料中间体TPNIR-NH2和化合物1，由一步反应简易、高效合成，最后经过硅胶色谱柱分离得到探针TPNIR-FP。化合物TPNIR-NH2和1参照文献Shang,H.；Chen,H.；Tang,Y.；Ma,Y.；Lin,W.Biosens.Bioelectron.2017,95,81-86和Xie,X.；Yang,X.；Wu,T.；Li,Y.；Li,M.；Tan,Q.；Wang,X.；Tang,B.Anal.Chem.2016,88,8019-8025合成。
实施例：荧光探针的合成
在氩气保护下，将化合物TPNIR-NH2(160mg，0.5mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，并加入三乙胺(58μL，2.0mmol)，室温搅拌5.0min。随后，将化合物1(1.06g，5.0mmol)溶于5.0mL二氯甲烷，逐滴加入上述混合液中，继续室温搅拌1.5h。反应完毕后，浓缩旋干溶剂，将固体进行柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷：甲醇200:1，V/V)得到紫黑色固体174mg(产率70％)。
核磁及质谱表征：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.42(s,1H),8.69(s,1H),8.40(d,J＝8.9Hz,2H),8.34(d,J＝8.9Hz,2H),8.25(d,J＝9.4Hz,1H),7.95(s,2H),7.93(s,1H),7.47(dd,J＝9.4,2.2Hz,1H),7.30(d,J＝1.9Hz,1H),3.70(q,J＝7.0Hz,4H),3.08(br s,4H),1.26(t,J＝7.0Hz,6H).
13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ186.62,161.81,161.69,158.23,155.47,150.52,148.46,143.31,142.96,137.45,131.96,131.79,131.02,126.98,123.82,122.31,120.97,119.58,119.18,118.69,118.26,95.65,45.53,26.54,24.45.
HRMS(ESI):calculated for C29H26N3O5 +(M+)496.1867,found 496.1865.
效果实验：
探针对ONOO-的荧光响应实验：
TPNIR-FP(储备液1.0mM,200μM)，加入PBS(pH 7.4)缓冲后用水稀释，并加入不同浓度的ONOO-，使探针最终浓度为2.0μM，PBS浓度为50mM，ONOO-浓度为0-10μM。如图1所示，当用570nm激发时，探针在630nm左右基本无荧光发射，与不同浓度的ONOO-(自下往上依次对应的ONOO-的浓度为0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM)孵育后，荧光显著增强，且630nm荧光强度与ONOO-浓度呈现良好的线性相关(图2)。根据公式3σ/k计算出检测限为34nM，使得TPNIR-FP具有检测生物***中内源性痕量ONOO-的能力。
随后，研究了探针TPNIR-FP对ONOO-的动力学响应。如图3所示，探针(2.0μM)本身630nm处荧光较弱，当加入10μM ONOO-之后，荧光迅速增强，在10s内到达顶点，表明探针能够快速响应ONOO-，能够捕获生理环境中反应活性高、半衰期短的ONOO-。
接着，研究了探针的选择性。图4中，标号1代表10μM ONOO-，2代表空白对照，3代表100μM H2O2，4代表100μM t-BuOOH，5代表100μM NO，6代表100μM 1O2，7代表100μM O2 ·-，8代表100μM ClO-，9代表100μM·OH，10代表5mM GSH，11代表100μM Cys，12代表100μM Hcy，13代表100μM H2S，14代表100μM NO3 -，15代表100μM NO2 -，16代表100μM SO4 2-，17代表100μMSO3 2-，18代表100μM CO3 2-，19代表100μM PO4 3-，20代表100μM Na+，21代表100μM K+，22代表100μM Ca2+，23代表100μM Zn2+，24代表100μM Cu2+，25代表100μM Fe2+，26代表100μM Fe3+，27代表100μM维生素C。由图4可知，其它潜在干扰物质均不能引起探针的荧光变化，包括活性氧/活性氮(H2O2,t-BuOOH,NO,1O2,O2 ·-,ClO-,and·OH)、活性硫(GSH,Cys,Hcy,and H2S)、阴离子(NO3 -,NO2 -,SO4 2-,SO3 2-,CO3 2-,and PO4 3-)、阳离子(Na+,K+,Ca2+,Zn2+,Cu2+,Fe2+,andFe3+)和维生素C。相比之下，TPNIR-FP只在ONOO-(对应标号1)存在下表现出明显的荧光增强。综上所述，探针TPNIR-FP对ONOO-具有高度的特异性，可用于生理环境中ONOO-的荧光可视化研究。
探针对活细胞和心肌组织染色成像实验：
