CN108135951B - 含有由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖作为有效成分的用于防止脱发或促进生发的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于防止脱发或促进生发的组合物，用于防止脱发或促进生发的组合物包含如下有效成分：由撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerata)生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物。本发明的组合物抑制TGF‑β的表达，从而防止脱发或促进生发的效果优秀，所以包含所述有效成分的组合物可以被有效地利用为用于防止脱发或促进生发的药学组合物、医药外品、健康功能食品及化妆品组合物。

Description

含有由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖作为有效成分的用于防止 脱发或促进生发的组合物
技术领域
本发明涉及一种用于防止脱发或促进生发的组合物，所述用于防止脱发或促进生发的组合物含有如下有效成分：由撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerata)生成的活性成分、包含所述活性成分的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物。
背景技术
头发从头皮脱落的脱发症涉及多种复杂因素而发生。所述因素有：如遗传性体质或男性荷尔蒙的作用一样的内在因素，或者如日常生活中的精神压力、头皮上的过氧化脂质的积累一样的外在因素。最近，趋势为，以男性型脱发和女性肥胖性脱发为首，年轻人的脱发逐渐扩散，为了改善所述脱发现象，许多种类的头发生长剂或育发剂正在上市。
然而，实情为，就想要通过控制男性荷尔蒙来阻止脱发并且促进生发的大部分与脱发相关的技术而言，其效果并不完美，并且无法开发出呈现确切效能的制剂。
与此相关地，韩国登记专利第10-1086504号涉及一种具有改善血液循环及扩张血管功能的用于涂敷于皮肤的组合物，其包含从由作为天然提取物的甘草提取物、姜黄提取物、葡萄提取物、葡萄籽油、西柚提取物、竹子提取物、树莓(raspberry)提取物、桂皮提取物、枳椇提取物、山茶提取物、赤杨提取物或它们的混合物组成的群中选择出的一种以上的提取物，其中记载，所述用于涂敷于皮肤的组合物使得血液循环得到改善，并且使得血管扩张，从而改善由头皮的血液循环障碍导致的脱发症状。
另外，TGF-β(transforming growth factor-β，转化生长因子-β)作为同种异形质体，是在多种细胞和组织中调节早期发育，调节细胞周期，对细胞的增殖、分化、移动及生存、细胞外基质的产生、免疫体系、血管生成和血球细胞产生、细胞凋亡(apoptosis)诱导、骨骼形成以及伤处治愈等进行调节的多功能性细胞因子。此外，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作为同种异形质的糖蛋白质，在伤处部位刺激血管新生，并且在上皮细胞通过特殊的促细胞***剂(mitogen)诱导上皮细胞的移动和增殖，使得血管的透过性增加。
众所众知，在退行期，实际上在发生细胞凋亡过程(apoptosis)的同时在形态学上分泌TGF-β，脱发现象因所述物质而迅速形成。据此，有必要通过对TGF-β的抑制进行诱导来减少正常头发发展为脱发的过程，结果，降低脱发现象。
众所周知，撕裂蜡孔菌作为白腐菌的一种，为了在生态界利用纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)、其他多糖类及甘油(glycerol)等碳源，执行被称为木质素(lignin)分解的共代谢(co-metabolism)。
与利用撕裂蜡孔菌的医学治疗用途相关地，目前为止广为人知的只有韩国登记专利第10-1031605号公开的撕裂蜡孔菌培养液提取物的治疗糖尿病的用途，而利用撕裂蜡孔菌来防止脱发或促进生发的用途到目前为止尚未得到报告。
发明内容
为此，本发明人确认从撕裂蜡孔菌分离的活性成分、包含所述活性成分的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或提取物显示了防止脱发或促进生发的效果，从而完成了本发明。
本发明的目的在于，提供含有由撕裂蜡孔菌生成的活性成分的用于防止脱发或促进生发的组合物、药学组合物、医药外品、健康功能食品及化妆品组合物。
本发明的另一个目的在于，提供一种利用由撕裂蜡孔菌生成的活性成分来防止脱发及促进生发的方法。
本发明的又另一个目的在于，提供用于制造用于防止脱发或促进生发的组合物的由撕裂蜡孔菌生成的活性成分的用途。
