CN108135942A - 基于脂肪来源的干细胞的干细胞疗法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及源自脂肪来源的干细胞(ASC)和组合物，以及制备这种ASC和组合物的方法以及将其用于治疗的用途。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪来源的干细胞(ASC)和组合物，以及制备这种ASC和组合物的方法以及将其用于治疗的用途。
背景技术
许多临床前研究已经证实来自骨髓以及脂肪组织的间充质基质细胞(MSC)具有很强的再生能力。来自两种组织来源的间充质基质细胞通过旁分泌机制改善再生，该旁分泌机制释放促进天然内源性修复机制的胞外物质，天然内源性修复机制包括基质重塑、血管再生和免疫调节。
已经证明MSC在治疗严重的稳定性冠状动脉疾病和顽固性心绞痛以及慢性缺血性心力衰竭方面是安全有效的(例如，Mathiasen等，2012；Mathiasen等，2013)。用ASC治疗慢性心肌缺血的临床安全性同样也有记载(Qayyum等，2012；Ekblond，2015)。由于其抑制或阻止树突细胞成熟以及T细胞、B细胞和NK细胞增殖的能力，MSC也具有免疫抑制特性，并且正在探索用于治疗多种自身免疫性或其他炎症性病症(Gebler等，2012；Wang等，2014)。
然而，目前的ASC制造方法和临床组织工作不够理想，阻碍了这类治疗的广泛传播。因此，需要安全高效的方法来制造和保存适用于广泛的治疗应用的高质量同种异体(allogenic)ASC制剂。
WO2014/203267(Kaziak Research PVT Ltd.)涉及一种用于人脂肪组织来源的MSC的分离、纯化和工业规模扩增的方法及其在治疗I型糖尿病、严重肢体缺血和其他病症中的用途。
WO 2006/037649(Cellerix S.L.和Universidad Autónoma de Madrid)涉及从非骨软骨间充质组织识别和分离多能细胞，其特征在于某些标记物。
尽管本领域有这些和其他的进展，但仍需要新的用于ASC的制造和配制技术。
发明内容
本发明人已经发现，可以高效地产生并在高浓度下在无蛋白质的冷冻保护剂中冷冻高质量ASC“现成(off-the-shelf)”制剂。当将冷冻的ASC制剂解冻时，其随时可供临床使用。此外，ASC制剂具有免疫抑制特性，使其适用于自体(autologous)和同种异体使用，例如免疫抑制疗法。
因此，本发明的第一方面涉及制备包含基本上同质的成人干细胞群体的组合物的方法，其包括一个或多个以下步骤：
(i)将从供体收集的脂肪抽吸物(lipoaspirate)的基质血管部分(SVF)加入到生物反应器中，任选地生物反应器中表面经过预处理以促进ASC的粘附；
(ii)在生物反应器中，在补充有人血小板裂解物的无血清培养基中培养粘附细胞至汇合；
(iii)分离粘附细胞；
(iv)以至少1×106个细胞/mL的浓度在冷冻保护剂中冷冻分离的细胞；
(v)使冷冻的细胞解冻并将步骤(ii)和(iii)以及任选的(iv)重复至少一次，
(vi)以至少1×107个细胞/mL的浓度冷冻分离的细胞；和；
(vii)任选地，使冷冻的组合物解冻。
第二方面，本发明涉及一种组合物，例如药物组合物，其包含基本上同质的成人干细胞群体(分离自从供体收集的脂肪组织)在无蛋白质的冷冻保护剂中的混悬液，其中细胞浓度为至少1×107个细胞/mL。任选地将该组合物冷冻。在一个实施方式中，组合物使用第一方面的方法制备。
第三方面，本发明涉及这种组合物作为药物例如用于免疫抑制，用于治疗自身免疫性或其他炎症性病症，以及用于治疗缺血性病症或以组织破坏为特征的其他病症的用途。在一个实施方式中，组合物用在治疗缺血性心脏病的方法中，通常通过直接心肌内注射来施用组合物。特别考虑的是同种异体疗法，即，其中ASC的供体不是将要施用组合物的患者。
第四方面，本发明涉及基本上同质的成人干细胞群体，其分离自从供体收集的脂肪组织，其中至少约80％的ASC群体表达CD90、CD73、CD13、CD105、CD29、CD166、CD10、CD140b、CD160、CD204、CD272、CD44、CD49a、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G和LTβR，以及至多约15％的ASC群体表达CD45、CD19、CD14、CD106、CD31和CD36。在一个实施方式中，干细胞群体用第一方面的方法制备。
这些和其它方面以及实施方式在以下更详细地进行解释。
附图说明
图1描述了根据本发明一些实施方式的ASC的制备方法。
具体实施方式
本发明涉及基于从健康供体分离的ASC的干细胞产品，典型地通过在生物反应器中使ASC扩增两轮，通过冷冻保存(cryopreservation)步骤分隔开，产生适于在细胞库中冷冻保存的组合物。该产品可用作同种异体治疗药物，例如用于以缺血或其他组织破坏为特征的病症或疾病(例如有和没有心力衰竭的心脏病)的再生治疗，用于自身免疫反应或移植排斥的免疫抑制或炎症性疾病的抗炎治疗。特别地，ASC组合物可以用作现成的冷冻保存产品，储存在例如液氮中，并且在解冻后直接可供使用。然后可将ASC组合物静脉内、动脉内或通过直接注射或输注到组织例如心肌中加以施用。
此外，根据本发明包含来自不同供体的多种ASC制剂的细胞库可以通过例如以下而提供个性化的治疗：允许在治疗之前进行供体和受体之间的组织匹配，允许对受体的数次治疗，以及在受体需要数次治疗的情况下可以将ASC从一个供体转换到另一个供体。后者特别适用于受体自先前施用的ASC制剂发展出针对ASC的同种异体抗体应答的情况。
定义
“ASC”、“脂肪组织来源的干细胞”、“脂肪组织来源的基质细胞”等是指多能基质干细胞，也称为间充质干细胞、多能基质细胞、多能干细胞和间充质基质/干细胞，它们来源于脂肪组织。识别ASC的某些标准在本领域中是已知的，并在例如Bourin等(2013)中有述，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，ASC的特征在于它们在适当条件下沿着脂肪细胞、成软骨细胞和成骨细胞谱系分化的能力。培养中的ASC特征可在于表达下列一种或多种细胞表面标记物：CD90、CD73、CD105，而缺乏CD45和CD31的表达。在一些实施方式中，它们可以通过它们对CD36的阳性和对CD106的阴性而与骨髓来源的MSC区分。
根据本文所述的本发明方法制备的干细胞群体是“基本上同质的”，这意味着大部分细胞符合ASC标准。典型地，根据本发明的基本上同质的ASC群体的特征在于ASC群体的至少约80％表达CD90、CD105、CD13、CD73、CD166、CD29和任选的CD10、CD140b、CD160、CD204、CD272、CD44、CD49a、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G和LTβR；且ASC群体的至多约15％表达CD45、CD31、CD14和CD19。在本发明的一些ASC群体中，CD90、CD73、CD13、CD105、CD29、CD166、CD10、CD140b、CD160、CD204、CD272、CD44、CD49a、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G和LTβR中的一种或多种可以由ASC群体的至少约80％，比如至少约85％，比如至少约90％，比如至少约95％，比如至少约97％或更多表达。同样地，在本发明的一些ASC群体中，CD45、CD19、CD14、CD106、CD31和CD36中的一种或多种可以由ASC群体的至多约15％，比如至多约12％，比如至多约10％，比如至多约7％，例如至多约5％，例如至多约3％或更少表达。对这些和其他标记物而言考虑的特定范围是由表15和20中所示的ASC群体的最小和最大表达百分比所限定的那些。
“脂肪”是指任何脂肪组织。脂肪组织可以是来自腹部区域或其他脂肪组织部位的棕色或白色脂肪组织。在某些实施方式中，脂肪是皮下白色脂肪组织或内脏脂肪组织或任何其他含有脂肪细胞的组织。脂肪组织可以来自任何哺乳动物。优选地，脂肪组织是人的，最优选来自成人。脂肪组织的一个方便来源是抽脂手术。
如本文所用，“脂肪抽吸物(lipoaspirate)”是指通过抽吸器(即抽吸装置)在抽脂过程中移除的材料。脂肪抽吸物包含脂肪细胞、脂肪、***、血管和基质血管部分。可以使用本领域已知的任何类型的抽脂方法，包括但不限于抽吸辅助、超声辅助、动力辅助、双套管(twin-cannula)辅助、激光辅助和水辅助抽脂(WAL)。然而，WAL是优选方案。然后可以使用本领域已知的方法从脂肪抽吸物中分离“基质血管部分”或“SVF”，并且在下面例示。
如本文所用，术语“生物反应器”是指其中生物和/或生物化学过程在受监测和控制的环境和操作条件下(例如pH、温度、气体/空气和营养物质的供应以及废物移除)进行的任何装置。
本文所用的术语“冷冻保存”或其各种语法形式是指保存细胞以在零度以下的温度下储存在冷冻保护剂中。对于长期储存，含有细胞和冷冻保护剂的冷冻小瓶通常置于液氮中。
如本文所用的术语“冷冻保护剂”是指当将细胞或组织冷却至零下的温度时使细胞或组织中的冰晶形成最小化，并且与无冷冻保护剂的冷却效果相比，对升温后的细胞或组织导致显著更小损坏的试剂。
如本文所用，“存活力(viability)”是指细胞不吸收膜不透性染料(例如，台盼蓝、FVS-780、SYTOX蓝、碘化丙啶)的特征，由此证明细胞膜的完整性。
如本文所用的“增殖能力”是指细胞在合适的培养基中繁殖的能力。例如，增殖能力可以由与最初铺板的细胞数相比24小时、48小时或72小时培养期后的相对细胞数来表示。这也可以表示为一定时期内的“群体倍增数”。例如，在细胞培养中48小时内至少为1的群体倍增数意味着接种的细胞数量在该期间至少翻了一番。
如本文所用，术语“供体”是指典型地通过抽脂从中收回脂肪组织的人或哺乳动物。优选地，人是成人。
本文使用的术语“治疗”、“疗法”等通常是指获得期望的药理和/或生理效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言该效果可以是预防性的，和/或就疾病和/或可归因于该疾病的副作用的部分或完全稳定或治愈而言该效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物，特别是人或兽医受试者中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病或症状在可能易患疾病或症状但尚未被诊断为患病的受试者中发生；(b)抑制疾病症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病症状，即导致疾病或症状消退(regression)。
在所公开的药物组合物的治疗用途的情况下，在“同种异体”疗法中，供体和受体是同一物种的基因上不同的个体，而在“自体”疗法中，供体和受体是同一个体。
术语“受体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指期望治疗或疗法的哺乳动物受试者，特别是人。
发明的具体实施方式
方法：
根据本发明的方法提供一种安全有效的制造技术，其基于例如以下的组合：人血小板裂解物作为ASC的生长补充剂，在封闭式生物反应器***中扩增，以及ASC最终配制为具有高质量ASC的同种异体冷冻保存即用型产品。
