CN108152349B - 基于纳米银催化的比色和电化学双通道核酸适配体传感器 - Google Patents

基于纳米银催化的比色和电化学双通道核酸适配体传感器 Download PDF

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Abstract

本发明提供了基于纳米银催化的比色和电化学双通道核酸适配体传感器，用于PDGF‑BB的测定。纳米银具有一定的催化能力，能催化底物硼氢化钠和邻硝基苯酚的反应。将核酸适配体修饰在纳米银上后，构建的双通道传感器，实现了对检测目标的比色，电化学同时测定。通道1比色检测，方法简便，适应于现场快速筛选；通道2电化学检测利用具有优良导电能力的纳米复合物，获得了灵敏的电化学检测信号。本发明提出的方法结合了核酸适配体筛选蛋白的高特异性和纳米银催化的高灵敏性，采用双通道检测模式，具有简便，准确度高，灵敏度好，检出限低的优点，为PDGF‑BB的检测提供了一种新的方法。

Description

基于纳米银催化的比色和电化学双通道核酸适配体传感器
技术领域
本发明属于生物检测和分析仪器技术领域，具体涉及利用纳米银催化能力，构建比色和电化学双通道核酸适配体传感器，实现对血小板衍生生长因子（PDGF-BB）的测定。
背景技术
由于纳米材料具有较大的比表面积，在生物传感器中能够成为高效的催化剂。纳米银做为一种特殊的纳米材料，已经在多种应用领域内，被验证可成为高效率的催化材料，并可应用在生物传感器的开发中。纳米银对染料分子也具备一定的催化还原能力，从而可设计出相应的比色传感器，实现了对靶标的定量分析。
电化学传感器在灵敏度，检测成本，简易性，可靠性和微型化方面具有显著的优势，因此在医疗诊断研究方面获得了广泛的关注。印刷电极制备简单，成本低，易于批量生产，便于集成便携式的现场快速检测仪器，成为电化学传感器一个重要方面，并获得了大量的应用。近年来，纳米材料的出现为发展新型的电化学生物传感器提供了新的途径。
在基于纳米材料生物检测方法中，具备催化活性的纳米材料一般标记在相应的抗体之上。核酸适配体也是能对蛋白质产生特异性结合的具有特定三维结构的单链核酸分子，是一种新的蛋白识别探针。由于适配体是具有特定结构和序列的寡核苷酸，除了具有核酸的稳定性，还便于合成和衍生，所以非常适合作为传感器的识别分子，可以对包括蛋白在内的许多目标分子进行识别，在很大程度上可以取代原来抗体实现识别的任务。近年来国内外的科研工作者构建了多种高效、灵敏的核酸适配体的传感器，实现了对多种蛋白的灵敏测定。
目前，聚合物因为有着独特的电子和化学性质，吸引了相当多的关注，在多领域内获得了广泛的应用，例如能量存储、信息记忆装置和电化学生物传感器。在生物传感器的开发中，电化学聚合方法是一类强有力的工具，然而此类方法主要是利用电聚合的产物做为固定生物分子和电催化剂的基底材料。通过对电聚合产物的直接电化学测定也可成为传感器的信号传导方式。
PDGF-BB的生物测定方法通常为酶联免疫试剂盒检测法，虽然操作方法较为简便，但是检测手段单一，方法中选用的生物酶，抗体等价格昂贵，储藏操作不便。为检测带来一定的局限性。本发明将具有催化活性的纳米材料运用在显色反应或电化学反应中，并结合核酸适配体作为捕获探针，可进行目标蛋白的检测并获取放大的信号。所提出的比色法和电化学法双通道检测平台，可实现对PDGF-BB的准确快递检测，弥补传统的酶标方法不足。
发明内容
本发明克服现有技术不足，提出了一种基于纳米银催化而构建的比色和电化学双通道核酸适配体传感器，实现对PDGF-BB的测定。
为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于纳米银催化构建的比色和电化学双通道核酸适配体传感器，实现对PDGF-BB的测定。将PDGF-BB核酸适配体固定在多孔板孔中，加入目标分析物PDGF-BB，形成适配体与蛋白的复合物后加入PDGF-BB核酸适配体修饰的纳米银探针。加入探针反应后再加入催化反应底物。催化反应完成后，实现双通道检测。通道1采用可见分光光度法，在最大吸收波长下检测底物体系吸光度，利用比色法读取吸光度值可测定样品含量。通道2采用电化学检测方法，可直接向孔中加入还原态氧化石墨烯作为电解质，将印刷电极***其中进行电沉积，完成后将电极置于电解质溶液，检测电极表面形成的聚合物的放大的电化学信号，实现靶标的定量测定。
所述多孔板为市售96孔多孔板。
所述PDGF-BB核酸适配体固定在多孔板孔方法如下：将链霉亲和素用碳酸盐缓冲溶液稀释，加入孔中4 ℃静置12小时并洗涤晾干，将生物素修饰的PDGF-BB核酸适配体加入，37℃下反应30分钟后洗涤晾干。