为了实现所述目的，本发明提供用于防止脱发或促进生发的组合物、药学组合物、医药外品、健康功能食品及化妆品组合物，所述组合物含有如下有效成分：由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物。
此外，本发明提供一种防止脱发或促进生发的方法，所述防止脱发或促进生发的方法包括：将由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物用药给需要它们的对象。
进一步，本发明提供用于制造用于防止脱发或促进生发的组合物的由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物的用途。
本发明的用于防止脱发或促进生发的组合物含有如下有效成分：由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物，通过抑制TGF-β的表达来减少正常头发发展为脱发的过程，从而降低脱发现象的效果优秀。据此，所述组合物可以用作用于防止脱发或促进生发的药学组合物、医药外品、健康功能食品或化妆品组合物。
附图说明
图1是用多种浓度的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液对人类头发形成细胞株进行处理后的对RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆转录-聚合酶链反应)结果物进行电泳的结果。
图2是用多种浓度的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液对人类头发形成细胞株进行处理后的对RT-PCR结果物进行定量化的结果。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明提供一种用于防止脱发或促进生发的组合物，用于防止脱发或促进生发的组合物含有如下有效成分：由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物。
在本发明中所使用的术语“胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)”是指，作为菌类等微生物的细胞壁的一部分，多糖类分泌至细胞外，从而在其周围生成荚膜，或者作为粘质物分泌至细胞周围或培养基的物质。所述胞外多糖是微生物为了躲避抗体、毒性物质、原生动物及噬菌体(bacteriophage)等外部环境来保护自己而分泌的。
所述胞外多糖可包括40～60重量％的糖及30～40重量％的蛋白质、40～50重量％的糖及32～38重量％的蛋白质、或者43～47重量％的糖及33～36重量％的蛋白质，更为具体地，可包括约45重量％的糖及约34重量％的蛋白质。
所述糖可含有甘露糖(mannose)、半乳糖(galactose)及葡萄糖(glucose)。
所述胞外多糖可具有100～150kDa、110～140kDa或115～125kDa的分子量，更为具体地，可具有约120kDa的分子量。
作为本发明的一个具体例子，所述胞外多糖可通过包括如下步骤的制造方法得以制造：(a)对撕裂蜡孔菌的菌丝体进行液体培养，从而制造撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液；(b)使得所述撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液干燥并进行粉末化；以及(c)用溶剂对撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液的干燥粉末进行提取后，对其进行过滤并减压浓缩。
在所述(a)步骤中的用于对撕裂蜡孔菌的菌丝体进行液体培养的培养基可包括蔗糖、葡萄糖、淀粉、高粱粉、大麦粉、大豆粉、硫酸镁(MgSO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)及水，氢离子浓度pH可以为4.5至6.0。
作为具体例子，所述培养基可包括蔗糖0.2～3重量％、葡萄糖0.2～3重量％、淀粉0.2～4重量％、高粱粉0.1～0.5重量％、大麦粉0.1～0.5重量％、大豆粉0.2～3重量％、硫酸镁(MgSO4)0.01～0.1重量％、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.01～0.25重量％、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01～0.25重量％，剩余为水。
在所述(a)步骤中的液体培养在蓝色LED光源下以使得二氧化碳的浓度保持在1,000～2,000ppm的形式得以进行。