图1中示出了根据一些不同实施方式的方法的总体概述。
典型地，使用本发明的方法，从SVF制备一批ASC产品仅需要约15至约18天，不包括冷冻保存的时间。考虑到从一个生物反应器SVF运行，可以得到平均产量为11±5个中间产品小瓶(3个SVF运行的平均值)，每个产生5±2安瓿终产品的平均批次产量(基于8个生物反应器ASC运行的平均值)，扩增效率是特别惊人的。因此，从SVF中约1亿个单核细胞(MNC)可获得55个各自具有约1.1亿个ASC的冷冻小瓶(cryovial)的平均产量。此外，如实施例中所述，ASC产品的特征在于高存活力(平均90±2％)，如在第二次传代ASC产品解冻后即刻测定的。
在一个实施方式中，用于制备包含基本上同质的成人干细胞群体的组合物的方法包括以下步骤：
(i)将从供体收集的脂肪抽吸物的SVF加入到生物反应器中，生物反应器中至少一个表面经过预处理以促进成人干细胞的粘附；
(ii)在生物反应器中，在补充有人血小板裂解物的无血清培养基中培养粘附细胞至汇合；
(iii)分离粘附细胞；
(iv)以至少1×106个细胞/mL的浓度在冷冻保护剂中冷冻分离的细胞；
(v)使冷冻的细胞解冻并重复步骤(ii)至(iii)至少一次，
(vi)以至少1×107个细胞/mL的浓度冷冻分离的细胞；和
(vii)任选地，使冷冻的组合物解冻。
在一个实施方式中，用于制备包含基本上同质的成人干细胞群体的组合物的方法包括以下步骤：
(i)将从供体收集的脂肪抽吸物的SVF加入到生物反应器中，生物反应器中至少一个表面经过预处理以促进成人干细胞的粘附；
(ii)在生物反应器中，在补充有人血小板裂解物的无血清培养基中培养粘附细胞至汇合；
(iii)分离粘附细胞；
(iv)重复步骤(ii)和(iii)至少一次；
(v)以至少1×107个细胞/mL的浓度冷冻分离的细胞；以及任选地，
(vi)使冷冻的组合物解冻。
在一个实施方式中，用于制备包含基本上同质的成人干细胞群体的组合物的方法包括以下步骤：
(i)将从供体收集的脂肪抽吸物的基质血管部分(SVF)加入到生物反应器中，生物反应器中至少一个表面经过预处理以促进成人干细胞的粘附；
(ii)在补充有人血小板裂解物的无血清培养基中培养SVF的粘附细胞至汇合；
(iii)分离粘附细胞；
(iv)以至少1×106百万个细胞/mL的浓度在冷冻保护剂中冷冻分离的细胞；
(v)使冷冻的细胞解冻并重复步骤(ii)至(iv)，以至少1×107个细胞/mL的浓度冷冻分离的细胞；以及任选地，
(vi)使冷冻的组合物解冻。
从得自健康供体的脂肪抽吸物例如50mL、100mL、200mL、300mL或500mL、比如100-300mL的脂肪抽吸物中分离SVF。典型地，首先使用利用倾析、沉降或离心技术以分离材料的组织收集容器将脂肪组织与非脂肪组织分离。然后使用以下方法将脂肪组织分解，所述方法比如机械力(切碎或剪切力)，借助一种或多种蛋白水解酶(比如胶原酶、胰蛋白酶、TrypLe Select、脂肪酶、释放酶HI、胃蛋白酶)的酶促消化，或者机械和酶促方法的组合。之后，通过过滤、离心等可以收回剩余的细胞。在Godthardt等，(2008)MACS Miltenyi BiotecInformation Pamphlet和WO 2014/138383中描述了从脂肪抽吸物中收回SVF的方法的实例。
在一个实施方式中，在局部麻醉下通过从腹部抽脂从供体获得大约100ml的脂肪抽吸物。将脂肪抽吸物用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次以除去残余血液。然后通过与溶于平衡盐溶液中的胶原酶在37℃在持续旋转下孵育45分钟来消化脂肪组织。胶原酶用含有5％人血小板裂解物和1％青霉素/链霉素的培养基中和，并通过100μm过滤器过滤。将剩余的细胞在室温下以1200x g离心10分钟，重悬并根据制造商的说明使用细胞计数器计数。
典型地，生物反应器的至少一个表面经过预处理以帮助或促进ASC的粘附，由生物反应器的制造商进行或者在开始制备工序之前的某个选定的时间点进行。促进细胞粘附的各种类型的处理在本领域中是已知的，包括例如组织培养处理和用合成的带电聚合物、纳米纤维、糖胺聚糖和各种蛋白质组合物进行涂覆。对于组织培养处理，用等离子体气体对生物反应器中的聚苯乙烯基表面进行改性，导致疏水性塑料表面变得更亲水，净负电荷促进细胞附着(attachment)。至于预涂覆表面，用于该目的的蛋白质组合物可以包含一种或多种血浆蛋白，比如血纤蛋白原、纤连蛋白、因子VIII、血管假性血友病因子(von Willebrandfactor)和因子XIII；一种或多种细胞外基质蛋白质，比如胶原蛋白和层粘连蛋白；和/或一种或多种蛋白聚糖。在一个实施方式中，蛋白质组合物包含血纤蛋白原和纤连蛋白之一或两者或由其组成。在一个实施方式中，蛋白质组合物包含冷沉淀(cryoprecipitate)或由其组成。冷沉淀是公知的由血浆制备的血液制品，例如，将新鲜血浆冷冻和解冻并收集沉淀。该产品通常含有血纤蛋白原和因子VIII，以及例如血管假性血友病因子、因子XIII和纤连蛋白。在一些实施方式中，冷沉淀对于每70IU因子VIII含有至少140mg或更多的血纤蛋白原，任选由AB或低滴度A血供体制备。在另一个实施方式中，蛋白质组合物包含如下所述的人血小板裂解物或由其组成。
适用于本发明的生物反应器的基本类别包括中空纤维生物反应器和摇摆、旋转或转动灌流***(perfusion system)，其具有或不具有微载体或盘，适用于锚定依赖性细胞扩增。优选地，生物反应器是功能上封闭的***或由无菌屏障过滤器保护，其能够提供连续供应的培养基和在细胞培养过程中连续去除废物。最优选的是封装在孵育器中的一次性中空纤维生物反应器，为细胞附着提供至少0.5m2、比如至少1m2、比如至少1.5m2、比如至少2m2、比如介于1至3m2之间的表面积。优选地，表面积为至少2m2，比如约2.1m2。这种生物反应器的一个例子是Quantum细胞扩增***(Quantum Cell Expansion System，本文也称为“Quantum生物反应器”)，其通过具有用于介质和试剂或细胞的入口的两个循环回路供料，废料被移入废料袋中。如实施例7所示，在生物反应器中扩增ASC相对于标准组织培养瓶中的手动处理显著增加了扩增率和产量。
在将SVF(或第一次传代的ASC)装载到生物反应器中之前，可以用缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)对***进行预备(primed)，随后装载蛋白质或其他组合物用于涂覆。在装载细胞之前，可以将缓冲液从***中洗出并用完全培养基替换。
然后可以将细胞加入到生物反应器中。例如，来自SVF制备物的约1千万、2千万、5千万、1亿、2亿或5亿个单核细胞(MNC)或约5百万、1千万、2千万、5千万或1亿个第一次传代的ASC可通过入口(任选地经过滤器)装载到预备和涂覆的生物反应器中。优选地，对于MNC，装载来自SVF的约1亿个细胞。对于第二次传代，优选地，装载来自第一次传代ASC的约5百万至5千万个细胞，例如5百万至3千万、5百万至2千5百万、1千万至3千万或1千5百万至2千5百万个细胞。对于细胞的任何较高级传代(即第3次传代，第4次传代等)，可以以与第二次传代相似的量添加细胞。然后使细胞附着足够的时间，例如至少5小时和/或至多约24小时，然后激活介质的连续进料。例如，介质进料速率可以从约0.1mL/min开始，然后基于葡萄糖和/或乳酸盐测量和/或细胞扩增进行调整。
可以使用任何标准细胞培养基，比如Dulbecco's改性Eagle's培养基(DMEM)，α-最低必需培养基(α-MEM)。然而，如实施例6所示，使用人血浆裂解物(HLP)产品在增殖能力方面显然是比使用FBS更有效的生长补充剂，而不损害基因组稳定性。HPL通常是浑浊的淡黄色液体，其在一次、两次、三次或更多次冷冻/解冻循环后从人血小板获得。这些循环导致血小板裂解，将其细胞内内容物(包括生长因子等)释放到周围介质中。一些HPL制剂包括凝血因子，在这种情况下，加入抗凝剂如肝素以防止凝血可能是有利的。其他HPL制剂可被加工以去除凝血因子或抑制凝血因子的作用。HPL制剂(其中一些是GMP级)可从例如CompassBiomedical,Inc.，Cook General BIotechnologyl，Macopharma SA，Cook Regentech，MillCreek，iBiologics和Trinova Biochem GmbH以产品系列PLUS、Stemulate、Human PlateletLysate、PLTMax、XcytePlus和CRUX RUFA培养基补充剂市售可得。优选地，用于ASC的培养基包含约1％至约20％，比如约2％至约15％，比如约3％至约12％，比如约5％至约10％，比如约5％、8％或10％的HPL。优选地，培养基在例如MEM中包含约2％至约15％的HPL。优选的HPL制剂是Stemulate，其不需要添加肝素(WO 2015031465A1)。
在细胞生长达到或接近达到其稳定期(如通过例如葡萄糖消耗和/或乳酸盐产生的停滞所确定)，通常通过将TrypLe Select装载到***中来收获ASC。然后可以洗涤收获的细胞并将其转移到离心管中，团块化并计数。
然后将第一次传代(“中间”)ASC冷冻保存，或者直接装入预涂覆的生物反应器进行第二轮(或第三轮，第四轮等)扩增。对于冷冻保存，将中间ASC以至少约1×106个细胞/mL的浓度混悬在冷冻保护剂中，比如至少约2×106个细胞/mL，至少约5×106个细胞/mL，至少约10×106个细胞/mL，至少约15×106个细胞/mL，至少约20×106个细胞/mL或至少约50×106个细胞/mL，比如1×106至50×106个细胞/mL，比如1×106个细胞至20×106个细胞/mL。
第二次(或更高次，例如第三次、第四次等)传代ASC可被冷冻保存。对于冷冻保存，将第二次(或更高次)传代ASC以至少约1×107个细胞/mL的浓度混悬于冷冻保护剂中，比如至少约1.5×107个细胞/mL，至少约2×107个细胞/mL，至少约2.5×107个细胞/mL，至少约3×107个细胞/mL，至少约5×107个细胞/mL或至少约10×107个细胞/mL，比如1×107至5×107个细胞/mL，比如2×107个细胞至3×107个细胞/mL。在一个实施方式中，将第二次(或更高次，如第三次、第四次等)传代ASC以约2×107个细胞/mL冷冻保护剂的浓度混悬在冷冻保护剂中，例如约2.2×107个细胞/mL冷冻保护剂。如本文所用，除非与上下文矛盾，否则2×107个细胞/mL包括或对应于1.6×107至2.4×107个细胞/mL，并且约2.2×107个细胞/mL包含或对应于2.0至2.4个细胞/mL。
