CN108157673B - 一种发酵对虾配合饲料的制备方法 - Google Patents
一种发酵对虾配合饲料的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种发酵对虾配合饲料的制备方法。本发明采用固体和液体混合发酵的工艺，优选出产酶丰富且能共同生长黑曲霉及枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，进行联合发酵，并通过好氧和厌氧两步发酵，充分发挥黑曲霉及枯草芽孢杆菌产酶丰富的优点，使基础发酵原料得到全面的分解，大分子蛋白质分解为肽和氨基酸，纤维素降解为可发酵的糖类、淀粉分解为可发酵的葡萄糖、木聚糖分解为木糖、葡聚糖等，从而使厌氧阶段的罗伊氏乳杆菌的生长繁殖获得大量营养物质的支持。从生物肽含量、L‑乳酸含量、菌落数等指标上可反映出本发明提出的制备方法中好氧阶段及厌氧阶段微生物的生长代谢非常旺盛。
Description
技术领域：
本发明属于水产饲料和生物工程技术领域，具体涉及一种发酵对虾配合饲料的制备方法。
背景技术：
我国对虾养殖业已经形成完整的产业体系，随着养殖密度和规模不断扩大，各种疾病频繁发生，由弧菌属引起的细菌性疾病，传播快、传染率高，给对虾养殖业造成了巨大的经济损失，目前已严重制约了我国乃至全世界对虾养殖的发展。养殖者通常大量使用抗生素药物，虽然短期内取得了成效，但随之导致病原微生物耐药性增强、微生物群落多样性下降、药物残留、养殖环境恶化等问题。本发明制备方法以黑曲霉、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等几种功能菌株，通过先厌氧后好养发酵对虾配合饲料，饲料原料预先膨化或破碎等处理，通过微生物发酵，可降解部分多糖、蛋白质、脂肪等大分子物质，生成有机酸和可溶性多肽等小分子物质，积累有益的代谢产物，消除抗营养因子，提高对虾对饲料的消化率，促进系列功能菌株在对虾肠道和养殖水体的增殖，稳定对虾肠道及水体微生物有益优势微生物种群结构，构建对虾高效健康养殖长期稳定有效的养殖模式。
发明内容：
本发明的目的是提供一种发酵对虾配合饲料的制备方法，与普通对虾配合饲料或常规发酵的对虾配合饲料相比，使用本发明提出的制备方法得到的的发酵对虾配合饲料，一方面在生物肽含量、蛋白质、L-乳酸含量及益生菌菌落数等指标上有非常明显的改善，这些改进可以极大的促进对虾对饲料消化吸收和利用，改善对虾肠道健康，提高对虾免疫力，提高存活率，减少对虾养殖中抗生素使用，减少环境污染；另一方面饲喂发酵对虾配合饲料，可促进系列功能菌株在对虾肠道和养殖水体的增殖，稳定对虾肠道及水体微生物有益优势微生物种群结构，构建对虾高效健康养殖长期稳定有效的养殖模式；最后发酵黑曲霉可一菌产多酶，酶解发酵原料豆粕抗营养因子，降解为可消化的营养物质，且发酵原料预处理，发酵后免制粒直接投喂，生产工艺简单。
本发明的发酵对虾配合饲料是通过以下方法制备的：
(1)固体发酵培养基原料：按总质量分数100％计，包括玉米渣10％～30％，豆粕30％～55％，鱼粉10％～30％，对虾复合预混合饲料0.5％～1.5％，余量为麸皮，将上述原料成分混合均匀得到混合物，加水至该混合物的重量含水量为25％～35％，得到固体发酵培养基；
(2)将黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌菌液和地衣芽孢杆菌菌液接种到固体发酵培养基中混合均匀后进行好氧发酵，得到好氧发酵后的固体发酵培养基；
(3)加入无菌水使好氧发酵后的固体发酵培养基的水分重量含量保持在25％～35％，将罗伊氏乳杆菌菌液、植物乳杆菌菌液和酿酒酵母菌液接种到好氧发酵后的固体发酵培养基中混合均匀后进行厌氧发酵，发酵结束后，即得发酵对虾配合饲料。
所述的将黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌菌液和地衣芽孢杆菌菌液接种到固体发酵培养基中混合均匀后进行好氧发酵，优选是将黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌菌液和地衣芽孢杆菌菌液以体积比6～8:1～2:1～2的比例接种到固体发酵培养基混合均匀后进行好氧发酵，直至物料布满白色菌丝即视为好氧发酵终点，如在温度28℃～32℃，发酵24～72h。进一步优选接种量是按三种菌的总质量：固体发酵培养基的质量＝1:10的量接种。