就所述液体培养而言，例如，在20～28℃下，氢离子浓度(pH)为4.5～6.0，光源为蓝色LED，光照度保持0.1～0.8LUX，并且以0.5～2.0kgf/cm2注入空气，二氧化碳的浓度保持为1,000～2,000ppm的同时可进行8～13天。具体地，在20～25℃、pH4.5～6.0、0.5～2.0kgf/cm2以及1,000～2,000ppm的条件下，可进行5～15天。以所述条件进行液体培养时，所生成的胞外多糖的含量高，因此是优选的。
所述(a)步骤中的亲株可在经过如下培养过程后进行使用：将以马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培养基状态在1～5℃下保管中的一个优良菌株，在锥形瓶中使用马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth，PDB)培养基，并在振荡培养器中保持约25℃的温度，并且在经过7～9天培养过程后可以使用。此外，可将进行如上所述的亲株培养后所获得的培养液或菌丝体用作接种体。具体地，作为接种体要投入的菌丝体的量以将要培养的溶液的量为基准，可以为0.5％(w/v)左右。菌丝体量(％/100ml，w/v)多，并非胞外多糖的含量也一起升高，因此优选地，培养基组成适用使得胞外多糖的含量形成得最高的选择性培养条件，而不是适用对菌丝体的生长最好的营养比例及环境条件。
所述培养液能够分离精制为菌丝体和水溶液。为了所述分离精制，可通过多片压滤机(Multi-Sheet Filter Press)和振动离心膜分离机(PALLSEP)对通过离心分离机去除菌丝体的溶液进行反复精制后，进行1分钟紫外线(UV)照射。此外，培养液可在去除氧后进行密封保管，这是因为，培养液中存在菌丝的情况下，因菌丝的生长而给有效成分的含量带来变化。
在所述(b)步骤中，使得在所述(a)步骤制造的菌丝体培养液干燥，从而能够粉末化。所述干燥为了防止消除有效物质，可以在40℃以下的温度，更为具体地，在30℃以下的温度下进行48至96小时。此外，就干燥而言，相比真空干燥机，使用真空冻结干燥机使得有效物质含量变化最小化，因此是优选的，所述真空干燥机将蒸发温度设定得相对较高。
在所述(c)步骤中，用溶剂对在(b)步骤中所获得的菌丝体培养液的干燥粉末进行提取后，对根据本发明的组合物的有效成分胞外多糖进行分离。
具体地，向菌丝体培养液的干燥粉末3～10g中添加蒸馏水100ml，并在充分悬浮后，以5,000rpm～10,000rpm进行10～30分钟离心分离，从而获得上清液，并向所述上清液中添加相当于上清液体积的2～3倍的提取溶剂后，放置于1～5℃的冰箱，可静放10至15小时。在所述静放物中仅对上清液重新以5,000rpm～10,000rpm进行10～30分钟离心分离后，回收沉淀物，从而能够制造粗制(crude)的胞外多糖。在30℃以下对所述粗制的胞外多糖进行真空冻结干燥，从而能够获得胞外多糖。
所述提取溶剂可以是选自由如下物质组成的群中的溶剂或它们的混合溶剂：水、碳原子数量为1至4的低级醇(alcohol)、丙酮(acetone)、***(ether)、氯仿(chloroform)以及乙酸乙酯(ethyl acetate)，更为具体地，可以是选自由如下物质组成的群中的溶剂或它们的混合溶剂：水、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、丁醇(butanol)、丙酮以及乙酸乙酯，更为具体地，可以是水或50～80％(v/v)的乙醇水溶液。
本发明的用于防止脱发或促进生发的组合物通过抑制TGF-β的表达来减少正常头发发展为脱发的过程，从而具有降低脱发现象的效果以及促进生发的效果。
本发明的含有由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物的用于防止脱发或促进生发的组合物出于用来显示防止脱发或促进生发的效果的目的，可作为添加剂用在药学组合物、医药外品、健康功能食品以及/或化妆品组合物等，此时，可根据制造目的适当地调节使用量及使用形态。
相对于所述用于防止脱发或促进生发的组合物总重量，所述胞外多糖可包含0.1至80重量％，具体地，包含0.1至50重量％。此外，所述用于防止脱发或促进生发的组合物能够以相当于所述胞外多糖的含量的量适当地包含撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物。但是，更为具体地，能够根据所述组合物的使用方法及目的适当地调节胞外多糖、包含所述胞外多糖的培养液、所述培养液的干燥粉末或所述培养液的提取物的有效含量。
此外，本发明提供一种用于防止脱发或促进生发的药学组合物，用于防止脱发或促进生发的药学组合物含有如下有效成分：由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物。
所述胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或提取物与如上所述的相同。