所述适配体与蛋白的复合物生成反应采用如下步骤：将1% BSA加入到固定过PDGF-BB核酸适配体的孔中，在37℃下封闭1小时，封闭完成后洗涤晾干。将PDGF-BB标准品或试样加入多孔板孔内，37℃反应30分钟后洗涤晾干。在此过程中，孔板上最终形成适配体与蛋白的复合物。
所述PDGF-BB核酸适配体修饰的纳米银探针制备方法如下：将硝酸银和硼氢化钠在冰浴下反应制得纳米银。将链霉亲和素与纳米银在37 ℃混合反应2小时，离心分离后加入生物素修饰的PDGF-BB核酸适配体，37 ℃下反应30分钟后离心分离。所得PDGF-BB核酸适配体修饰的纳米银探针可与PDGF-BB形成适配体与蛋白的复合物。
所述加入探针反应如下：将PDGF-BB核酸适配体修饰的纳米银探针加入到孔中，37℃反应30分钟后，洗涤晾干。
所述反应底物如下：硼氢化钠和邻硝基苯酚。
所述通道1检测方法如下：加入反应底物10分钟后，将反应液置于比色皿中，于波长423 nm下测定吸光度值，定量方法为比色对照法。用可见分光光度计分别读取PDGF-BB标准品和试样反应孔中的褪色后底物体系吸光度值（423 nm），并分别计算标准品孔与空白样品孔吸光度值之间的差值⊿A标准和试样孔与空白样品孔吸光度值之间的差值⊿A试样。采用直接比较的方法可直接计算出试样中PDGF-BB的浓度。
所述通道2检测方法如下：加入反应底物10分钟后，将1 mg/mL的还原态氧化石墨烯加入孔中混匀，***印刷电极，进行电沉积后并将电极洗净晾干。将0.1 mol/L盐酸滴加至电极表面，用示差脉冲伏安法读取电化学信号值，检测信号为峰电流值。定量方法为标准曲线法，以PDGF-BB标准品系列标准溶液的浓度为横坐标，以检测峰电流值为纵坐标绘制标准曲线，可获得标准曲线方程。通过测定样品的峰电流值，利用标准曲线方程可求出试样中PDGF-BB浓度。
所述印刷电极制作方法如下：以PET为基底，在印刷机上分层印制银层、碳层、氯化银层和绝缘层。电极为三电极体系，电极尺寸为0.4 mm × 5 mm × 26 mm。
所述电沉积反应如下用循环伏安法在－0.3 V至1.3 V范围内扫描20圈。
所述电化学信号值检测方法如下：以0.1 mol/L的盐酸溶液为电解质，记录－ 0.3V至0.4 V范围内示差脉冲伏安曲线，检测信号为峰电流值。
所述样品处理方法为：对于血浆或血清样品处理，用PBS稀释100倍，标准品不稀释。
本发明提出的基于纳米银催化的比色和电化学双通道核酸适配体传感器适用于PDGF-BB的快速、便携测定。利用本发明提出双通道方法对PDGF-BB进行测定，检出限分别为：100 pg/mL（通道1）和3 pg/mL（通道2）。通道1比色法测量快速，适于现场检测，通道2电化学检测灵敏度高，适于低浓度样品分析。检测结果与PDGF-AA，PDGF-AB，凝血酶无交叉反应，同时孔间检测CV值低于10%，方法精密度高，回收率在97%至105%之间，方法准确度高。
本发明的有益效果：本发明提供了一种基于纳米银催化能力而构建的比色和电化学双通道核酸适配体传感器用于PDGF-BB的测定。纳米银能催化底物硼氢化钠和邻硝基苯酚。将核酸适配体修饰在纳米银上后，构建的双通道传感器，实现了对检测目标的比色，电化学同时测定。通道1比色检测，方法简便，适应于现场快速筛选；通道2电化学检测利用具有优良导电能力的纳米复合物，获得了灵敏的电化学检测信号。本发明提出的方法结合了核酸适配体筛选蛋白的高特异性和纳米银催化的高灵敏性，采用双通道检测模式，具有方法简便，准确度高，灵敏度好，检出限低的优点。本发明为PDGF-BB的检测提供了一种新的方法。
附图说明
图1基于纳米银催化的比色和电化学双通道核酸适配体传感器示意图。
图2比色法检测通道的紫外-可见吸收光谱曲线。
图3电化学检测通道中的标准曲线。
图4电化学检测通道中干扰物质对PDGF-BB测定结果影响。
具体实施方式
以下实施例中所用序列如下：
生物素修饰的PDFG-BB核酸适配体（Bio-APT）：
5’-AAAAAAAATACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT，其5’端由生物素修饰。
生物素修饰的DNA链（Bio-DNA）：
5’-AAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由生物素修饰。
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1：基于纳米银催化的比色和电化学双通道核酸适配体传感器的构建过程：