所述的将罗伊氏乳杆菌菌液、植物乳杆菌菌液和酿酒酵母菌液接种到好氧发酵后的固体发酵培养基中混合均匀后进行厌氧发酵，优选是将罗伊氏乳杆菌菌液、植物乳杆菌菌液和酿酒酵母菌液的混合菌液以体积比5～7:5～7:1的比例接种到好氧发酵后的固体发酵培养基中混合均匀后进行厌氧发酵。进一步优选接种量是按三种菌的总质量：固体发酵培养基的质量＝1:10的量接种。厌氧发酵条件为：温度28℃～35℃，时间36～72h，发酵结束后，即得发酵对虾配合饲料。
1000kg所述的对虾复合预混合饲料由以下质量配比的原料配制而成：维生素A1.0kg，维生素D3 0.22kg，维生素K3 2.0kg，dl-α-生育酚乙酸酯8.08kg，维生素B11.06kg，维生素B2 1.52kg，维生素B6 2.03kg，维生素B12 0.20kg，烟酰胺7.12kg，D-泛酸钙3.16kg，叶酸0.73kg，D-生物素0.92kg，L-抗坏血酸-2-磷酸酯15.29kg，肌醇8.29kg，乙氧基喹啉0.52kg，一水硫酸镁45.50kg，一水硫酸亚铁18.0kg，一水硫酸锌12.49kg，五水硫酸铜3.0kg，一水硫酸锰2.72kg，1％硫酸钴1.0kg，1％碘酸钙1.5kg，1％***钠1.0kg，其余为沸石粉和稻壳粉质量各半。
各菌液浓度最低为：黑曲霉菌液2.0×107cfu/mL、枯草芽孢杆菌菌液1.0×109cfu/mL、地衣芽孢杆菌菌液8.0×108cfu/mL、植物乳杆菌菌液0.8×109cfu/mL、罗伊氏乳杆菌菌液1.0×108cfu/mL、酿酒酵母菌菌液7.0×108cfu/mL。
本发明提出的发酵对虾配合饲料，主要是以玉米渣、豆粕、鱼粉、麸皮以及微量元素添加剂、维生素添加剂为发酵原料，通过混菌二步发酵，首先黑曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌进行好氧发酵产生纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、葡聚糖酶等大量的酶，使发酵原料的淀粉、粗纤维、木聚糖分解为可发酵糖，蛋白质分解为具有生物肽等，然后再添加罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母等厌氧发酵继续分解发酵原料的大分子物质，并产生L-乳酸、罗伊氏素等抑菌物质以及芳香气味，另外乳酸降低pH，有效抑制了有害细菌的生长。
本发明利用黑曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌产生丰富的纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、葡聚糖酶等，将基础发酵原料进行全面协同分解，大分子蛋白质分解为肽和氨基酸，纤维素降解为可发酵的糖类、淀粉分解为可发酵的葡萄糖、木聚糖分解为木糖、葡聚糖等。经过好氧发酵，对虾配合饲料的营养物质得到大量的释放，能够充分的为其他分解能力弱的乳酸菌、酵母菌等微生物提供必需的养分。好氧发酵结束后，立即按照一定的比例接种由罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母组成的混合菌种，进厌氧发酵，经好氧及厌氧发酵后，发酵对虾配合饲料中粗蛋白含量为45％～51％，生物肽含量为15％～17％，L-乳酸含量为60～80mg/g，pH 4.1～4.5，芽孢杆菌总数＞1×109cfu/g，乳酸菌总数＞1×1010cfu/g；另外，发酵代谢产物中，含大量的消化酶，抑菌物质以及免疫增强因子，通过益生菌的发酵后，植物蛋白含有的抗营养因子基本得到降解，发酵后具有良好的酸香味和酒香味，pH在4.0～4.5之间，有利于保存。
本制备方法采用固体和液体混合发酵的工艺，优选出产酶丰富且能共同生长黑曲霉及枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，进行联合发酵，并通过好氧和厌氧两步发酵，充分发挥黑曲霉及枯草芽孢杆菌产酶丰富的优点，使基础发酵原料得到全面的分解，大分子蛋白质分解为肽和氨基酸，纤维素降解为可发酵的糖类、淀粉分解为可发酵的葡萄糖、木聚糖分解为木糖、葡聚糖等，从而使厌氧阶段的罗伊氏乳杆菌的生长繁殖获得大量营养物质的支持。从生物肽含量、L-乳酸含量、菌落数等指标上可反映出本发明提出的制备方法中好氧阶段及厌氧阶段微生物的生长代谢非常旺盛。