本发明的药学组合物通过抑制TGF-β的生成，从而具有减少正常头发发展为脱发的过程的效果。
所述药学组合物所含有的有效成分，除由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物之外，还可以包含常用的适当的载体、赋形剂及稀释剂。
可根据一般方法对根据本发明的药学组合物进行剂型化。作为适合的剂型有锭剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖衣片剂、硬质或软质的胶囊剂、溶液剂、悬浮剂或乳化液剂、注射剂、坐剂等，但是并非限定于此。
根据本发明的药学组合物能够利用药学上非活性的有机或无机载体来制造适当的剂型。换句话说，剂型为锭剂、涂覆的锭剂、糖衣片剂及硬质胶囊的情况，可以包括乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、淀粉或其衍生物、滑石(talc)、碳酸钙(Calcium Carbonate)、明胶(gelatin)、硬脂酸(stearic acid)或硬脂酸盐。此外，剂型为软质胶囊的情况，可以包括植物性油、蜡(wax)、脂肪、半固体及液体的多元醇(polyol)。进一步，剂型为溶液或糖浆(syrup)的情况，可以包括水、多元醇、甘油(glycerol)及/或植物性油等。
根据本发明的药学组合物除了所述载体以外，还可包括保存剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、溶解剂、甜味剂、着色剂、渗透压调节剂、防氧化剂等。
根据本发明的药学组合物的用药方法能够根据剂型而易于选择，并且能够进行口服或非口服用药。用药量虽然可以根据患者的年龄、性别、体重、病情、用药途径的不同而不同，但是通常以有效成分胞外多糖为基准，可将每1kg体重5至500mg，具体地，10至250mg分为每天一次至三次进行用药。但是，所述用药量并非对本发明的范围进行限定。
根据本发明的药学组合物不仅提供优秀的防止脱发及/或促进生发的效果，而且也几乎不存在药物毒性及副作用，从而即使长期服用时也能够放心使用。
此外，本发明提供一种用于防止脱发或促进生发的医药外品，用于防止脱发或促进生发的医药外品含有如下有效成分：由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物。
所述胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或提取物与如上所述的相同。
若本发明的医药外品混合有如下有效成分：由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物，则其剂型不受限制。具体地，所述医药外品可以制造为如生发油、发乳、生发水、洗发香波、润发精、护发素、头发喷雾、发胶、润发油、凝胶、发膜、焗油膏、眉毛生发剂、睫毛生发剂或睫毛营养剂等一样的溶液、溶胶凝胶、乳剂、油、蜡、喷雾等多种形态，也可以用在假发或帽子等头皮或头发用用具的制造或加工中。此外，所述医药外品可以含有各种成分，所述各种成分根据所述各种剂型或适合于最终目的地混合于一般的用于防止脱发的组合物。例如，在具有香波剂型的情况下，可以含有清洗成分的合成界面活性剂和防腐剂、增粘剂、粘度调节剂、pH调节剂、香料、染料、护发精油剂以及水的其中一种以上。
此外，本发明提供一种用于防止脱发或促进生发的健康功能食品，用于防止脱发或促进生发的健康功能食品含有如下有效成分：由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物。
所述胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或提取物与如上所述的相同。
根据本发明的健康功能食品可以是粉末、颗粒、锭剂、胶囊或饮料的形态。此外，根据本发明的健康功能食品可以是糖果、巧克力、饮料、口香糖、茶、维他命复合剂、健康辅助食品等。
此时，所述健康功能食品中所包含的根据本发明的胞外多糖、包含所述胞外多糖的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物的含量，一般可以是整体健康功能食品重量的0.01至50重量％，具体地，可以是0.1至20重量％。此外，就饮料的情况而言，以饮料100ml为基准，能够包含0.02至10g，具体地，包含0.3至1g的含量。
所述健康功能食品包括本发明的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物，同时还可以包括食品学能够允许的食品辅助添加剂。
此外，本发明提供一种用于防止脱发或促进生发的化妆品组合物，用于防止脱发或促进生发的化妆品组合物含有如下有效成分：由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物。