该冷冻保护剂优选不含蛋白质，不含内毒素且无菌。尽管可以使用若干合适的冷冻保护剂，但是本发明的ASC组合物所考虑的冷冻保护剂的非限制性例子是(BioLife Solutions)，包括CryoStor CS2、CryoStor CS5和CryoStor CS10；以及ProFreeze(Lonza)。CryoStor冷冻培养基为无菌无血清、无蛋白质和无动物成分的，pH值7.5-7.7，内毒素水平低于1EU/mL。在一个实施方式中，冷冻保护剂是(CMS，Rockville，MD.)加上10％DMSO(WO2000/002572A1)。包含Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)、Na+、K+、Ca2+、Mg2+1Cl-、H2PO4 -、HEPES、乳糖醛酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖-40(即平均MW为40,000Da的葡聚糖)、腺苷和谷胱甘肽(WO2010/064054A1)。根据制造商，ProFreeze在使用时应该补充10％DMSO。WO2000/002572A1和WO2010/064054A1通过引用整体并入本文。
在本文使用DMSO的任何实施方式中，DMSO可以被平均分子量为35000-45000Da的葡聚糖(glucan，例如dextran)代替，比如葡聚糖-40。
在一个实施方式中，冷冻保护剂包含5％至15％的DMSO，如约5％、约6％、约8％、约10％、约12％或约15％的DMSO，以及Trolox、Na+、K+、Ca2+、Mg2+1Cl-、H2PO4 -、HEPES、乳糖醛酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖-40、腺苷和谷胱甘肽。优选地，该冷冻保护剂包含约10％的DMSO。
在一个实施方式中，所述冷冻保护剂包含1:10至约1:20的DMSO和含水溶液的混合物，该含水溶液包含：
(a)一种或多种选自以下的电解质：浓度范围为约35-45mM的钾离子，范围为约80-120mM的钠离子，范围为约2-10mM的镁离子和范围为约0.01-0.1mM的钙离子；
(b)大分子胶体渗透剂(oncotic agent)，其尺寸足够大以限制从循环体系中逃逸并有效保持与血浆相等的胶体渗透压并选自人血清白蛋白、多糖和胶体淀粉；
(c)在生理和低温条件下有效的生物pH缓冲液；
(d)营养有效量的至少一种单糖；
(e)不透性(impermeant)且羟基自由基清除有效量的甘露醇；
(f)不透性阴离子，不能透过细胞膜且有效抵消冷暴露期间的细胞肿胀，所述不透性离子为选自乳糖醛酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐和磷酸甘油中的至少一者；
(g)有效使ATP再生的底物，所述底物是选自腺苷、果糖、核糖和腺嘌呤中的至少一者；和
(h)谷胱甘肽。
在一个实施方式中，所述冷冻保护剂包含1:10至约1:20的DMSO和含水溶液的混合物，该含水溶液包含：
a)一种或多种电解质，其选自浓度范围为35-45mM的钾离子，范围为80-120mM的钠离子，范围为2-10mM的镁离子和范围为0.01-0.1mM的钙离子；
b)大分子胶体渗透剂，其尺寸足够大以限制从循环体系中逃逸并有效地保持与血浆相等的胶体渗透压，并选自人血清白蛋白、多糖和胶体淀粉；
c)在生理和低温条件下有效的生物pH缓冲液；
d)营养有效量的至少一种单糖；
e)不透性且羟基自由基清除有效量的甘露醇；
f)不透性阴离子，不能透过细胞膜并有效抵消冷暴露期间的细胞肿胀，所述不渗透离子是选自乳糖醛酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐和磷酸甘油中的至少一者；
g)有效使ATP再生的底物，所述底物是选自腺苷、果糖、核糖和腺嘌呤中的至少一者，和
h)至少一种调节凋亡诱导的细胞死亡的试剂。
然后将第一次、第二次(或更高次)传代的ASC在冷冻保护剂中的混悬液加入到冷冻小瓶中。对于第一次传代(中间)的ASC，各冷冻小瓶可含有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、或约20mL的ASC混悬液，相当于ASC的数量在5百万个细胞至2.5亿个细胞的范围内，例如约2千万、约3千万、约4千万、约5千万、约6千万、约8千万或约1亿个细胞。优选地，具有第一次传代ASC的冷冻小瓶在5mL中含有约5千万个细胞。
对于最终传代的ASC，即，第二次或更高次传代的ASC，每个冷冻小瓶可含有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、或约20mL的ASC混悬液，相当于ASC的数量在1千万至5亿个细胞的范围内，比如，例如，约4千万、约6千万、约8千万、约1亿、约1.1亿、约1.2亿、约1.6亿或约2亿个细胞。优选地，具有第二次传代ASC的冷冻小瓶在约5mL中含有约1亿至约1.2亿个细胞，例如约5mL中约1.1亿个细胞。在本发明的组合物中，除非与上下文矛盾，否则约1.1亿个细胞包含1亿至1.2亿个细胞。
冷冻可以有利地通过使用速率受控的冷冻机自动冷冻来进行。冷冻后小瓶可以在-70℃至-196℃范围内的温度下，例如在-150℃至-190℃范围内，如在-180℃-范围内的温度下转移并储存。已知用于在这种冷冻条件下冷冻和保持小瓶的各种装置，其中许多装置涉及液氮。例如，它们包括将小瓶浸入液氮中，将小瓶储存在液氮的气相中，以及将小瓶置于所谓的干燥储存中。在后一种类型的储存中，由于氮容纳在容器的壳中，所以小瓶不直接接触液相或气相氮，导致储存温度在-180℃-范围内。
在一个方面，针对小瓶建立了双层细胞存储***，其构成了包含来自第一次传代生物反应器扩增的中间ASC的工作细胞库和包含最终配制并包装的ASC组合物的产品细胞库。在细胞库中，第一次传代中间ASC典型地以约5千万个细胞/约5ml CryoStor10冷冻保存在冷冻小瓶中，直到装载以用于第二次生物反应器扩增。最终的ASC产品通常以约1.1亿个细胞/约5ml CryoStor10冷冻保存在冷冻小瓶中，直到使用前。本产品也可以被指定为“CSCC_ASC”。在一个实施方式中，细胞库包含在冷冻条件下储存的多个小瓶，每个小瓶包含约5mL的第二次传代ASC，其中细胞浓度为2×107个细胞/mL，例如1.6×107至2.4×107个细胞/mL，或约2.2×107个细胞/mL，例如2.0×107至2.4×107个细胞/mL。
ASC：
本发明的ASC的特征在于它们的多能性、标记物谱和/或ASC的功能特性，例如增殖能力、存活力、恢复和免疫抑制能力，即使在冷冻保存后。下面详述的这些ASC特征各自同样适用于根据本发明的方法获得的ASC。标记物谱可以例如通过使用针对各个标记物的荧光标记抗体的流式细胞术方便地确定，例如如实施例2、10、11或14中所述。
特别地，ASC的特征在于其在适当条件下沿着脂肪细胞、成软骨细胞和成骨细胞谱系分化的能力。如实施例4所示，根据实施例1中描述的制造方法制备的ASC在分化培养基中培养时分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。
ASC还可以或者可以根据它们的表型，即标记物谱加以表征，其表达与其他间充质基质/干细胞共有的标记物，包括CD90、CD73、CD105和CD44，并且保持较低或可忽略的CD45和CD31表达水平(Bourin等，2013)。
在一些实施方式中，基本上同质的ASC群体是其中干细胞群体的至少80％、比如至少85％、比如至少90％、比如至少95％、比如至少98％表达CD105、CD90、CD73、CD29和CD13，并且至多10％、比如至多5％、比如至多3％、比如至多2％表达CD45、CD34、HLA-DR、CD19和的群体。优选地，至少95％表达CD90、CD73和CD13并且至多5％表达CD45、CD34、HLA-DR、CD19和CD14。
在一些实施方式中，基本上同质的ASC群体是其中至少90％表达CD90、CD73、CD13、CD29和CD166；至多5％表达CD45、CD19、CD14和CD31；至多10％表达CD106；2至15％表达CD36；至少10％表达CD146；至少80％表达CD105并且至多40％表达CD34的群体。在一些实施方式中，至少95％表达CD90、CD73、CD13、CD29和CD166。另外，至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少98％可表达CD44。
在一些实施方式中，基本上同质的ASC群体是其中至少约80％，比如至少约85％表达CD105、CD90、CD73、CD13、CD29和CD166，比如至少约90％，比如至少约95％表达CD90、CD73、CD13、CD29和CD166；至多约15％，比如至多约10％表达CD45、CD19、CD14、CD106、CD31和CD36，比如至多约7％、比如至多约5％、比如至多约3％表达CD45、CD19、CD14、CD106和CD31；至少约2％，比如至少约5％、比如约1％至约20％、比如约2％至约15％或约5％至约15％表达CD36；至多约50％、比如至多约40％、比如至多约20％、比如至多约10％表达CD34；并且至少约10％、比如至少约12％表达CD146的群体。在一个实施方式中，至少95％表达CD90、CD73、CD13、CD29和CD166；至少85％表达CD105，至多2％表达CD45、HLA-DR、CD19、CD14和CD31；2％至15％表达CD36；且10％至60％表达CD146。在一个实施方式中，基本上同质的ASC群体是其中标记物的最小和最大表达百分比的范围是表20中所示的那些范围的群体。
当冷冻保存的第二次传代细胞解冻后即刻测定时，至少约80％、比如至少85％、比如至少90％、比如至少95％、比如至少98％的细胞是活的，如通过染料排斥所确定的(参见例如实施例3)。优选地，至少90％的细胞是活的。
至于增殖能力，当解冻后即刻进行培养时，ASC的特征在于当在组织培养瓶中培养48小时(例如，根据实施例3中的方法)时，群体倍增数(PD)为至少1，比如至少1.3，比如至少1.5，比如至少1.7，比如至少2。优选地，ASC具有至少1，比如至少1.5的PD。PD计算为Ln(N)/Ln2，其中N＝收获的细胞/接种的细胞。
如实施例所示，本发明的ASC的特征还在于其免疫抑制特性。例如，ASC的特征可以在于以下一项或多项或全部：抑制树突细胞(DC)的活化，抑制外周血单核细胞(PBMC)的增殖，指示免疫调节、特别是免疫抑制的细胞表面标记物，或响应于细胞因子如干扰素-γ的一种或多种细胞表面标记物的变化。
在一个实施方式中，与未与ASC混合的DC(即，阳性对照)相比，本发明的ASC通过将DC与ASC混合而抑制DC的活化，例如减少CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表达。在一个具体的实施方式中，使用实施例9的检定，其中接种ASC和DC得到约1:1的比例；用1μg/mL脂多糖(LPS)和20ng/mL干扰素-γ刺激DC并孵育24小时；并且CD40、CD80、CD86和HLA-DR各自的表达水平平均分别降低至阳性对照的至多80％、65％、70％和80％。
在一个实施方式中，本发明的ASC抑制PBMC的增殖，例如如在混合淋巴细胞反应(MLR)中测定的。这种类型的检定在本领域中是公知的，并且可以包括使用不具有ASC的PBMC作为阳性对照，将ASC与来自同种异体供体的经刺激的PBMC以不同比例(例如1:20至1:1)混合，并且在4天的共培养期后测量，在18-20小时孵育期间，将3H-胸苷(25μSi/ml)引入PBMC。使用这种类型的检定，与阳性对照相比，ASC与PBMC的1:20、1:10、1:5和1:1的比率可导致平均3H-胸苷引入分别为阳性对照的至多约80％、75％、55％和25％。