本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)都是本领域的常规菌株，都可以从各大保藏中心，或者菌株销售机构购买到。
除非另有说明，本发明涉及的名词定义具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。
与现有的技术相比，本发明的具有以下优点：
(1)本发明提出的发酵对虾配合饲料生物肽含量高，肽可以直接被动物肠道所吸收，其消化吸收率比氨基酸还要高，并且肽的吸收不与氨基酸的吸收产生竞争，具有生物活性的小肽与微量元素的结合，可以极大促进水产动物对微量元素的吸收和利用，从而促进水产动物的生长，降低成本和环境污染，使用本产品养殖对虾，可起到提高对虾对蛋白质的消化吸收，减轻对虾胃肠道负担，增强对虾抗病能力，提高微量矿物元素的利用等作用，极大的改善高蛋白饲料对对虾生长发育带来的不良影响。
(2)本发明提出的发酵对虾配合饲料发酵代谢产生大量消化酶、L-乳酸，抑菌物质等，能提高饲料的营养水平和利用率，抑制对虾肠道内有害菌的的繁殖，增强对虾抗病能力；另一方面罗伊氏乳杆菌及其代谢产物对对虾肠道具有一定的修复作用；使用发酵对虾配合饲料对改善对虾肠道环境，抑制有害细菌生长，减少抗生素使用和提高水产动物饲料转化率等有独特功效。
(3)本发明提出的发酵对虾配合饲料具有高含量的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，可快速降解水中的残饵、粪便等有机碎屑，降低水环境中的氨氮、硫化氢等，避免有机废物在水池中积累，维持水生态的平衡。
(4)本发明提出的发酵对虾配合饲料的制备方法采用固体和液体混合发酵的工艺，优选出产酶丰富且能共同生长黑曲霉及枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，进行联合发酵，并通过好氧和厌氧两步发酵，充分发挥黑曲霉及枯草芽孢杆菌产酶丰富的优点，使基础发酵原料得到全面的分解，大分子蛋白质分解为肽和氨基酸，纤维素降解为可发酵的糖类、淀粉分解为可发酵的葡萄糖、木聚糖分解为木糖、葡聚糖等，从而使厌氧阶段的罗伊氏乳杆菌的生长繁殖获得大量营养物质的支持。
具体实施方式：
为了描述本发明，以下列出了实施例。但需要理解，本发明不限于这些实施例，只是提供实践本发明的方法。
实施例1：
(1)液体发酵菌种的制备
a、黑曲霉(购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GIM 3.576)发酵液的制备：将黑曲霉的斜面菌种放置培养箱中，28℃活化24h，挑取斜面培养基上的菌落接种到装有100mL PDA液体培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养，培养条件为：温度28℃，时间24h，得到黑曲霉发酵液，黑曲霉发酵液中黑曲霉的含量为(2.0～4.0)×107cfu/mL。
其中，PDA液体培养基配方为：去皮马铃薯200g、切碎煮汁过滤去渣，加入蔗糖20g、蛋白胨10g、琼脂18g，再加水定容至1L，调pH7.0。
b、枯草芽孢杆菌(购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GIM1.372)发酵液的制备：挑取枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，37℃摇床活化16h，摇床转速为180r/min；然后将活化好的的菌液按体积比3％接种量接种到一级种子培养基中进行发酵培养，培养条件为：温度37℃，时间24h，得到枯草芽孢杆菌发酵液，枯草芽孢杆菌发酵液中枯草芽孢杆菌的含量为(1.0～1.8)×109cfu/mL。
其中，LB培养基(Luria-Bertani培养基)配方为：将胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g加入到1L蒸馏水中，调pH7.0。