根据本发明的化妆品组合物除包括作为显示防止脱发及促进生发活性的有效成分的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物外，还可以包括化妆品中常用的成分，例如，如稳定剂、增溶剂、界面活性剂、维他命、色素及香料一样的一般的辅助剂以及载体。
所述化妆品组合物可以制造成在本领域一般所制造的任何一种的剂型，例如，可以剂型化为溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、霜、乳液、粉底、肥皂、含有界面活性剂的洗面奶、油、粉状粉底、粉底液、蜡粉底及喷雾等。更为详细地，可以制造为如香波、润发精、头发精华、头发营养剂、护发精华、头发按摩霜、头发洗剂、发膜或头发喷雾一样的剂型，但是并非限定于此。
此外，本发明提供一种用于防止脱发或促进生发的方法，所述防止脱发或促进生发的方法包括：将所述由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物用药给需要它们的对象。
所述对象可以是哺乳动物，具体地可以是人类。
进一步，本发明提供一种用来制造用于防止脱发或促进生发的组合物的所述由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖、包含所述胞外多糖的撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末或所述菌丝体培养液的提取物的用途。
以下，通过以下实施例对本发明进行更加详细的说明。但是，以下实施例只是用于对本发明进行示例，本发明的范围并非仅限定于此。
【实施例】
制造例1.撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液、所述菌丝体培养液的干燥粉末、提取物及胞外多糖(exopolysaccharide；以下称“EPS”)的制造
1.1撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的制造
对从在庆尚北道尚州市采集的柞树活组织中分离的撕裂蜡孔菌的菌丝体进行传代培养，将通过传代培养而培养的毛霉菌在-80℃进行冷冻保管。所述冷冻保管中的菌株在PDA(Potato dextrose agar)培养基(87塑料培养皿；培养基(Difco)，贝克顿迪金森公司(Becton Dickinson and Company))中传代2～3次后，仅将充足数量的完整菌株(以下称为“PDA培养菌株”)在4℃冰箱中保管后进行使用。并且在锥形瓶中形成PDB(Potato dextrosebroth)培养基(Difco，Becton Dickinson and Company)600ml后，在此放入一个PDA培养菌株，并在25℃下进行8天的振荡培养，从而获得了PDB培养菌株。
另外，为了菌株的培养，将液体培养培养基在800L发酵槽中以1.5kgf/cm2注入空气并在121℃下进行20分钟杀菌，所述液体培养培养基包括：蔗糖1.5重量％、葡萄糖0.5重量％、土豆淀粉0.5重量％、高粱粉0.25重量％、大麦粉0.25重量％、大豆粉0.75重量％、硫酸镁(MgSO4)0.05重量％、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.05重量％、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.05重量％，剩余为水。之后，在冷却至23℃的状态下，用起子(starter)接种所述PDB培养菌株600ml，并以0.5～1.5kgf/cm2使得空气进行通气，同时以光源为蓝色LED，光照度保持0.5LUX，二氧化碳的浓度为2,000ppm，对撕裂蜡孔菌菌丝体在23℃的恒温下进行10天的液体培养，从而制造撕裂蜡孔菌菌丝体培养液。
1.2撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末的制造
利用真空冻结干燥机使得在制造例1.1中所制造的撕裂蜡孔菌菌丝体培养液在25℃下进行72小时的真空冻结干燥，然后使其粉末化，从而制造撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末。
1.3撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的提取物的制造
向在制造例1.2中所制造的撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末5g中添加蒸馏水100ml并进行充分悬浮后，以8,000rpm进行20分钟离心分离。向其上清液中加入相当于上清液体积的2～3倍的乙醇，并在4℃下静放12小时。之后，从静放物中提取上清液，从而制造撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的提取物。