由于结构中含有亲脂性阳离子，使得探针倾向聚集于线粒体。因此，采用共定位实验考察了TPNIR-FP的亚细胞区域分布情况，如图5所示，图a是采用商品化线粒体染料Mito-Tracker Green的染色荧光图，图b是采用TPNIR-FP的染色荧光图，图c是图a与图b的叠加图，图d是叠加图的散点关联图。HepG2细胞先用ONOO-产生剂SIN-1刺激30min，然后用线粒体商品化染料Mito-Tracker Green和探针TPNIR-FP共同孵育30min，然后进行共聚焦荧光成像。结果表明Mito-Tracker Green的绿色荧光与TPNIR-FP的红色荧光能很好地重合，共定位系数高达0.94，说明TPNIR-FP能靶向线粒体，并检测ONOO-。由于线粒体是ONOO-起源和发挥作用的主要细胞器，因此，探针TPNIR-FP是成像细胞内ONOO-优越的分子工具。
接着利用TPNIR-FP监测了H9c2心肌细胞在药物诱导损伤时ONOO-浓度的变化。阿霉素(Dox)和表阿霉素(Epi)做为代表性蒽环抗生素用于诱导心肌细胞毒性。H9c2心肌细胞进行不同方法处理，然后再用探针TPNIR-FP染色30min，进行共聚焦荧光成像。如图6所示，a为细胞采用PBS处理的空白对照组，b中细胞采用10μM Dox处理，c中细胞采用20μM Dox处理，d中细胞首先用100μM尿酸处理，再用20μM Dox处理，e为图a到d的平均荧光强度输出图，f为细胞采用PBS处理的空白对照组，g中细胞采用10μM Epi处理，h中细胞采用20μM Epi处理，i中细胞首先用100μM尿酸处理，再用20μM Epi处理，j为f到i的平均荧光强度输出图，与空白对照组相比，Dox和Epi处理组的细胞发出明显更亮的红色荧光，且随着药物剂量增大，探针荧光更强，该荧光增强能被ONOO-清除剂尿酸所抑制。上述结果表明Dox或Epi处理的心肌细胞经历了ONOO-爆发，且上调的ONOO-浓度与药物剂量正相关，探针TPNIR-FP能很好地可视化这一过程。
之后，利用探针TPNIR-FP，实现了在药物诱导小鼠心脏损伤模型中荧光可视化ONOO-水平变化。昆明小鼠被随机分成空白对照组(PBS)、低剂量组(25mg/kg)、高剂量组(50mg/kg)和清除组(100mg/kg Uric acid 50mg/kg)。小鼠腹腔注射相应浓度的药物(0,25,50,and 50mg/kg的Dox或者Epi)，之后尾静脉注射探针TPNIR-FP(50μM,100μL)。对于清除组的小鼠，在给药和探针负载之前，预先腹腔注射尿酸(100mg/kg)。所有小鼠经麻醉后摘除心脏，取左心室组织切片用于双光子荧光成像。如图7所示，与空白对照组相比，药物处理组小鼠的心脏组织发出与药物剂量正相关的红色荧光，且该荧光能够被尿酸所抑制。上述心脏组织中的荧光变化结果与在H9c2心肌细胞中观察到的现象高度一致，进一步证实Dox和Epi诱导心脏损伤过程中内源性ONOO-的上调，探针TPNIR-FP作为良好成像工具能可视化这一结果。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针，其特征在于：其结构式为：
2.权利要求1所述双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
反应方程式为：
1)将化合物TPNIR-NH2溶于惰性溶剂中，并向其中加入三乙胺，搅拌均匀后，得混合液；
2)将化合物1的二氯甲烷溶液逐滴滴加到步骤1)的混合液中，反应设定时间后，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述惰性溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃或二氧六环，进一步优选为无水二氯甲烷。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：化合物TPNIR-NH2、化合物1和三乙胺的物质的量之比为1:2-10:2-5。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中还包括将反应产物溶液进行旋干、提纯的步骤；
优选的，步骤2)中，采用硅胶柱层析对反应产物进行提纯；
优选的，所述硅胶柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合液，二氯甲烷和甲醇的体积比为150-250:1；优选为200:1。
6.权利要求1所述双光子荧光探针在活细胞和组织成像中的应用；尤其在蒽环类抗生素诱导的心肌细胞和心肌组织损伤中ONOO-的成像中的应用。
7.权利要求1所述的双光子荧光探针在心肌细胞中的成像方法，其特征在于：包括如下步骤：将培养好的心肌细胞用刺激剂刺激后再用TPNIR-FP的二甲亚砜溶液孵育，孵育设定时间后，除掉TPNIR-FP的二甲亚砜溶液，并用PBS清洗，然后进行激光共聚焦成像。
8.根据权利要求7所述的成像方法，其特征在于：所述刺激剂为阿霉素和表阿霉素。
9.根据权利要求7所述的成像方法，其特征在于：孵育的时间为20-40min。
10.权利要求1所述的双光子荧光探针在小鼠心肌组织中的成像方法，其特征在于：包括如下步骤：
在小鼠腹腔注射设定浓度的药物，然后在小鼠的尾静脉注射探针溶液，一定时间后，将小鼠麻醉后摘除心脏，取左心室组织切片用于双光子荧光成像。
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