CN108132351A - 一种拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件及其制备方法,涉及纳米材料学、生命分析化学领域,探针核心为具有氧化还原活性的聚苯乙烯醛基微球,表面包覆有银纳米粒子,最外层吸附着蛋白质分子。本发明通过设计的表面增强蛋白质检测的纳米探针,充分利用银纳米粒子的表面等离子体相互作用产生强烈的局域电磁场强度,极大增强了拉曼信号。同时这些银纳米粒子与蛋白质存在Ag‑S键结合,并且在这些银纳米粒子点间隙处,形成蛋白质上的氨基与聚苯乙烯醛基微球表面的醛基共价结合反应,从而固定了更多的蛋白质,对检测低浓度的蛋白质有很大帮助。此纳米探针重复性强,价格低廉,制备简单。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料学、生命分析化学领域,具体涉及纳米探针器件的制备技术。
背景技术
表面增强拉曼光谱(Surface Enhanced Raman Spectrum,SERS)是一种超灵敏快速通用分析工具,在环境监控、生物医学、食品安全等领域展示出广泛的应用前景。表面增强拉曼光谱信号强度比普通拉曼光谱强度高几个到十几个数量级,因此表面增强拉曼散射信号被用于极低浓度甚至单分子的检测,并且在检测有机分子和生物分子时显示出非常简便、快速、廉价的技术特点。
但是,SERS 检测在实际应用中,一个主要的障碍是缺乏一种高效灵活的方法用于可重复性大规模制备高稳定性 SERS基底。随着现代纳米技术的飞速发展,大规模合成高灵敏、可重复性的 SERS基底,已成为一种可能。
发明内容
鉴于以上不足,本发明的目的旨在提出一种拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件,以解决产品制法重复性低、操作复杂、制备成本大的问题。
本发明所述的拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件为在载玻片表面固定有拉曼增强蛋白质检测的纳米探针,所述拉曼增强蛋白质检测的纳米探针的核心为具有氧化还原活性的聚苯乙烯醛基微球,在所述微球表面包覆银纳米粒子,在所述银纳米粒子外包裹蛋白质分子。
本发明充分利用银纳米粒子的表面等离子体相互作用产生强烈的局域电磁场强度,极大增强了拉曼信号。同时这些银纳米粒子与蛋白质存在Ag-S键结合,并且在这些银纳米粒子点间隙处,形成蛋白质上的氨基与聚苯乙烯醛基微球表面的醛基共价结合反应,从而固定了更多的蛋白质,对检测低浓度的蛋白质有很大帮助,并为纳米材料学、生命分析化学的发展铺垫了研究技术。
本发明还提出以上拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件的制备方法。
方法步骤如下:
1)以偶氮二异丁腈为引发剂,聚乙烯吡咯烷酮为分散剂,乙醇和水作为溶剂,将苯乙烯与丙烯醛共聚,制得聚苯乙烯醛基微球;
2)将聚苯乙烯醛基微球溶于无水乙醇后,与银氨水溶液混合,在80℃恒温条件下搅拌反应,取得表面包覆银纳米粒子的聚苯乙烯醛基微球;
3)将BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液与表面包覆银纳米粒子的聚苯乙烯醛基微球混合,在37℃下振荡孵育1小时,经超声离心除去过量的BSA蛋白质后,取得拉曼增强蛋白质检测的纳米探针溶液;
4)将载玻片浸没于拉曼增强蛋白质检测的纳米探针溶液中,经过1小时后取出,再放入25℃恒温真空干燥箱烘干1小时,取出,得拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件。
本发明以表面包覆银纳米粒子的聚苯乙烯醛基微球作为SERS基底材料,蛋白质溶液作为被检测物,将二者一体化,混合孵育后作为纳米探针进行器件化。本发明的特点是成型方便、工艺简单,且材料具有较高的拉曼增强特性。
本发明的创新点在于:
1、通过表面包覆银纳米粒子的聚苯乙烯醛基微球上银纳米粒子的表面等离子体相互作用在单粒子体系中构建电磁场增强的局域“热点”(hot-spots),达到二维有序衬底产生“热点”的目的,并且同时实现BSA分子的拉曼散射信号增强的目的。
2、此表面增强拉曼散射信号的纳米探针重复性强、操作简单、价格廉价且高灵敏的表面增强拉曼散射信号,具有优越光学特性的纳米拉曼探针。
3、本发明工艺流程简单,只需要将表面包覆银纳米粒子的聚苯乙烯醛基微球与蛋白质溶液混合孵育后LBL得到纳米探针即可方便检测蛋白质浓度。本发明还提高了蛋白质检测浓度的上限,制备了良好的纳米探针,可大规模生产,灵敏度上升。
特别是所述步骤3)中,所述BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中BSA蛋白质的浓度为10-10mol/L~10-6mol/L。纳米探针器件检测蛋白质的目的是可以检测到低浓度的蛋白质,文献中报道的可以检测到的蛋白质浓度在10-8mol/L,本发明通过拉曼的方法将检出限降低了两个单位。
进一步地,本发明所述步骤1)中,将聚乙烯吡咯烷酮溶于乙醇和去离子水中,取得聚乙烯吡咯烷酮溶液;将引发剂偶氮二异丁腈溶于苯乙烯中,取得溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯;再将聚乙烯吡咯烷酮溶液和溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯混合后,再加入丙烯醛,经反应后再加入盐酸,在80℃条件下反应12h,取得反应成生的固相,以乙醇和水超声洗涤,经离心取得聚苯乙烯醛基微球。制得的聚苯乙烯醛基微球的工艺特点有:制备简单,可回收,微球表面包覆有功能基团醛基,利于各种氧化还原反应的发生以及与蛋白质等生物试剂有很强的化学交联吸附作用。