1.4从撕裂蜡孔菌菌丝体的提取物中制造EPS
对在制造例1.3中所制造的撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的提取物重新以8,000rpm进行20分钟离心分离后，回收沉淀物，从而获得粗制(crude)的EPS。利用真空冻结干燥机使得粗制的EPS在25℃下真空冻结干燥72小时，从而获得由撕裂蜡孔菌生成的EPS。
实施例1.EPS的特性评价
1.1利用凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography，GPC)进行的EPS的分 子量测定
使得在制造例1中所制造的EPS在0.1M Na2SO4/0.05M NaN3(通过冰醋酸(glacialacetic acid)将pH调整为4)溶液中以成为1％(w/v)的形式溶解后，以4,000rpm进行0.5小时的离心分离，然后用0.45μm针筒式过滤器(syringe filter)仅过滤上层液，并通过GPC进行分析。
具体地，就GPC分析条件而言，通过检测器利用了折射指数，就GPC柱而言，利用OHpak SB 805 HQ(Shodex，Japan)，作为流动相，使用了0.1M Na2SO4/0.05M NaN3(通过冰醋酸将pH调整为4)，流动相的流速以1.0ml/分的速度流动。标准曲线利用具有各自不同的分子量(130kDa、400kDa、770kDa或1200kDa)的葡聚糖(American Polymer Corporation，USA)来制作，并且利用折射指数(refractive index，RI)测定器Knauer K-2310(Germany)来测定EPS的分子量。对测定条件进行整理如下表1。
【表1】
分子量的测定
GPC*** Knauer K-501***
色谱柱 OHpak SB 805 HQ(Shodex，Japan)
流动相 0.1M Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>/0.05M NaN<sub>3</sub>/pH 4
流速 1.0ml/分
测定器 RI(Knauer K-2310)
其结果显示为，本发明的EPS的分子量约为120kDa。
1.2 EPS的糖及蛋白质含量测定
对在制造例1中所制造的EPS进行二次精制，并且用蛋白水解酶进行处理，从而测定了糖及蛋白质含量。
具体地，将一次精制的EPS(在制造例1中所制造的EPS)溶入蒸馏水后，以8,000rpm进行20分钟离心分离，从而分离出上清液。向所分离的上清液中添加相当于上清液体积的2～3倍的乙醇，并放入4℃的冰箱，静放12小时。之后，在静放物中再次以8,000rpm仅对上清液进行20分钟离心分离后，对沉淀物进行回收，从而获得了二次精制的EPS。使得所述二次精制的EPS溶解于蒸馏水后，用作为蛋白水解酶的碱性蛋白酶(alcalase)以0.5％(w/v)的浓度在50℃下处理30分钟。
通过苯酚-硫酸法(phenol-sulfuric acid method)测定糖含量。具体地，向按照不同浓度稀释的样本1ml中添加80％(w/v)苯酚25μl后，添加硫酸2.5ml，并冷却至室温。在465nm下测定吸光度从而对糖含量进行计算。
此外，蛋白质含量通过BCA方法(Smith PK等，Analytical Biochemistry，150(1)：76-85，1985)得到测定，并使用牛血清白蛋白作为标准物。
如上所述，所测定的糖含量及蛋白质含量显示在下表2中，并且糖含量显示为45至51重量％，蛋白质含量显示为33至34重量％。
【表2】
收率(％) 总糖含量(％) 总蛋白质含量(％)
EPS 1.22±0.03 45.32±1.41 34.17±0.73
二次精制的EPS 0.78±0.01 50.49±0.52 33.50±2.79
经酶处理的EPS* 0.24±0.06 51.39±1.32 34.61±1.51
＊酶处理：碱性蛋白酶0.5％，50℃，30分钟。
各个数值为平均±SE(n≥3)。
此外，EPS的糖构成成分分析结果显示为，EPS主要含有甘露糖、半乳糖及葡萄糖。
实施例2.TGF-β2表达抑制效果测定
为了对制造例1.2的撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末的防止脱发效果进行评价，将撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末按照不同浓度溶入蒸馏水，形成水溶液，用所述水溶液对人类头发形成细胞株进行处理后，测定TGF-β2的表达量。