一级种子培养基为：将葡萄糖5g，玉米淀粉15g，豆粕粉20g，酵母粉5g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰0.3g，碳酸钙2.4g加入到蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1L，调pH7.0。
c、地衣芽孢杆菌(购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GIM1.11)发酵液的制备：挑取地衣芽孢杆菌接种到LB培养基中，37℃摇床活化24h，摇床转速为180r/min；然后将活化好的的菌液按体积比3％接种量接种到一级种子培养基中进行发酵培养，培养条件为：温度37℃，时间24h，得到地衣芽孢杆菌发酵液，地衣芽孢杆菌发酵液中地衣芽孢杆菌的含量为(8.0～8.8)×108cfu/mL。
其中，LB培养基(Luria-Bertani培养基)配方为：将胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g加入到1L蒸馏水中，调pH7.0。
一级种子培养基为：将葡萄糖5g，蔗糖10g，蛋白胨20g，酵母粉3g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾2.5g，氯化铵5g加入到蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1L，调pH7.0。
d、植物乳杆菌(购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GIM1.191)发酵液的制备：将植物乳杆菌接种到MRS培养基中，37℃静置活化24h，然后将活化好的菌液按体积比5％的接种量，接种到一级种子培养基中进行发酵培养，培养条件为：静置，温度37℃，时间18～20h，得到植物乳杆菌发酵液，植物乳杆菌发酵液中植物乳杆菌的含量为(0.8～1.5)×109cfu/mL。
其中，MRS培养基的配方为：将蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g加入到水中，再用蒸馏水定容至1000mL，调pH 6.2。
一级种子培养基为：将葡萄糖5g，糖蜜5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰0.5g加入到蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1.0L，调pH6.8。
e、罗伊氏乳杆菌(购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是CICC6118)发酵液的制备：将罗伊氏乳杆菌接种到MRS培养基中，37℃静置活化24h，然后将活化好的菌液按体积比5％的接种量，接种到一级种子培养基中进行发酵培养，培养条件为：静置，温度37℃，时间20～22h，得到罗伊氏乳杆菌发酵液，罗伊氏乳杆菌发酵液中罗伊氏乳杆菌的含量为(1.0～1.4)×108cfu/mL。
其中，MRS培养基的配方为：将蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g加入到蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至1000mL，调pH 6.2。
一级种子培养基为：将葡萄糖5g，糖蜜5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰0.5g加入到蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1L，调pH6.8。
f、酿酒酵母(购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GIM2.167)发酵液的制备：挑取酿酒酵母斜面菌种接种到PDA液体培养基中，28℃摇床活化24h，摇床转速为180r/min；然后将活化好的的菌液按体积比2％接种量接种到一级种子培养基中进行发酵培养，培养条件为：温度28℃，时间24h，得到酿酒酵母发酵液，发酵液中酿酒酵母的含量为(7.0～8.0)×108cfu/mL。