在一些实施方式中，ASC特征还可以或者可以在于指示免疫调节、特别是免疫抑制的特定标记物，例如CD10、CD140a、CD160、CD204、CD258、CD270、CD272、CD44、CD49a、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G、LTβR及其组合。不受理论限制，这些标记物与免疫信号传导、细胞-细胞和细胞-ECM粘附、归巢(homing)、模式识别、T细胞抑制、生长因子受体的上调和促炎蛋白的失活相关。
特别地，在一个实施方式中，基本上同质的ASC群体是其中至少约80％，例如至少约85％表达CD10、CD140b、CD160、CD204、CD272、CD44、CD49a、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G和/或LTβR以及任选的HLA-ABC，比如至少约90％，或者在一些情况下至少约95％或更多表达CD10、CD140b、CD160、CD204、CD272、CD44、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G和LTβR的群体。在一些实施方式中，ASC的特征还可以在于表达不多于约20％、例如不多于约15％、或在一些情况下不多于约10％的CD152、CD274和/或CD86；和/或任选地，至少约70％CD258，至少约55％CD270，至少约80％CD49a，至多约30％CXCR4和/或约5％至约35％CD200。在一些实施方式中，ASC群体还可以是其中至多约15％的ASC表达CD15、CD152、CD163、CD18、CD274、CD39、CD40、CD62L、CD80、CD86和任选的HLA-DR、-DQ、-DP的群体。
在一个实施方式中，基本上同质的ASC群体是其中至少90％表达CD10、CD140b、CD160、CD204、CD272、CD44、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G和LTβR；至少80％表达CD49a；至少60％表达CD258和CD270，且至少5％表达CD200；至多15％表达CD15、CD152、CD163、CD18、CD274、CD39、CD40、CD62L、CD80和CD86；并且至多30％表达CXCR4的群体。
在一个实施方式中，基本上同质的ASC群体是其中ASC群体的至少95％表达CD10、CD140b、CD160、CD204、CD272、CD44、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G和LTβR；至少85％表达CD49a，至少65％表达CD258和CD270，且群体的至少10％表达CD200，且群体的至多15％表达CD15、CD152、CD163、CD18、CD274、CD39、CD40、CD62L、CD80、CD86和HLA-DR、-DQ和-DP，并且至多25％表达CXCR4的群体。
在一个实施方式中，ASC的特征还在于小于20％、比如小于约15％、比如小于约10％的ASC表达CD274。任选地，ASC的特征还在于至少约90％、比如至少约95％、比如至少约98％的ASC表达CD54。在另一个具体的实施方式中，ASC特征在于实施例10中表15中的各个标记物，其群体百分比在表15中示出的最小值到最大值的范围内。
ASC特征还可以在于根据本文的一个实施方式的它们的基质/干细胞标记物的表达百分比和根据本文的一个实施方式的它们的免疫调节标记物的表达百分比。作为非限制性实例，基本上同质的ASC群体是如下群体：
-至少90％表达CD90、CD73、CD13、CD29和CD166；至多5％表达CD45、CD19、CD14和CD31；至多10％表达CD106；2至15％表达CD36；至少10％表达CD146；至少80％表达CD105并且至多40％表达CD34；且
-至少90％表达CD10、CD140b、CD160、CD204、CD272、CD44、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G和LTβR；至少80％表达CD49a；至少60％表达CD258和CD270，至少5％表达CD200；至多15％表达CD15、CD152、CD163、CD18、CD274、CD39、CD40、CD62L、CD80和CD86；并且至多30％表达CXCR4。
在进一步的实施方式中，本发明的ASC特征还在于或者在于响应于促炎细胞因子如干扰素-γ的一种或多种细胞表面标记物的变化。这可以有利地根据实施例11的检定来测试，典型地测量表16和17中的一个或多个ASC标记物的变化，当在50ng/ml IFN-γ存在下培养3天时，与对照比如来自未用IFN-γ刺激的相同ASC的细胞相比，显示出：
-在至少5％的ASC群体中表达标记物的ASC群体的百分比的正向或负向变化，或
-在表达标记物的部分细胞上的标记物表达水平的至少0.5倍的正向或负向变化。
例如，在一些实施方式中，一旦经INF-γ刺激，表达CD200、CD270、CD9、CXCR4的ASC群体的百分比降低；表达CD274和CD49a的ASC群体的百分比增加，并且CD54阳性细胞上的CD54表达水平增加。
在一些实施方式中，改变是以下的一个或多个或全部：
-表达CD274、CD106和/或CD49a的ASC群体的百分比增加至少5％，比如CD274的百分比增加至少40％，比如至少60％；
-表达CD200、CD270、CD9和/或CXCR4的ASC群体的百分比降低至少5％，比如表达的ASC群体的百分比降低至少10％；
-在标记物阳性细胞上增加CD10、CD54、HLA-ABC和/或HLA-DR/DQ/DP的表达水平，例如在表达CD54的细胞上CD54的表达水平增加至少20倍，比如至少35倍，比如至少30倍；和/或
-LTβR的表达水平降低例如至少2倍。
在一个具体的实施方式中，至多约30％、比如至多约20％、比如至多约15％、比如至多约10％的ASC群体表达CD274，而一旦经干扰素-γ刺激，例如将ASC分别在存在和不存在50ng/ml的IFN-γr的情况下培养3天时，至少70％、比如至少约80％、比如至少约85％、比如至少约90％、比如至少约95％的ASC群体表达CD274。
还值得注意的是标记物CD54(ICAM-1)的MFI从3增加到97，其说明了用于稳定ASC-白细胞相互作用和信号转导所需的细胞间粘附分子的动员。ICAM-1是LFA-1(整联蛋白)的配体，LFA-1(整联蛋白)是白细胞上发现的受体。因此，在一个实施方式中，至少95％的ASC群体表达CD54并且一旦经干扰素-γ刺激，表达CD54的细胞上的CD54表达水平增加至少20倍，比如至少30倍。
在具体的实施方式中，一旦经干扰素-γ刺激，表达CD274的ASC群体的百分比增加到至少80％，且CD54阳性细胞上的CD54表达水平增加至少25倍。
组合物：
本发明还提供了本文各方面和实施方式中详述的各ASC群体的组合物，所述ASC群体包括前述“ASC”部分中的那些和通过“方法”部分中的各个方法获得的那些。每个这样的ASC群体也以本发明的组合物的形式提供。
具体而言，已经发现ASC，特别是根据本发明的方法获得的ASC可以在无蛋白质的冷冻保护剂中以高浓度冷冻保存；至少约1×107个细胞/mL，而不损害存活力、增殖能力、免疫抑制特性或恢复。还发现基于CryoStor的冷冻保护剂可提供比基于人血清白蛋白(HSA)的冷冻保护剂更高的增殖能力。
特别地，本发明的组合物可包含基本上同质的成人干细胞群体(从自供体收集的脂肪组织中分离)在无蛋白质的冷冻保护剂中的混悬液，其中细胞浓度对于每mL添加的冷冻保护剂为至少1×107个细胞，比如至少1.5×107个细胞，比如至少2×107个细胞，比如至少3×107个细胞，比如至少5×107个细胞。优选地，细胞浓度对于每mL添加的冷冻保护剂为至少2×107个细胞，比如约2.2×107个细胞。
如上所述，无蛋白质的冷冻保护剂通常包含约5％至约15％的DMSO和Trolox、Na+、K+、Ca2+、Mg2+1Cl-、H2PO4 -、HEPES、乳糖醛酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖-40、腺苷和谷胱甘肽。优选地，该冷冻保护剂包含约10％的DMSO。也可以使用本领域已知的其他无蛋白质的冷冻保护剂。那些已经在“方法”部分中描述的冷冻保护剂是特别考虑的。
还提供了当使冷冻的ASC组合物解冻时获得的组合物。冷冻的ASC组合物可以例如在37℃水浴中解冻或在手术室中在室温下解冻/储存。优选的是如下组合物，其中在解冻后即刻：
(a)至少85％的ASC群体是活细胞，并且在室温下储存2小时后的存活力为至少80％；
(b)当培养48小时时，ASC群体具有提供至少为1的PD的增殖能力；
(c)ASC群体能够抑制树突细胞成熟和活化；
(d)解冻后恢复超过95％，并且解冻后在室温下储存2小时后的细胞恢复为至少85％；
(e)ASC群体具有体外细胞粘附性，使得培养5小时后细胞总数的至少60％、比如至少65％、比如至少70％是粘附的。
还优选如下组合物，其中在解冻后在室温下储存2小时后，
(a)至少80％的干细胞群体是活细胞；
(b)当培养48小时时，干细胞群体具有至少1的PD；
(c)干细胞群体能够抑制树突细胞成熟和活化；
(d)恢复为至少85％，并且
(e)ASC群体具有体外细胞粘附性，使得培养5小时后细胞总数的至少60％、比如至少70％是粘附的。
本发明还提供了药物组合物。本发明的组合物是无菌的并且不含内毒素和支原体，内毒素水平通常用提供10IE/ml的最小检测水平的分析方法测定。由于本发明的组合物随时可供临床使用，因此药物组合物通常仅包含ASC和无蛋白质的冷冻保护剂。然而，也可以考虑其他组分。具体而言，药物组合物还可以包含含有天然或合成生物聚合物如细胞外基质蛋白、-肽或-糖胺聚糖和/或藻酸盐的可溶性生物材料或水凝胶。例如，药物组合物可以包含与D-葡萄糖酸和半钙盐部分钙交联的无菌和不含内毒素的藻酸盐(藻酸钠VLVG，Novamatrix，FMC Biopolymers，Norway)(Follin等，2015)。在一个实施方式中，在最终冷冻保存步骤之前，将藻酸盐与ASC和冷冻保护剂混合至最终浓度为1％(w/v)的部分交联的藻酸盐。在另一个实施方式中，将部分交联的藻酸盐在室温下储存并与最终产品混合至最终浓度为1％(w/v)藻酸盐，例如通过将ASC制剂注入藻酸盐容器，之后将最终混悬液吸出并与注射导管连接。
还提供了注射器或用于注射或输注含有ASC组合物的ASC组合物的其他装置。典型地，用酒精棉片(82％乙醇和0.5％氯己定，Mediq，Denmark)对装有ASC组合物的安瓿进行灭菌，并且用针头将细胞混悬液吸至无菌注射器。然后将注射器连接至注射导管，例如注射用MYOSTAR注射导管(Biological Delivery System，Cordis，Johnson&Johnson，USA)。建议在解冻3小时内注射。优选地，注射器或用于注射或输注的其它装置包含约5mL的组合物，其包含约1亿至约1.2亿个细胞，比如约1.1亿个ASC。
治疗用途：
在一个实施方式中，提供了用作药物例如用于组织再生、免疫抑制和/或作为抗炎药的ASC组合物。