具体地，将人类头发形成细胞株(HaCaT；来源：CLS(Cell Lines Service GmbH，Eppelheim，Germany))放入于96孔板(96Well Plate)的孔，在37℃及5％CO2条件的培养器中培养3天，96孔板包含DMEM培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，Gibco BRL，Gibco lsland，NY)，DMEM培养基含有5％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)(Gibco BRL，Gibco lsland，NY)及1％抗生剂(Antibiotic antimycotic solution，Gibco BRL，Gibcolsland，NY)。之后，用样本液2μl分别对各个孔的200μlDMEM进行处理，然后在37℃及5％CO2条件的培养器中培养24小时。所述样本液是将制造例1.2的撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末按照1μg/ml、3μg/ml或10μg/ml的浓度溶入蒸馏水的水溶液，对照组并未对撕裂蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末进行处理。
之后，利用easy-BLUETM总RNA提取试剂盒(easy-BLUETM Total RNA Extractionkit)(iNtRON Biotechnology lnc.，首尔，韩国)，根据制造商的指示，对前体-RNA(pre-RNA)进行分离，并且利用能够将分离出的前体-RNA(1μg)用作商业用途的
Figure GDA0002962494880000121
RTpreMix(Bioneer Co.,大田，韩国)来逆转录为cDNA。cDNA通过
Figure GDA0002962494880000122
PCR Premix(Bioneer Co.,大田，韩国)和对TGF-β2以及β-actin(β-肌动蛋白)的mRNA特殊的引物(ChoHR等,J.Korean Med.Sci.,2004,19,853-858)而得到增殖。具体地，逆转录PCR(RT-PCR)以如下步骤为一周期而执行30周期：在95℃下4分钟预变性(pre-denaturation)、在95℃下1分钟变性(denaturation)、在55℃下1分钟复性(annealing)、在72℃下5分钟延长(elongation)、在72℃下5分钟后延长(post-elongation)。将PCR结果物电泳于1％琼脂糖凝胶(agarose gel)，以β-actin mRNA为基准，利用Quantity One软件对相对的mRNA表达量进行定量化。所述PCR结果物的电泳结果示出于图1，定量化结果示出于图2。
如图1及图2所示，与未处理组相比，用3μg/ml的本发明的撕裂蜡孔菌菌丝体培养液进行处理的细胞有意地将TGF-β2表达量减少至67.6％，并且用10μg/ml的所述菌丝体培养液进行处理的细胞明显将TGF-β2表达量减少至42.1％。由此可知，本发明的撕裂蜡孔菌菌丝体培养液与浓度相关地妨碍TGF-β2的表达，从而显示出抑制脱发及促进生发的活性。

Claims (9)

1.一种用于防止脱发或促进生发的组合物，其含有如下有效成分：由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖；所述胞外多糖包括43～47重量%的糖及33～36重量%的蛋白质，并且所述胞外多糖具有115～125kDa的分子量；
所述胞外多糖通过包括如下步骤的制造方法得以制造：
（a）对撕裂蜡孔菌的菌丝体进行液体培养，从而制造撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液；
（b）使得撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液干燥并进行粉末化；以及
（c）用溶剂对撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液的干燥粉末进行提取后，对其进行过滤并减压浓缩；
所述（c）为：
将蒸馏水100ml添加至蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末5g中，并充分悬浊之后，以8，000rpm离心分离20分钟之后，向此上清液中加入相当于其量的2～3倍的乙醇，并在4℃下静放12小时；之后在静放物中提取上清液，从而制造了蜡孔菌菌丝体培养液的提取物；
以8，000rpm对在蜡孔菌菌丝体培养液的提取物重新进行离心分离20分钟之后，回收沉淀物，从而获取粗制胞外多糖；在真空冻结干燥器使得所述粗制胞外多糖在25℃下真空冻结干燥72小时，从而获得由蜡孔菌生成的胞外多糖。