其中，PDA液体培养基配方同上。
一级种子培养基为：将葡萄糖20g，蔗糖20g，大豆蛋白胨30g，酵母粉10g，磷酸氢二钾5g，尿素5g加入到蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1.0L，pH5.8～6.2。
(2)固体发酵培养基的原料：玉米渣10％，豆粕55％，鱼粉10％，对虾复合预混合饲料0.5％，麸皮24.5％，按上述成分含量将上述成分混合均匀，得到混合物，然后再往混合物中加水至其重量含水量为25％，获得固体发酵培养基。
所述的对虾复合预混合饲料(实施例2和3与此相同)，每1000kg由以下质量配比的原料配制而成：维生素A1.0kg，维生素D3 0.22kg，维生素K3 2.0kg，dl-α-生育酚乙酸酯8.08kg，维生素B1 1.06kg，维生素B2 1.52kg，维生素B6 2.03kg，维生素B12 0.20kg，烟酰胺7.12kg，D-泛酸钙3.16kg，叶酸0.73kg，D-生物素0.92kg，L-抗坏血酸-2-磷酸酯15.29kg，肌醇8.29kg，乙氧基喹啉0.52kg，一水硫酸镁45.50kg，一水硫酸亚铁18.0kg，一水硫酸锌12.49kg，五水硫酸铜3.0kg，一水硫酸锰2.72kg，1％硫酸钴1.0kg，1％碘酸钙1.5kg，1％***钠1.0kg，其余为沸石粉和稻壳粉质量各半，将上述原料混合均匀，即得对虾复合预混合饲料。其中，所述的1％硫酸钴、1％碘酸钙和1％***钠均从广州志专饲料有限公司公司购买。
(3)好氧发酵阶段：将步骤(1)制备好的液体发酵菌种按照黑曲霉发酵液，枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液的体积比为6:1:1的比例接种到步骤(2)得到的固体发酵培养基中，接种量为质量比10％(即黑曲霉发酵液，枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌三种菌总质量每1g，接种到10g的固体发酵培养基中)，放置在敞开容器中进行好氧发酵，发酵条件为：温度28℃，时间24h，得到好氧发酵后的固体发酵培养基，物料布满白色菌丝即视为好氧发酵终点，随即进行下一阶段的发酵。
(4)厌氧发酵阶段：加入无菌水使好氧发酵后的固体发酵培养基的水分保持在重量含水量25％，将制备好的液体发酵菌种按照罗伊氏乳杆菌发酵液，植物乳杆菌发酵液和酿酒酵母发酵液的体积比为5:5:1的比例，接种到好氧发酵后的固体发酵培养基中，接种量为10％(即罗伊氏乳杆菌发酵液，植物乳杆菌发酵液和酿酒酵母发酵液三种菌总质量每1g，接种到10g的好氧发酵后的固体发酵培养基)，放置在密封不透气的容器中进行厌氧发酵，发酵条件为：温度28℃，时间36h，发酵结束后，即得到发酵对虾配合饲料。
测定未发酵对虾配合饲料(即步骤(2)的固体发酵培养基)和发酵对虾配合饲料的饲料粗蛋白含量、生物肽含量、L-乳酸含量、芽孢杆菌总数、乳酸菌总数等指标，如表1所示。
表1
| 项目 | 未发酵对虾配合饲料 | 实施例1制得发酵对虾配合饲料 |
| 粗蛋白(％) | 36 | 45 |
| 生物肽(％) | 0.4 | 15 |
| L-乳酸(mg/g) | 0.5 | 60 |
| 芽孢杆菌总数 | 1.2×10<sup>3</sup> | 1.0×10<sup>9</sup> |
| 乳酸菌总数 | 0 | 1.4×10<sup>10</sup> |
实施例2：
(1)依照实施例1的方法制备液体发酵菌种(黑曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母)。
(2)按如下的质量分数称取原料：玉米渣20％，豆粕45％，鱼粉20％，对虾复合预混合饲料0.8％，麸皮14.2％，将上述成分混合均匀得到混合物，在该混合物中加水至其重量含水量为30％，得到固体发酵培养基。
(3)好氧发酵阶段：将步骤(1)制备好的液体发酵菌种按照黑曲霉发酵液，枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液按体积比为7：2：1的比例接种到步骤(2)制备的固体发酵培养基，接种量为质量比10％(三种菌的总质量：固体发酵培养基的质量＝1:10)，放置在敞开容器中进行好氧发酵，发酵条件为：温度30℃，时间48h，得到好氧发酵后的固体发酵培养基，物料布满白色菌丝即视为好氧发酵终点，随即进行下一阶段的发酵。