（1）孔板固定PDGF-BB核酸适配体：用碳酸盐包被液（0.05 mol/L的碳酸盐缓冲溶液，PH = 9.6）配制2 mg/mL链霉亲和素溶液。每孔加入100 μL链霉亲和素溶液，将孔板置于冰箱中，4℃静置12小时。以PBST溶液(PBS中含有0.05%吐温-20)作为洗涤液，将包被链霉亲和素后的板孔清洗3次，轻轻拍干待用。用0.1 mol/L PBS缓冲溶液配制浓度为200 nmol/L生物素修饰的PDFG-BB核酸适配体（Bio-APT）和200 nmol/L生物素修饰的DNA链（Bio-DNA）。将Bio-APT和Bio-DNA混合（1：3）后共100μL加入孔中，于37 ℃水浴温育30分钟，用PBST溶液洗涤三次并轻轻拍干后，加入1 mg/mL的BSA封闭液封闭，37 ℃水浴中孵育1小时，封闭完成后用PBST溶液洗涤3次并轻拍干。
（2）PDGF-BB核酸适配体修饰纳米银探针制备：将装有0.2 mmol/L硝酸银溶液的圆底烧瓶置于冰浴中，逐滴加入0.3 mmol/L硼氢化钠，并搅拌。硝酸银和硼氢化钠体积比为1:2。反应体系温度恢复至室温时，停止搅拌，制得纳米银溶液。将200 μL链霉亲和素溶液（溶于PBS缓冲溶液）加入2 mL纳米银溶液中，37 ℃混合振荡反应2小时，用PBST洗液离心分离洗涤3次，重新分散至2 mL。然后加入100 μL浓度为10 μmol/L生物素修饰的PDFG-BB核酸适配体（Bio-APT）和300 μL浓度为10 μmol/L生物素修饰的DNA链（Bio-DNA），37 ℃混合振荡反应1小时后，用PBST洗液洗涤三次后重新分散至2 mL。
（3）传感器检测PDGF-BB过程：将PDGF-BB标准品或试样加入上述固定过PDGF-BB核酸适配体的孔板中，每孔50 μL，37℃孵育30分钟后用PBST溶液洗涤3次并轻拍干。每孔加入上述PDGF-BB核酸适配体修饰纳米银探针50 μL，37℃孵育30分钟后用PBST溶液洗涤3次并轻拍干。加入上述PDGF-BB核酸适配体修饰纳米银探针至各孔50 μL，37℃孵育30 min后用PBST溶液洗涤3次并轻拍干。此时孔中形成“适配体-蛋白-适配体修饰纳米银”三明治型夹心结构纳米复合物。
（4）催化反应：反应底物硼氢化钠（50 mmol/L）和邻硝基苯酚（200 mmol/L）以1：1体积比混匀，加入孔中，每孔50 μL，充分混合均匀，在37℃湿盒孵育10分钟。
实施例2：通道1比色法检测：
上述底物体系为黄色，加入至孔板中，在纳米银的催化作用下，产生褪色反应，可用于定量测定，结果见图2,其中曲线a为空白样品孔的检测吸收曲线，曲线b为含有PDGF-BB标样检测吸收曲线。用可见分光光度计分别读取PDGF-BB标准品和试样反应孔中的褪色后底物体系吸光度值（423 nm），并分别计算标准品孔与空白样品孔吸光度值之间的差值⊿A标准和试样孔与空白样品孔吸光度值之间的差值⊿A试样。采用直接比较的方法可直接计算出试样中PDGF-BB的浓度。标准品与试样平均测定三次。
实施例3：通道2电化学检测：
（1）印刷电极印制：印刷电极采用PET作为基底，以银、碳、银/氯化银以及绝缘浆作为材料，按设计图纸进行印刷。银为导电线，碳为工作电极和辅助电极，银/氯化银作为参比电极，制后放入烘箱中，130 ℃条件下固化120分钟。最后印制绝缘浆，光固化10分钟后洗净待用。
（2）电化学检测：上述底物反应10分钟后加入2 mg/mL的还原态氧化石墨烯，为每孔10 μL，混匀。将印刷电极***并连接电化学工作站。采用循环伏安法以100 mV/S的速率在－ 0.3 V至1.3 V范围内扫描20圈进行电沉积。沉积后，电极表面可获得一层导电纳米复合物并用蒸馏水洗净晾干。将沉积后的电极***到0.1 mol/L的盐酸溶液中，用示差脉冲伏安法进行电化学检测，记录－0.3 V至0.4 V峰电流值。每个浓度的标准品及样品平行测定3次。以PDGF-BB标准品溶液浓度为横坐标，以所检测的峰电流值为纵坐标绘制标准曲线（图3），可获得标准曲线方程，将样品测定值带入可获得样品中PDGF-BB的含量。
实施例4：交叉性检验：
本施例考察了本发明对检测PDGF-BB的特异性，由于PDGF-AA，PDGF-AB，凝血酶可能会发生交叉反应，对PDGF-BB的测定产生干扰，所以将上述干扰物质和PDGF-BB标准品分别稀释至浓度为30 ng/mL，按实施例1及实施例2的方法进行测定，结果表明其他三种物质对PDGF-BB的测定无干扰（图4）。