2.根据权利要求1所述的用于防止脱发或促进生发的组合物，所述胞外多糖中的糖，含有甘露糖、半乳糖及葡萄糖。
3.根据权利要求1所述的用于防止脱发或促进生发的组合物，用于所述液体培养的培养基包括蔗糖、葡萄糖、淀粉、高粱粉、大麦粉、大豆粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及水，氢离子浓度pH为4.5至6.0。
4.根据权利要求1所述的用于防止脱发或促进生发的组合物，所述液体培养在蓝色LED光源下以使得二氧化碳的浓度保持在1，000～2，000ppm的形式得以进行。
5.根据权利要求1所述的用于防止脱发或促进生发的组合物，所述胞外多糖的含量为0.1 至80重量%。
6.根据权利要求1所述的用于防止脱发或促进生发的组合物，所述组合物抑制TGF-β的生成。
7.一种用于防止脱发或促进生发的医药外品，其包含如下有效成分： 由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖；
所述胞外多糖通过包括如下步骤的制造方法得以制造：
（a）对撕裂蜡孔菌的菌丝体进行液体培养，从而制造撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液；
（b）使得撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液干燥并进行粉末化；以及
（c）用溶剂对撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液的干燥粉末进行提取后，对其进行过滤并减压浓缩；
所述（c）为：
将蒸馏水100ml添加至蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末5g中，并充分悬浊之后，以8，000rpm离心分离20分钟之后，向此上清液中加入相当于其量的2～3倍的乙醇，并在4℃下静放12小时；之后在静放物中提取上清液，从而制造了蜡孔菌菌丝体培养液的提取物；
以8，000rpm对在蜡孔菌菌丝体培养液的提取物重新进行离心分离20分钟之后，回收沉淀物，从而获取粗制胞外多糖；在真空冻结干燥器使得所述粗制胞外多糖在25℃下真空冻结干燥72小时，从而获得由蜡孔菌生成的胞外多糖。
8.一种用于防止脱发或促进生发的化妆品组合物，其包含如下有效成分：由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖；
所述胞外多糖通过包括如下步骤的制造方法得以制造：
（a）对撕裂蜡孔菌的菌丝体进行液体培养，从而制造撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液；
（b）使得撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液干燥并进行粉末化；以及
（c）用溶剂对撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液的干燥粉末进行提取后，对其进行过滤并减压浓缩；
所述（c）为：
将蒸馏水100ml添加至蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末5g中，并充分悬浊之后，以8，000rpm离心分离20分钟之后，向此上清液中加入相当于其量的2～3倍的乙醇，并在4℃下静放12小时；之后在静放物中提取上清液，从而制造了蜡孔菌菌丝体培养液的提取物；
以8，000rpm对在蜡孔菌菌丝体培养液的提取物重新进行离心分离20分钟之后，回收沉淀物，从而获取粗制胞外多糖；在真空冻结干燥器使得所述粗制胞外多糖在25℃下真空冻结干燥72小时，从而获得由蜡孔菌生成的胞外多糖。
9.一种用于制造用于防止脱发或促进生发的组合物的由撕裂蜡孔菌生成的胞外多糖的用途；
所述胞外多糖通过包括如下步骤的制造方法得以制造：
（a）对撕裂蜡孔菌的菌丝体进行液体培养，从而制造撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液；
（b）使得撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液干燥并进行粉末化；以及
（c）用溶剂对撕裂蜡孔菌的菌丝体培养液的干燥粉末进行提取后，对其进行过滤并减压浓缩；
所述（c）为：
将蒸馏水100ml添加至蜡孔菌菌丝体培养液的干燥粉末5g中，并充分悬浊之后，以8，000rpm离心分离20分钟之后，向此上清液中加入相当于其量的2～3倍的乙醇，并在4℃下静放12小时；之后在静放物中提取上清液，从而制造了蜡孔菌菌丝体培养液的提取物；
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