实际上，本发明提供了本发明的ASC和ASC组合物的各种治疗用途，其是“现成的”并且随时可供临床使用。由于它们的ASC浓度高，通常对于每mL冷冻保护剂为至少1×107个细胞，优选至少2×107个细胞，比如约2.2×107个细胞，所以该组合物可用于其中需要较小的注射体积的应用，以及其中高浓度组合物在给药之前稀释以及例如通过输注给药的应用。而且，来自若干不同供体的ASC可以储存在细胞库中，允许重复和/或更多方面的治疗选择。
不受理论限制，给药后，ASC通过旁分泌机制刺激和改善再生，该旁分泌机制释放促进天然内源性修复机制的胞外物质，天然内源性修复机制包括基质重塑、血管再生和免疫调节。ASC免疫调节的另一个固有部分是主动免疫抑制，其预防免疫原性从而预防对同种异体ASC移植物的排斥。这可能是先天性ASC特征，其将这些细胞与其他体细胞区分开来。
因此，在一个实施方式中，提供了用于组织再生的同种异体治疗产品，例如用于治疗或预防缺血性组织病症或其他组织功能障碍或破坏病症。缺血性组织病症的非限制性例子包括缺血性心脏病(有和没有心力衰竭)、急性心肌梗死、缺血性脑卒中、严重肢体缺血、缺血性伤口和缺血性再灌注损伤/原发性器官移植物功能障碍。组织功能障碍或破坏病症的非限制性例子包括椎间盘修复、非缺血性扩张型心肌病和关节软骨病症。在一些实施方式中，将在至多约5mL根据本发明的组合物中的约5×107至约5×108个细胞直接施用于缺血组织。在一个具体的实施方式中，将在至多约5mL的根据本发明的组合物中的约5×107至约5×108个细胞通过心肌内注射施用于具有降低的左心室射血分数(EF)和心力衰竭的患者。例如，在5mL冷冻保护剂中包含约1.1亿个细胞的CSCC_ASC产品可被解冻并在至多1、至多2或至多3小时内通过直接心肌内注射施用在具有降低的左心室EF和心力衰竭的患者中。在另一个具体实施方式中，将在至多约1至约5mL的根据本发明的组合物中约5×107至约5×108个细胞通过直接注射施用至患者(例如患有关节软骨病症)的关节。
在一个实施方式中，提供了用作免疫抑制剂的同种异体治疗产品，例如用于治疗或预防自身免疫性疾病或病症或移植排斥。自身免疫性疾病和病症的非限制性例子包括克罗恩病、多发性硬化症、I型糖尿病、肾病、风湿性关节炎和移植器官排斥反应，包括但不限于骨髓、心脏、肺和肾移植。在一个具体的实施方式中，在本发明组合物的约200ml的无菌输注液体中的约10×106至约0.5×106个细胞/mL可以通过静脉内或动脉内注射或通过输注给患者施用，例如，患有克罗恩病的患者。
在一个实施方式中，提供了用于治疗或预防炎症的同种异体治疗产品，即作为抗炎药。炎症性病症的非限制性例子包括2型糖尿病、肾病、非缺血性扩张型心肌病、肺动脉高血压和败血症。在一个具体的实施方式中，在本发明组合物的约200ml的无菌输注液体中的约10×106至约0.5×106个细胞/mL可以通过静脉内或动脉内注射或通过输注给患者施用，例如，患有肺动脉高血压的患者。
例如，可将CSCC_ASC产品解冻，任选地在5至约200ml无菌输注液体中稀释至浓度为约10×106至约0.5×106个细胞/mL，例如1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万或1千万个细胞/mL；并且在至多1小时、至多2小时或至多3小时内通过注射或输注施用给患有自身免疫性或炎症性病症或移植排斥反应的患者或处于其风险中的患者。或者，可以将CSCC_ASC产品解冻并在无菌液体中稀释至浓度为约1千2百万、1千3百万、1千4百万、1千5百万、1千6百万、1千7百万、1千8百万、1千9百万或2千万个细胞/mL，并通过静脉内或动脉内注射或输注施用，或直接施用至患病组织。
在一些实施方式中，根据本发明的多种ASC制剂可以通过例如以下而提供个性化治疗：允许在治疗之前进行供体和受体之间的组织匹配，允许对受体的数次治疗，以及在受体需要数次治疗的情况下可以将ASC从一名供体转换至另一名供体。后者特别适用于受体已经自先前施用的ASC制剂发展出针对ASC的同种异体抗体应答，在这种情况下，可能无法继续使用来自相同供体的ASC。具体而言，具有来自多个供体的ASC的细胞库允许受体-供体组织匹配，这可以提高临床效力。
通过以下实施例来说明本发明，这些实施例不是限制性的。
实施例1
ASC产品的制备
使用了以下步骤：
基质血管部分的分离：
从健康供体获得脂肪抽吸物。供体资格根据供体访谈、调查问卷和对传染病标记物HIV、乙型肝炎和丙型肝炎、梅毒和HTLV的测试而确定。在局部麻醉下进行皮下腹部脂肪抽吸术，从每个供体提供约100ml至300ml的脂肪抽吸物。局部麻醉置于腹部皮肤中，2-4个位置用于随后的脂肪抽吸术***。通过这些孔将输注插管(细针)引入，同时注射含有比如麻醉剂和使脂肪组织松弛的试剂(比如乳酸盐缓冲液、碳酸氢钠、肾上腺素和利多卡因)的液体。使用Bodyjet EVO(水辅助抽脂)(Human med，Germany)。脂肪抽吸物通过Bodyjet抽吸插管移出并移入无菌收集室。用无菌注射器将脂肪抽吸物转移到无菌烧瓶/瓶中。
在生物反应器中培养扩增之前，通过脂肪组织的酶促消化从脂肪抽吸物中分离基质血管部分。将脂肪抽吸物用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次以除去残余血液。通过与溶于稀释至2mM Ca2+浓度的HBSS(+CaCl2+MgCl2)(Gibco，Life Technologies)的0.6PZU/ml胶原酶NB6(Serva GmbH，Germany)在37℃下在持续旋转下孵育45分钟来消化脂肪组织。胶原酶用含有5％人血小板裂解物和1％青霉素/链霉素的培养基中和，并通过100μm过滤器(Steriflip，Millipore)过滤。将剩余的细胞在室温下以1200g离心10分钟，重悬并使用NC-100TM根据制造商的说明计数。
第一次传代扩增：
将大约1亿个SVF细胞装载到生物反应器(Quantum Cell Expansion System，Terumo，Belgium)中以扩增ASC。Quantum生物反应器是一个功能上封闭的***，由封装在独立的孵育器中的一次性中空纤维生物反应器组成。它通过具有用于介质和试剂或细胞的入口的两个循环回路供料。废料被移入废料袋。
整个过程是计算机化的并通过触摸屏界面进行控制，使得可以控制介质灌注速率、收获时间、介质洗出以及与ASC生长相关的其他任务。除了用冷沉淀填充入口袋，加入用于分离细胞的酶，或将收获的细胞从收集袋转移到细胞入口袋(所有这些都在装载到生物反应器上之前完成)之外，所有与生物反应器相关的程序由0.2-mm无菌屏障过滤器关闭或保护。
在将SVF装载到生物反应器之前4至24小时，***用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行预备，随后装入约30ml冷沉淀(Blood Bank，Rigshospitalet，Denmark)用于涂覆生物反应器。冷沉淀原样使用或用PBS以例如1:3或1:4稀释至比如总共100ml。在装载细胞之前，将PBS和冷沉淀从***中洗出并用完全培养基(不含核糖核苷和脱氧核糖核苷的最低必需培养基，MEM Alpha(αMEM)(Gibco，Life Technologies)，1％青霉素/链霉素(Gibco，LifeTechnologies)，5％人血小板裂解物(Stemulate，Cook General Biotechnology))替换。向***提供作为20％O2、5％CO2、余量为N2的预混合供应的气体(Denmark)。
将100ml完全培养基中稀释的1亿SVF用60ml注射器转移至细胞入口袋并装载到Quantum生物反应器中。使细胞粘附24小时，然后激活介质连续进料。介质进料速率从0.1mL/min开始。基于葡萄糖和乳酸盐测量，调整进料速率并识别细胞的扩增。通过从Quantum生物反应器样品口取出样品并在血气分析仪ABL 835FLEX(Radiometer，Denmark)上进行测量来监测葡萄糖和乳酸盐水平。装载细胞约9天后，通过将Select(Gibco，Life Technologies)装载到***中而收获ASC。收获过程包括用PBS冲洗***，添加180mL Select，以及孵育20分钟。将收获的细胞冲洗至细胞收集袋中。将收集袋中的细胞转移至层流气流中的离心管中，洗涤，团块化，并用NucleoCounter计数和测试存活力。
将第一次传代中间ASC团块化并以每mL 1千万个细胞的浓度重悬于CryoStor10(BioLifeSolutions)中。将该溶液等分入CellSeal冷冻小瓶(Cook GeneralBiotechnology)中，每小瓶总体积为5ml。
然后将冷冻小瓶在速率受控的冷冻机(Kryo 560-16，Planer)中冷冻至获得-80℃，并在干冰上转移至液氮干燥储存等温液氮冷冻机(V1500-AB，CBS)中，其提供-180℃-范围内的均匀温度，样品储存空间内无液氮。该***将交叉污染的风险降至最低。
冷冻储存的第一次传代中间产物构成工作细胞库并储存直至用于第二次生物反应器扩增的装载。
第二次传代扩增
在将第一次传代中间ASC装载用于第二次传代扩增之前4至24小时，对新的生物反应器进行预处理和涂覆，如第一次传代扩增所述。对***装载完全培养基，并向***提供作为20％O2、5％CO2、余量为N2的预混合供应的气体。将容纳有5千万个第一次传代的ASC的CellSeal小瓶从氮气罐取出。将该安瓿细胞转移至“拉链袋”并在37℃水浴中解冻。小瓶底部的密封被移除并用酒精消毒。从通气孔切下一块管子，以避免对细胞太多的压力。用10ml注射器和16G针头抽取预定量的细胞(例如，安瓿的四分之一、安瓿的一半或整个安瓿)，并转移到10ml离心管中。用NucleoCounter对细胞进行计数和测定存活力。细胞用100ml完全培养基稀释并使用60ml注射器转移到细胞入口。按照第一次扩增所述进行扩增和收获。
第二次传代扩增约7天后，收获ASC，将细胞团块化并以约2千2百万个细胞/ml的浓度重悬于CryoStor10中，典型地在约2千万至约2千4百万个细胞/mL的范围内。将该溶液等分入CellSeal冷冻小瓶中，每小瓶总体积为5ml，每小瓶保持约1.1亿个细胞，典型地在每小瓶约1亿至约1.2亿个细胞的范围内。
然后将冷冻小瓶在速率受控的冷冻机中冷冻至获得-80℃，并在干冰上转移至液氮干燥储存容器，该容器提供-180℃-范围内的均匀温度，其中在样品存储空间中没有液氮。冷冻储存的第二次传代ASC构成研究性医药产品CSCC_ASC并储存在产品细胞库中直到装运用于临床使用。
该产品随时可供使用，只需要在床边进行最少的处理。将冷冻小瓶在手术室内/附近在37℃水浴中解冻。将小瓶灭菌(通常用酒精棉片)，并用针头将细胞混悬液吸入无菌注射器。然后将注射器连接到注射导管并施用于患者。
实施例2
ASC产品的表征-细胞表面标记物
使用免疫分型来识别细胞质量，并且在根据实施例1制备的ASC产品的冷冻保存之前和之后对第一次传代中间产物和第二次传代终产物进行免疫分型。
将收获的细胞洗涤、过滤并分配到含或不含抗体的管中。将细胞在室温下与表1中所示的抗体孵育30分钟。孵育后，将细胞洗涤、离心并重悬于PBS中以使用六色方案进行流式细胞术。