Claims (2)

1.基于纳米银催化的比色和电化学双通道核酸适配体传感器，实现对PDGF-BB的测定，其特征在于：将PDGF-BB核酸适配体固定在多孔酶标板孔中，加入靶标PDGF-BB，形成适配体与蛋白的复合物后加入PDGF-BB核酸适配体修饰的纳米银探针；加入探针反应后加入反应底物；纳米银催化反应完成后实现双通道检测；通道1采用分光光度法，在最大吸收波长下检测底物体系吸光度，利用比色法读取吸光度值可测定样品含量；通道2采用电化学检测方法，可直接向孔中加入还原态氧化石墨烯作为电解质，将印刷电极***其中进行电沉积，完成后将电极置于电解质溶液，检测电极表面形成的纳米复合物的放大的电化学信号，实现靶标的定量测定；
纳米银可以催化硼氢化钠和邻硝基苯酚之间的反应，其中，硼氢化钠和邻硝基苯酚的体积比为1：1，硼氢化钠的摩尔浓度为50mmol/L，邻硝基苯酚的摩尔浓度为200mmol/L；在纳米银的催化作用下，硼氢化钠将黄色的邻硝基苯酚还原成无色的邻氨基苯酚；
直接向催化反应完成后的各孔中加入2mg/mL还原态氧化石墨烯作为电解质，将印刷电极***其中进行电沉积，用循环伏安法在－0.3V至1.3V范围内扫描20圈；完成后检测电极表面形成的纳米复合物的放大的电化学信号，以0.1mol/L的盐酸溶液为电解质，记录－0.3V至0.4V范围内示差脉冲伏安曲线，检测信号为峰电流值，以标准曲线法对PDGF-BB的进行定量测定。
2.如权利要求1所述的传感器，其特征在于：用波长为423nm的可见分光光度计分别读取PDGF-BB标准品和试样反应孔中的溶液的吸光度值，并分别计算标准品孔与空白样品孔吸光度值之间的差值⊿A标准；试样孔与空白样品孔吸光度值之间的差值⊿A试样；采用直接比较的方法可计算出试样中PDGF-BB的含量。
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