(4)厌氧发酵阶段：加入无菌水使好氧发酵后的固体发酵培养基的水分保持在重量含水量30％，将制备好的液体发酵菌种按照罗伊氏乳杆菌发酵液，植物乳杆菌发酵液和酿酒酵母发酵液的体积比为6：6：1的比例接种到步骤(3)的好氧发酵后的固体发酵培养基，接种量为10％(三种菌的总质量：好氧发酵后的固体发酵培养基的质量＝1:10)，放置在密封不透气的容器中进行厌氧发酵，发酵条件为：温度32℃，时间54h，发酵结束后，即得到发酵对虾配合饲料。
测定未发酵对虾配合饲料(即步骤(2)的固体发酵培养基)和发酵对虾配合饲料的饲料粗蛋白含量、生物肽含量、L-乳酸含量、芽孢杆菌总数、乳酸菌总数等指标，如表2所示。
表2
| 项目 | 未发酵对虾配合饲料 | 实施例2制得发酵对虾配合饲料 |
| 粗蛋白(％) | 37.6 | 48.5 |
| 生物肽(％) | 0.6 | 16 |
| L-乳酸(mg/g) | 0.62 | 67 |
| 芽孢杆菌总数 | 1.1×10<sup>3</sup> | 2.4×10<sup>9</sup> |
| 乳酸菌总数 | 0 | 1.8×10<sup>10</sup> |
实施例3：
(1)依照实施例1的方法制备液体发酵菌种(黑曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母)。
(2)按如下的质量分数称取原料：玉米渣30％，豆粕30％，鱼粉30％，对虾复合预混合饲料1.5％，麸皮8.5％，将上述成分按其含量混合均匀得到混合物，在该混合物中加水至其重量含水量为35％，得到固体发酵培养基。
(3)好氧发酵阶段：将步骤(1)制备好的液体发酵菌种按照黑曲霉发酵液，枯草芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液体积比为8：1：2的比例接种到步骤(2)制备的固体发酵培养基，接种量为质量比10％(三种菌的总质量：固体发酵培养基的质量＝1:10)，放置在敞开容器中进行好氧发酵，发酵条件为：温度32℃，时间72h，得到好氧发酵后的固体发酵培养基，物料布满白色菌丝即视为好氧发酵终点，随即进行下一阶段的发酵。
(4)厌氧发酵阶段：加入无菌水使好氧发酵后的固体发酵培养基的水分保持在重量含水量35％，将制备好的液体发酵菌种按照罗伊氏乳杆菌发酵液，植物乳杆菌发酵液和酿酒酵母发酵液的体积比为7：7：1的比例接种到步骤(3)的好氧发酵后的固体发酵培养基，接种量为10％(三种菌的总质量：好氧发酵后的固体发酵培养基的质量＝1:10)，放置在密封不透气的容器中进行厌氧发酵，发酵条件为：温度35℃，时间72h，发酵结束后，即得到发酵对虾配合饲料。
测定未发酵对虾配合饲料(即步骤(2)的固体发酵培养基)和发酵对虾配合饲料的饲料粗蛋白含量、生物肽含量、L-乳酸含量、芽孢杆菌总数、乳酸菌总数等指标，如表3所示。
表3
| 项目 | 未发酵对虾配合饲料 | 实施例3制得的发酵对虾配合饲料 |
| 粗蛋白(％) | 38 | 51 |
| 生物肽(％) | 0.8 | 17 |
| L-乳酸(mg/g) | 1.0 | 80 |
| 芽孢杆菌总数 | 1.1×10<sup>3</sup> | 1.5×10<sup>9</sup> |
| 乳酸菌总数 | 0 | 2.0×10<sup>10</sup> |
由表1～3可以得出，实施例1～3制备得到的发酵对虾配合饲料与未发酵对虾配合饲料((即各步骤(2)的固体发酵培养基))相比较，粗蛋白的含量由36％～38％提高至45％～51％，生物肽含量约由0.4％～0.8％提高至15％～17％，L-乳酸含量由0.5～1mg/g提高至60～80mg/g，pH值由6.3～6.5降低至4.1～4.5，芽孢杆菌总数＞1×109cfu/g，乳酸菌总数＞1×1010cfu/g。
Claims (2)
1.一种发酵对虾配合饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)固体发酵培养基原料的制备：原料组分包括玉米渣10%~30%，豆粕30%~55%，鱼粉10%~30%，对虾复合预混合饲料0.5%~1.5%，余量为麸皮，将上述原料成分混合均匀得到混合物，加水至该混合物的含水量为25%~35%，得到pH 值为6.3~6.5的固体发酵培养基；