根据欧洲药典，流式细胞术是识别细胞表面标记物的合适方法。将针对ISCT/IFATS(International Federation for Adipose Therapeutics and Science and theInternational Society for Cellular Therapy)推荐用于识别ASC的表面标记物的荧光标记抗体添加至ASC，并使用流式细胞仪测量细胞相关荧光。对于给定产品的表征，使用用荧光团藻红蛋白、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白-德克萨斯红、藻红蛋白-花色素苷和别藻蓝蛋白标记细胞的补偿性六色方案。存活力由SYTOX蓝染色确定。该方案是借助手动补偿、同型控制(isotypic control)和荧光扣除对照(Fluorescence Minus One)控制开发的。从最终分析中排除死细胞和双粘体(doublet)。使用符合GMP的Navios(Beckman Coulter，Germany)收集和分析数据，并使用Navios软件和Kaluza(Beckman Coulter，Germany)分析数据。
表1
来自5个不同供体的第一次传代中间ASC上的表面标记物
表2
来自3个不同供体的第二次传代最终ASC上在冷冻保存之前的表面标记物
表3
来自3个不同供体的第二次传代最终ASC上在冷冻保存之后直接的表面标记物
实施例3
ASC产品的表征-细胞存活力
最终产品的产品质量和效果受到ASC存活力的影响。因此在整个制造过程中存活力是重要的。
在实施例1的制备过程中多次测定存活力；在装载到生物反应器中进行第一次扩增之前测定SVF的存活力；第一次传代扩增的ASC的存活力在收获后以及在解冻并装载到第二次传代后测定；最终产品的存活力在收获后以及在冷冻保存和解冻后测定。使用NC-100TM测定百分比存活力。NucleoCounter是基于检测来自DNA结合荧光染料碘化丙啶(PI)的荧光的图像式细胞计数器。
表4
在制备过程中SVF和ASC的存活力
实施例4
分化检定
使用StemPro分化试剂盒(Gibco，Life Technology)根据制造商的方案，测定在Quantum生物反应器中借助Stemulate作为生长补充剂进行扩增的第二次传代ASC的成骨、成脂和软骨形成分化能力。
对于成骨分化，12孔板中的10,000个ASC/孔在成骨诱导培养基(StemPro骨细胞/软骨细胞分化基础培养基，StemPro成骨补充剂，青霉素/链霉素)中进行孵育。对于成脂分化，12孔板中的20,000个ASC/孔在成脂诱导培养基(StemPro脂肪细胞分化基础培养基，StemPro脂肪细胞补充剂，青霉素/链霉素)中进行孵育。对于软骨形成分化，多个80,000个ASC的5μl液滴在软骨形成诱导培养基(StemPro骨细胞/软骨细胞分化基础培养基，StemPro软骨形成补充剂，青霉素/链霉素)中进行孵育。使细胞诱导21天，每3-4天更换一次培养基。将对照细胞与不具有补充剂的完全培养基一起孵育直至汇合。
成骨分化在用茜素红S染色(Sigma-Aldrich)细胞显示钙沉积物时得到证明。成脂分化通过用油红O(Sigma-Aldrich)染色的脂滴的形态学外观得到证明。软骨形成分化在细胞被阿尔新蓝8GX(Sigma-Aldrich)染色时得到证明。在完全培养基中保持的对照细胞都是阴性的。
实施例5
冷冻保护剂配方的比较
在床边解冻时，最终冷冻保存产品中ASC的存活力和功能对于产品功效至关重要。使用不同的冷冻保护剂配方确定冷冻保存的ASC的存活力和功能。
如实施例1所述制造第一次传代中间ASC和第二次传代最终ASC产品。将中间ASC以冷冻小瓶中50×106个细胞/5mL冷冻在不同的冷冻保护剂配方中。
将第二次传代的最终ASC以冷冻小瓶中100×106个细胞/5mL冷冻在不同的冷冻配方中。将细胞在自动冷冻机中冷冻至-80℃，在液氮干燥储存中储存并在37℃水浴中解冻；在解冻后即刻以及在解冻后在室温下在冷冻配方中保持3小时后，测定存活力和恢复。
在解冻后即刻以及在解冻后在室温下在冷冻配方中保持3小时后，洗涤最终的ASC细胞产品并将其进行培养以识别通过体外形态学、粘附和增殖测定的细胞功能。使用20ml完全培养基，37℃，5％CO2以每个T75烧瓶1x106个细胞建立培养。
用Nucleocounter测定存活力和恢复。细胞培养24小时后，通过显微镜检确定形态学和粘附。在培养48小时后通过分离细胞并用Nucleocounter计数细胞来确定增殖。
测试在等渗盐水中含有5％或10％HPL或人白蛋白(HA)和DMSO的冷冻配方，CryoStor10和CryoStor5。
表5
在不同的冷冻配方中的中间第一次传代ASC(50×106个细胞/5ml)解冻后即刻的恢复和存活力
表6
在不同的冷冻配方中的第二次传代的最终ASC(100×106个细胞/5ml)解冻后即刻的恢复和存活力
表7
第二次传代ASC最终产品细胞(100×106ASC/5ml)的存活力和恢复。冷冻保存在CryoStor10中的三个不同的供体。在解冻后即刻(0h)以及在解冻后并在室温下在冷冻保护剂配方中储存1、2和3小时后测量存活力和恢复。
| ％存活力 | 0小时 | 1小时 | 2小时 | 3小时 | ％恢复 | 0小时 | 1小时 | 2小时 | 3小时 |
| 供体1 | 91％ | 82％ | D1 | 108％ | 95％ | ||||
| 供体2 | 88％ | 84％ | 82％ | 82％ | D2 | 100％ | 90％ | 85％ | 92％ |
| 供体3 | 90％ | 87％ | 85％ | 83％ | D3 | 99％ | 106％ | 105％ | 113％ |
| 平均值 | 90％ | 86％ | 84％ | 82％ | 平均值 | 102％ | 98％ | 95％ | 100％ |
细胞的功能和效能是临床功效的最佳预测因子。利用目前可用的体外方法，形态学、粘附和增殖是细胞功能的最佳总体指标。显微镜检查显示细胞功能(形态学、粘附和增殖)优于CryoStor10中配制的细胞。
表8
在不同的冷冻保护剂配方中冷冻的中间第一次传代ASC的增殖。将1×106个细胞在解冻后即刻进行培养，并在48小时后测定增殖(n＝3)。
| 50x 106 | 10％HA | 5％HA | CryoStor10 |
| 细胞数目 | 4,94x 105 | 6,49x 105 | 1,61x 106 |
表9
在不同冷冻配方中冷冻的第二次传代最终ASC的增殖。将1×106个细胞在解冻后即刻进行培养，并在48小时后测定增殖(n＝1)。
| 100x 106 | 10％HA | 5％HA | CryoStor10 |
| 细胞数目0小时 | 1,17x 106 | 7,96x 105 | 1,73x 106 |
| 细胞数目3小时 | 3,65x 105 | 2,11x 105 | 7,05x 105 |
表10
第二次传代ASC最终产品细胞的增殖(100×106个ASC/5ml)。冷冻保存在CryoStor10中的来自三个不同供体的ASC。在解冻后即刻(0h)和在解冻后并且在室温下在冷冻配方中储存1小时、2小时和3小时后将细胞进行培养而测量增殖。将1×106个ASC铺在T75烧瓶中并在48小时后计数。
| 0小时 | 1小时 | 2小时 | 3小时 | |
| 供体1 | 1,73x 106 | 7,05x 105 | ||
| 供体2 | 2,72x 106 | 2,15x 106 | 1,92x 106 | 1,49x 106 |
| 供体3 | 3,59x 106 | 2,14x 106 | 2,08x 106 | 1,89x 106 |
| 平均值 | 2,68x 106 | 2,15x 106 | 2,00x 106 | 1,36x 106 |
实施例6
生长补充剂的比较
从三名健康女性供体(年龄32-47岁，平均年龄40岁)获得的脂肪抽吸物中分离SVF，如实施例1中所述。将SVF在含有5％hPL或10％FBS的四种不同的符合GMP的培养基中培养。表征ASC P0、P1和P5并将其用于分析。
在含有最低必需培养基MEMα(αMEM)、1％青霉素/链霉素并且具有四种不同的生长补充剂的完全培养基中，接种4.5×106SVF/T75-烧瓶来建立ASC原代细胞培养物：
1.5％人血小板裂解物(PLTMax,Mill Creek Life Sciences)，10IU肝素
2.5％人血小板裂解物(Stemulate,hPL-S,COOK General Biotechnology)，10IU肝素
3.5％人血小板裂解物(Stemulate,hPL-SP,COOK General Biotechnology)
4.10％胎牛血清(FBS,Gibco,Life Technologies)。
HPL由血浆与血纤蛋白原和其他凝血因子组成，因此必须添加肝素以防止凝胶化。COOK General Biotechnology制造两种不同版本的StemulateTM混合人血小板裂解物，需要肝素的PL-S和不需要肝素的PL-SP(其中一些凝血因子已被去除并且不需要添加肝素)。
将细胞在标准条件下于37℃在具有5％CO2的潮湿空气中孵育。2天后更换ASC的培养基丢弃未粘附细胞，随后每3-4天更换一次。当培养物达到约90％的汇合水平时，将细胞用PBS洗涤，分离并传代以用于实验计划。在第1天、第2天、第3天、第5天和第7天通过在Bürker-Türk室内手动计数确定增殖。群体倍增数(PD)计算为PD＝ln(N/N0)/ln2，其中N是第7天收获的细胞数量，N0是接种的细胞数量。使用StemPro分化试剂盒测定ASC的成骨、成脂和软骨形成分化能力。如实施例2所述确定免疫分型。通过比较基因组杂交确定基因组稳定性。
表11
在具有不同的生长补充剂的介质中的ASC增殖
如表11所示，使用任何HPL产品在增殖能力方面显然是比使用FBS更有效的生长补充剂。
在第一次传代中用所有测试的生长补充剂培养的ASC证实具有相当的和ASC特征性的免疫表型谱并保持其三系分化能力。通过比较基因组杂交(CGH)识别的基因组稳定性显示体外扩增的ASC在PLTMax、Stemulate和FBS存在下培养至第5次传代时未显示任何不平衡的染色体重排。因此，在PLTMax或Stemulate中培养的ASC更高的增殖能力不会影响基因组稳定性。
实施例7
在生物反应器中手动和自动扩增的比较
从腹部脂肪中分离SVF，将其混悬于补充有青霉素/链霉素和含血清生长补充剂的基础培养基中，并接种于T75烧瓶或已用冷沉淀涂覆的Quantum生物反应器中。从SVF传代的ASC的培养通过三种方法进行：烧瓶至烧瓶；烧瓶至生物反应器；和生物反应器至生物反应器。在所有情况下，除了通过流式细胞术确定的细胞计数、存活力和免疫表型的评估之外，还通过测试不育性、支原体和内毒素来进行质量控制。
通过接种4.5x106个SVF细胞/T75-烧瓶在标准条件于37℃、5％CO2下进行孵育来建立初级烧瓶培养。3天后更换培养基移除未粘附细胞。随后，在培养的剩余期间每3-4天更换培养基。达到90％的汇合水平时收获细胞。细胞以3.5×105个细胞/T75-烧瓶重新接种。第0代(P0)和第1代(P1)的ASC的存活力和产量用NC-100TM测定并计算为三个T75***平均值。
对于Quantum生物反应器中SVF的初次扩增，如实施例1中所述对***进行预处理并用冷沉淀进行涂覆。装载来自SVF的100×106个细胞并使其附着24小时，然后以0.1mL/min自动启动进料。培养3天后，进行冲洗任务以除去未粘附细胞。对于预培养的ASC(即由初次扩增产生的那些)的第二次传代扩增，用30×106个ASC接种Quantum生物反应器。在Quantum生物反应器中进行的SVF和ASC扩增使用与用于烧瓶培养相同的介质和试剂。
表12
在手动烧瓶培养和自动生物反应器扩增中的SVF和ASC产量的比较
无论在烧瓶还是生物反应器中培养，ASC P0和P1的存活力都高于96％。在所有条件下扩增的ASC被证明具有相当的和ASC特征性的免疫表型谱。不育性、支原体和内毒素检查持续为阴性。
然而，装载到生物反应器中的平均55×106个SVF细胞产生89×106个ASC P0(ASC数目相对于接种的SVF细胞数目为1.6倍)，而每个T75烧瓶接种的4.5×106个SVF产生平均1.75×106个ASC(ASC数目相对于接种的SVF细胞数目为0.4倍)。无论P0在烧瓶中还是在Quantum生物反应器中培养，在Quantum生物反应器中扩增的ASC P1表现出约2.1的群体倍增数(PD)，而在烧瓶中的ASC P1仅达到1.0的PD。
结论是，生物反应器中ASC的制备相对于T形烧瓶中的手动处理显著增强了ASC的扩增率和产量，同时保持了安全稳健的细胞产生所必需的纯度和质量。
实施例8
在Quantum生物反应器中的生长补充剂的比较
比较了在Quantum生物反应器中使用HPL(Stemulate，hPL-SP，无肝素，COOKGeneral Biotechnology)和胎牛血清(FBS)(Gibco，Life Technology)作为生长补充剂用于扩增ASC。
从三个供体的脂肪吸抽吸术，根据实施例1进行SVF从腹部脂肪中的分离和第一次传代扩增。从这些传代中，将30×106个ASC重新装载到新的Quantum生物反应器以用于第二次扩增。在所有传代中代谢监测(葡萄糖和乳酸盐)指导进料速率和收获时间。测定ASC的存活力、不育性、纯度、分化能力和基因组稳定性。进行微生物质量控制、流式细胞术、三重分化和如通过比较基因组杂交阵列检定确定的基因组稳定性。
该两次传代工序的每次传代都证明HPL支持ASC增殖的程度比FBS更大。作为3个供体的平均，在HPL-介质中培养SVF 9(7-11)天平均产生546×106个ASC。在FBS培养基中培养SVF还需要8天以产生111×106个ASC。与在FBS-培养基中的100×106个细胞(PD：2.2)相比，第二次传代ASC在hPL-培养基中6天后平均产生800×106个细胞(PD 5.2)。在两种培养基类型中，ASC均符合ISCT标准(免疫表型和三重分化)。比较基因组杂交证实了基因组稳定性。不育性、支原体和内毒素测试均为阴性。
与使用Quantum生物反应器和FBS相比，Quantum生物反应器和hPL的结合使用收回了5倍以上的第一次传代ASC和8倍以上的第二次传代ASC。
实施例9
最终ASC产品的免疫抑制活性
在任何来源的组织损伤(缺血性的、创伤性的或自身免疫性的)中，表现为炎症细胞的迅速出现，在成功的再生过程中缓慢减少，但在慢性缺血/创伤性伤口愈合和自身免疫反应期间持续存在。这种浸润由单核细胞/巨噬细胞随后淋巴细胞的初始积聚组成。由于ASC产品对特别是单核细胞/巨噬细胞群体施加的这种免疫抑制预期会改变平衡而有利于再生。ASC免疫抑制活性对于同种异体移植物的存活及因此的多种再生机制也是必要的。
由于免疫抑制是同种异体用途和功效感兴趣的固有ASC特征，因此使用了处理天然免疫和细胞免疫的体外细胞模型，例如人树状细胞检定和人混合淋巴细胞反应来检查免疫抑制活性。
根据Jensen和Gad(2010)的方法建立与ASC和来自循环单核细胞的树突细胞(DC)的共培养。通过Ficoll-Paque梯度(GE Healthcare)离心并分离细胞界面，从50岁以下的健康供体的血沉棕黄层(buffy coat)中分离外周血单核细胞。细胞在含有1％青霉素/链霉素的RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute)培养基(Sigma)中洗涤，使用MACS分离柱和磁珠(CD14MACS微珠，人，Miltenyi Biotec)通过正选分离CD14+单核细胞。在使用细胞混悬液之前和之后，用脱气的PBSE缓冲液(PBS，0.5mol/L EDTA，2％FBS)洗涤柱子。在含有1％青霉素/链霉素、2％人AB血清、人重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(20ng/mL)和人白细胞介素(IL)-4(20ng/mL；PeproTech)的RPMI 1640培养基中以2×106细胞/mL的密度将CD14+单核细胞接种于6孔板中。培养基每2-3天更换一次。分化6天后，收获细胞，并准备DC:ASC共培养。解冻细胞产品CSCC_ASC，即第二次传代冷冻保存的ASC(在CryoStor10中)，并且在开始DC:ASC共培养(培养恢复的ASC)之前将细胞进行烧瓶培养(aMEM，5％Stemulate，1％青霉素/链霉素)一周。在DC:ASC共培养那天将一小瓶细胞产品CSCC_ASC，即第二次传代冷冻保存的ASC(在CryoStor10中)解冻以直接用于共培养。将ASC以每孔1×106的浓度接种在48孔板中，导致DC与ASC的比例为1:1。通过用1μg/mL脂多糖(LPS；Sigma)和20ng/mL干扰素-γ(IFN-g；Peprotech)刺激来活化DC。作为DC活化的阳性对照，一个仅含有DC的孔同样用1μg/mL脂多糖(LPS；Sigma)和20ng/mL干扰素-γ(IFN-g；Peprotech)进行刺激并孵育24小时。
树突状细胞成熟标记物的流式细胞术
通过重悬并除去上清液并用弯曲的移液管尖端刮取孔的底部来收获共培养物。收获的细胞用FACS洗涤缓冲液(补充有1.5％NaN3和1％热灭活FBS的PBS)洗涤两次。将样品与人IgG(Sigma)在冰上孵育15分钟以阻断Fc受体。使用的一抗是IgG-APC、CD11c-APC、IgG1k-PE、CD40-PE、CD80-PE、CD86-PE(BD Bioscience)和HLA-DR-FITC(Beckman Coulter)。将样品与抗体在冰上孵育30分钟并洗涤，并且在FACS Accuri(BD Bioscience)上获取数据。通过CD11c阳性和尺寸在门控(gated)为DC群体的事件上获得数据并在Flowlogic中分析。测量平均荧光强度(MFI)，并与阳性对照DC的MFI比较。
表13
人树突细胞检定显示第二次传代的最终和冷冻配制的ASC产品抑制人树突细胞成熟/活化。这表明细胞产品是主动免疫抑制的并且在体内注射后将免于排斥反应。用最终产品在解冻后直接进行实验，以及用来自最终和解冻产品的已进行培养以恢复的ASC来进行实验。从而解决了ASC配制和冷冻储存在树突细胞活化方面的影响。
在基于混合淋巴细胞反应(MLR)的体外细胞模型中进一步检查了第二次传代的最终ASC产品的免疫抑制活性。在该模型中，循环外周血单核细胞(PBMC)通过来自同种异体供体的经辐射的PBMC刺激，并加入不同比例的最终ASC产品。简而言之，ASC在96孔板中以对应于下列响应者(responder)PBMC的1:20至1:1的比例培养。没有ASC的孔(仅培养基)被用作阳性对照。使用淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)通过密度梯度离心从血沉棕黄层中纯化外周血单核细胞(PBMC)后的第二天。每个PBMC池的一半用γ辐射源(3000RAD)辐射。将PBMC合并到96孔板(每孔100μl+100μl)中以制备许多独特的MLR；增殖性PBMC池受到来自其他供体的辐射池的挑战。经过4天的共培养期后，加入3H-胸苷(25μSi/ml)并孵育18-20小时。使用自动收获器，将细胞收获到滤板上，放入闪烁液中并且用闪烁计数器(Topcount)确定使PBMC增殖响应可视化的每分钟计数。
将第二次传代的最终ASC产品添加至MLR证实了ASC对通常发生的快速淋巴细胞增殖产生抑制作用。
表14
实施例10
最终产品/第二次传代ASC的免疫调节表型
根据实施例1制备的最终产品CSCC_ASC基于免疫调节表面标记物的表型表征通过流式细胞术进行。用TrypleSelect收获ASC，洗涤，过滤并分配到含或不含抗体的管中。细胞在室温下用表15所示的抗体孵育30分钟。孵育后，将细胞洗涤，离心并重悬于PBS中以用于流式细胞术。
使用单色方案，其使用与荧光团结合的抗体标记细胞，所述荧光团如藻红蛋白、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白-德克萨斯红、藻红蛋白-花色素苷、别藻蓝蛋白和亮紫(导电聚合物)。通过FVS-780染色(Becton Dickinson)确定存活力。从最终分析中排除死细胞和双粘体。使用符合GMP的Navios(Beckman Coulter，Germany)收集和分析数据。使用Navios软件和Kaluza(Beckman Coulter，德国)分析数据。
表15
CXCR4：C-X-C 4型趋化因子受体
LTβR：淋巴毒素β受体
表15中所示的CD标记物全都由于它们在免疫调节功能特别是免疫抑制功能中的相关性而被选择。如表15所示的ASC表征与相当大的免疫抑制潜力相符(Krampera等，2013)。特别是强阳性标记物CD10、CD140a、CD160、CD204、CD258、CD270、CD272、CD44、CD49a、CD54、CD9、半乳凝素3和半乳凝素9、HLA-G和LTβR通过如免疫信号传导、细胞-细胞和细胞-ECM粘附、归巢、模式识别、T细胞抑制、生长因子受体上调节和促炎蛋白的失活的机理而反应出ASC免疫调节能力。
实施例11
免疫调节功能能力；对促炎症环境的表型适应
为了检查实施例10中示出的免疫调节和免疫抑制表型是否符合实际的免疫抑制反应性，在体外用促炎细胞因子攻击来自根据实施例1制备的产品CSCC_ASC的ASC，并检查表型变化。
将来自不同供体的最终产品ASC在标准培养基(αMEM，青霉素/链霉素，5％hPL)中体外培养。在约80％汇合时，将来自各个供体的培养物的一半用50ng/ml IFN-γ进行刺激，每个培养物25ml培养基。3天后，用TrypleSelect收获培养物，并制备用于流式细胞术，如实施例10所述。
表16
表17
如表16和17所示，最终产品ASC能够对炎症环境作出响应。在群体水平以及个体细胞水平上均发现响应。
群体百分比是指整个群体中显示所述表面标记物的细胞的百分比。平均荧光强度数字对应于每个个体细胞上标记物数量的上调或下调。
特别重要的是在群体基础上87％的CD274(PD-L1)上调表明启动免疫抑制作用的能力。CD274已知在巨噬细胞上表达，在特定事件如组织同种异体移植和自身免疫性疾病期间抑制免疫***的过程中发挥重要作用(Camillieri等，2016；Krampera等，2013)。PD-L1与其在激活的T细胞、B细胞和骨髓细胞上发现的受体PD-1结合，并调节活化或抑制T细胞增殖。PD-L1至少部分通过诱导细胞凋亡起作用。CD274在第二次传代ASC中的确切作用尚未确定，但用FBS手动扩增的CD274阳性骨髓MSC调节T细胞增殖和Th17极化，且已证实在INF-γ许可(licensing)时具有相当的效果。