(2)将黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌菌液和地衣芽孢杆菌菌液以体积比6~8:1~2:1~2的比例接种到固体发酵培养基混合均匀后进行好氧发酵，所述的黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌菌液和地衣芽孢杆菌菌液三种菌液的总质量与固体发酵培养基的质量比为1:10，好氧发酵条件为：温度28℃~32℃，发酵24~72 h；
(3)加入无菌水使好氧发酵后的固体发酵培养基的水分含量保持在25%~35%，将罗伊氏乳杆菌菌液、植物乳杆菌菌液和酿酒酵母菌液的混合菌液以体积比5~7:5~7:1的比例接种到好氧发酵后的固体发酵培养基中混合均匀后进行厌氧发酵，发酵结束后，即得pH 值为4.1~4.5的发酵对虾配合饲料，所述的罗伊氏乳杆菌菌液、植物乳杆菌菌液和酿酒酵母菌菌液的总质量与固体发酵培养基的质量比为1:10，厌氧发酵条件为：温度28℃~3℃，时间36~72 h；
所述的黑曲霉菌液、枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、罗伊氏乳杆菌菌液、植物乳杆菌菌液和酿酒酵母菌液各菌液浓度最低为：黑曲霉菌液2.0×107cfu/mL、枯草芽孢杆菌菌液1.0×109 cfu/mL、地衣芽孢杆菌菌液8.0×108 cfu/mL、植物乳杆菌菌液0.8× 109cfu/mL、罗伊氏乳杆菌菌液1.0×108 cfu/mL、酿酒酵母菌菌液7.0×108 cfu/mL；所述的对虾复合预混合饲料，每1000 kg包括：维生素A 1.0kg，维生素D3 0.22 kg，维生素K3 2.0kg，dl-a-生育酚乙酸酯8.08kg，维生素B1 1.06kg，维生素B2 1.52kg，维生素B6 2.03 kg，维生素B12 0.20 kg，烟酰胺7.12kg，D-泛酸钙3.16kg，叶酸0.73 kg，D-生物素0.92 kg，L-抗坏血酸-2-磷酸酯15.29kg，肌醇8.29 kg，乙氧基喹啉0.52 kg，一水硫酸镁45.50 kg，一水硫酸亚铁18.0kg，一水硫酸锌12.49 kg，五水硫酸铜3.0 kg，一水硫酸锰2.72 kg，1%硫酸钴1.0 kg，1%碘酸钙1.5 kg，1%***钠1.0 kg，其余为沸石粉和稻壳粉质量各半。
2.一种按照权利要求1所述的制备方法制备得到的发酵对虾配合饲料。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: 510000 No. 58, courtyard, No. 100, Xianlie Middle Road, Yuexiu District, Guangzhou City, Guangdong Province Applicant after: Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences Applicant after: Guangdong bide Biotechnology Co., Ltd Address before: 510070 No.56 courtyard, No.100 Xianlie Middle Road, Yuexiu District, Guangzhou City, Guangdong Province Applicant before: GUANGDONG INSTITUTE OF MICROBIOLOGY (GUANGDONG DETECTION CENTER OF MICROBIOLOGY) Applicant before: Guangdong bide Biotechnology Co., Ltd |
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| GR01 | Patent grant | ||
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