还值得注意的是对标记物CD54(ICAM-1)而言MFI从3增加到97，其说明了稳定ASC-白细胞相互作用和信号转导所必需的细胞间粘附分子的动员。ICAM-1是LFA-1(整联蛋白)的配体，LFA-1(整联蛋白)是白细胞上发现的受体。
预期到HLA DR/DP/DQ显著上调，但是在已知的共刺激性标记物CD40、CD80和CD86没有上调的情况下，不能获得抗原呈递表型。相反，CD274的同时显著上调和其他免疫抑制标记物的持续表达与作为抗炎性的净输出是一致的(Krampera等，2013；Galipeau等，2016)。
在表型和功能上对环境作出反应的能力对于产品与当在处理时将细胞所注入的体内环境的相互作用的能力至关重要。这种产品固有的相互作用特性对其特性和临床功效具有重要意义。呈现免疫抑制表型的能力允许并解释了同种异体用途。
实施例12
临床研究
已经用最终产品CSCC_ASC对10例患者进行治疗，患者年龄为62.5±6.6岁(平均值±SD)，患有慢性缺血性心脏病和心力衰竭，左心室EF降低(≤45％)，纽约心力衰竭(NYHA)II-III级，没有任何进一步血管成形术，且在进行最大可耐受的药物治疗。使用NOGA导管(Biological Delivery System，Cordis，Johnson&Johnson，USA)将大约15次根据实施例1制备的0.3mL CSCC_ASC的注射剂注射到梗塞区边界区的存活心肌中。
患者在基线处和六个月后进行心脏ECHO和CT扫描，并进行对比。
使用320-多探测器CT扫描仪(Aquilion One，Toshiba Medical systemsCorporation，Otawara，Japan)进行心脏CT扫描。用扫描仪软件进行R-R区间和多节段图像重建。在预期窗口中以2％间隔0.5mm层片厚度和0.25mm的增量重建图像。
ECHO测量胸骨旁和心尖切面中的心脏功能和容积。
使用cvi后处理工具(Circle Cardiovascular Imaging，Calgary，Alberta，Canada)分析所有图像数据。在舒张末期和收缩末期手动追踪心内膜和心外膜边界，并将二尖瓣平面设定为定义LV的基础边界。
使用纽约心脏协会(NYHA)功能分类。基于患者在体力活动中受到呼吸短促方面限制的程度，将患者分为四类。
根据2002年3月的美国胸科协会指南，使用30米长(100英尺)的过道或走廊使6分钟步行试验(6MWT)标准化。Borg CR10量表用于测量感受强度。
表18
a：成对T试验
b：Wilcoxon符号秩和试验
治疗6个月后，左心室射血分数(LVEF)和6MWT得到改善，左心室收缩末期容积(LVESV)和NYHA评分下降。测量显示改善心脏的泵功能，增加工作能力并减少呼吸短促的发作。治疗安全有效。
实施例13
ASC的表面粘附
定义ASC群体的一个固有特征是ASC的粘附能力。此外，粘附能力是许多特征中首要的，其表明ASC保维持正常的细胞功能。在实施例中，研究了如实施例1中所述制备的产品CSCC_ASC在储存于-180℃干燥储存液氮容器中长达12个月之后ASC的粘附能力。简而言之，将根据实施例1制备的来自三个供体的ASC储存1、3、6和12个月，解冻，计数并在具有5％HPL的aMEM中进行体外培养5小时，每瓶1百万个活细胞。5小时后，洗涤培养物，用TrypleSelect分离粘附群体并计数。
表19A、B和C
粘附至表面的能力是重要的ASC特性。产品CSCC_ASC在冷冻、储存和解冻后具有高度保持的ASC粘附性。
如果在-180℃的N2干燥储存容器中储存高达12个月，71％至89％(平均76％)的细胞保持粘附的功能能力。
实施例14
表面标记物
如实施例1中所述制备的细胞如实施例2加以表征，不同之处在于使用单色流式细胞术方案，对于第一次传代ASC(8批次)和第二次传代ASC(14批次)产生如下表20所示的结果。
简而言之，在收获后直接和冷冻保存前分析细胞。对于流式细胞术，将细胞用PBS洗涤，调整至100万个细胞/ml，并在室温下在黑暗中用存活力染料FVS-780(BectonDickinson)标记10分钟。用含有FBS的PBS洗涤FVS-780，过滤细胞混悬液并在室温下在黑暗中按照之前滴定的体积加入抗体30分钟。所有使用的抗体均来自Becton Dickinson并与荧光染料PE(藻红蛋白)、亮紫(Brilliant Violet)510、FITC(异硫氰酸荧光素)、APC(别藻蓝蛋白)和PerCp-Cy5.5(多甲藻素-叶绿素串联)结合。从最终分析中排除死细胞和双粘体。使用符合GMP的Navios(Beckman Coulter，Germany)收集和分析数据，并使用Navios软件和Kaluza(Beckman Coulter，Germany)分析数据。
表20
表20显示了在第一次和第二次传代之后表达用于表征ASC的指定表面标记物的ASC的百分比。平均表达值分别基于第一次和第二次传代的8个和14个批次。还显示最小和最大表达水平。
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Claims (19)
1.一种组合物，其包含基本上同质且免疫抑制的成人脂肪组织来源的干细胞(ASC)群体在无蛋白质的冷冻保护剂中的混悬液，其浓度为至少1x107个细胞/mL。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述ASC群体的至少约80％表达CD90、CD73、CD13、CD105、CD29、CD166、CD10、CD140b、CD160、CD204、CD272、CD44、CD49a、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G和LTβR，并且所述ASC群体的至多约15％表达CD45、CD19、CD14、CD106、CD31和CD36。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中在所述ASC群体中，
至少90％表达CD90、CD73、CD13、CD29和CD166；至多5％表达CD45、CD19、CD14和CD31；至多10％表达CD106；2～15％表达CD36；至少10％表达CD146；至少80％表达CD105并且至多40％表达CD34；且/或
至少90％表达CD10、CD140b、CD160、CD204、CD272、CD44、CD54、CD9、半乳凝素3、半乳凝素9、HLA-G和LTβR；至少80％表达CD49a；至少60％表达CD258和CD270且至少5％表达CD200；至多15％表达CD15、CD152、CD163、CD18、CD274、CD39、CD40、CD62L、CD80和CD86；并且至多30％表达CXCR4。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中在干扰素-γ刺激时，表达CD274的ASC群体的百分比增加到至少80％，并且CD54阳性细胞上的CD54表达水平增加至少25倍。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中在解冻后即刻至少80％的干细胞群体是活细胞，并且当培养48小时时，干细胞群体具有至少为1的群体倍增数。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述冷冻保护剂包含Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)、Na+、K+、Ca2+、Mg2+1Cl—、H2PO4 —、HEPES、乳糖醛酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖-40、腺苷和谷胱甘肽，以及约5％至约15％的DMSO。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其是药物组合物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其是冷冻的。
9.一种细胞库，其包含在冷冻条件下储存的多个小瓶，每个小瓶包含约5mL根据权利要求7所述的组合物，其中细胞浓度在约2.0×107至约2.5×107个细胞/mL的范围内。
10.一种用于制备包含基本上同质的成人干细胞群体的组合物的方法，包括以下步骤：
(i)将从供体收集的脂肪抽吸物的基质血管部分(SVF)加入到生物反应器中，在所述生物反应器中至少一个表面经过预处理以促进成人干细胞的粘附；
(ii)在所述生物反应器中，在补充有人血小板裂解物的无血清培养基中培养粘附细胞至汇合；
(iii)分离所述粘附细胞；
(iv)以至少1×106个细胞/mL的浓度在冷冻保护剂中冷冻分离的细胞；
(v)使冷冻的细胞解冻并将步骤(ii)和(iii)以及任选的(iv)重复至少一次，
(vi)以至少1×107个细胞/mL的浓度冷冻分离的细胞；和
(vii)任选地，使冷冻的组合物解冻。
11.如权利要求10所述的方法，其中，
a)将生物反应器蛋白的至少一个表面用包含冷沉淀或由冷沉淀组成的组合物进行预处理；
b)所述培养基包含约2％至约15％的人血小板裂解物；
c)所述冷冻保护剂包含约5％至约15％的DMSO和Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)、Na+、K+、Ca2+、Mg2+1Cl—、H2PO4 —、HEPES、乳糖醛酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖-40、腺苷和谷胱甘肽；
d)在步骤(v)中，使冷冻的细胞解冻并将步骤(ii)和(iii)重复进行一次；或者
e)(a)至(d)中的任何两个或更多个的组合。
12.一种组合物，其包含根据权利要求10和11中任一项所述的方法获得或能够获得的基本上同质的成人干细胞群体在冷冻保护剂中的混悬液。
13.根据权利要求1-8和12中任一项所述的组合物，其用作药物。
14.根据权利要求1-8和12中任一项所述的组合物，其用于组织再生、免疫抑制和/或作为抗炎药物。
15.根据权利要求1-8和12中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防受试者中选自以下的疾病或病症：缺血性组织病症、组织功能障碍或破坏病症、自身免疫性病症、移植排斥反应和炎症性疾病或病症。
16.根据权利要求15所述用途的组合物，其中所述疾病或病症选自缺血性心脏病、急性心肌梗塞、缺血性脑卒中、严重肢体缺血、缺血性伤口、缺血性再灌注损伤/原发性器官移植物功能障碍、椎间盘修复、非缺血性扩张型心肌病、关节软骨病、克罗恩病、多发性硬化症、1型糖尿病、肾病、风湿性关节炎、移植器官排斥反应、2型糖尿病、肺动脉高血压和败血症。
17.根据权利要求16所述用途的组合物，其中所述疾病或病症是缺血性心脏病，并且其中通过心内注射向所述受试者施用至多约5mL的约5×107至约5×108个细胞。
18.根据权利要求15-17中任一项所述用途的组合物，其中所述受试者不是所述脂肪组织的供体。
19.根据权利要求18所述用途的组合物，其包括向患者重复施用至少一次，任选地其中所述脂肪组织来自不同的供体。
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