所述步骤1)中,所述苯乙烯和丙烯醛的投料质量比为1∶1。该投料比满足二元共聚的特点,保证球的外部有足够的醛基基团。
所述步骤2)中,所述银氨水溶液中银离子与聚苯乙烯醛基微球的投料质量比为1∶100。该投料比使得微球表面包覆的银纳米粒子粒径较小且均匀包覆。
所述步骤3)中,所述BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液由BSA蛋白质和pH为7.2的磷酸盐缓冲液混合组成。蛋白质溶液在过酸或过碱的环境中容易失活变性,所以选择在中性的条件下进行配制。
其中, PS-CHO/Ag微球粒径为600nm,其上包覆银颗粒平均粒径为40nm。本发明检测蛋白质浓度上限得到提升,操作简便,器件化利于应用。
附图说明
图1为不同PS-CHO@Ag@BSA纳米探针的Raman图。
图2为不同浓度蛋白质与拉曼最强峰关系图。
图3、4、5、6分别是AgNO3为0.001g、0.005g、0.01g和0.2g时取得的PS-CHO@Ag复合微球在相同放大比例下的透射电镜图。
图7、8分别为不同温度条件下制得的PS-CHO@Ag复合微球在相同放大比例下的透射电镜图。
具体实施方式
实施例1:
1. PS-CHO微球的制备:
(1)将17.6mL无水乙醇、20.8mL去离子水和2.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入装有冷凝管的三口烧瓶中,并将其置于70℃恒温水浴锅中,机械搅拌并保持转速为315r/min。
(2)将0.1g引发剂AIBN溶于6mL苯乙烯中,取得溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯。
(3)在(1)取得的体系中加入溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯,30min后加入6mL丙烯醛(C3H4O),恒温反应7h后,加入盐酸并升高恒温水浴锅的温度至80℃反应12h,然后停止反应。用乙醇/水离心洗涤超声数次,所得PS-CHO乳液。
2. PS-CHO@Ag复合微球的制备:
取0.02gAgNO3溶于1mL去离子水中,滴入1mL氨水,稀释至10mL的银氨溶液。
取4mL PS-CHO微球溶于1mL无水乙醇中,用恒温滴液漏斗逐滴滴入银氨溶液,80℃恒温水浴下315r/min反应2小时,停止反应。用乙醇/水离心洗涤超声一次,所得PS-CHO@Ag微球。
取得的PS-CHO/Ag微球测试结果:粒径为600nm,其上包覆银颗粒平均粒径为40nm。
经试验证明:当PS-CHO/Ag微球粒径为600nm,其上包覆银颗粒平均粒径为40nm时,检测蛋白质浓度上限得到提升,操作简便,器件化利于应用。
3. 拉曼增强蛋白质检测的纳米探针的制备:
将BSA蛋白质分散在10mM磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH7.2)中,配制成10-6mol/L的BSA蛋白溶液。
将BSA蛋白溶液加入到PS-CHO@Ag微球中,混合物在37℃下振荡孵育1小时。然后将溶液进行超声离心以除去过量的BSA蛋白质,取得纳米探针溶液。
4. 拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件化:
将经过丙酮、乙醇、去离子水分别洗涤后的载玻片浸没于纳米探针溶液中,经过1小时后取出,再放入25℃恒温真空干燥箱烘干1小时,取出,重复上述步骤五次,得到自组装的纳米探针器件。
实施例2:
与实施例1相同的步骤在此不再复述,仅改变在步骤3中配制的BSA蛋白溶液浓度:将BSA蛋白分散在10mM磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH7.2)中,配成10-7mol/L的BSA溶液。
其他步骤与实施例1中相同。
实施例3:
与实施例一相同的步骤在此不再复述,仅改变在步骤3中配制的BSA蛋白溶液浓度:将BSA蛋白质分散在10mM磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH7.2)中,配成10-8mol/L的BSA溶液。
其他步骤与实施例1中相同。
实施例4:
与实施例一相同的步骤在此不再复述,仅改变在步骤3中配制的BSA蛋白溶液浓度:将BSA蛋白质分散在10mM磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH7.2)中,配成10-9mol/L的BSA溶液。
其他步骤与实施例1中相同。
实施例5:
与实施例一相同的步骤在此不再复述,仅改变在步骤3中配制的BSA蛋白溶液浓度:将BSA蛋白质分散在10mM磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH7.2)中,配成10-10mol/L的BSA溶液。
其他步骤与实施例1中相同。
二、试验结果分析:
inVia激光显微共聚焦拉曼光谱测试:采用英国RENISHAW公司,型号为inVia的激光显微共聚焦拉曼光谱仪测试探针性能。选择514nm激光器。测试条件:样品为负载在宽 1cm,长2cm载玻片上的薄膜,测试温度为 25℃。将以上各例取得的自组装的纳米探针器件分别进行测试,取得如图1所示的不同PS-CHO@Ag@BSA纳米探针的Raman图。
图1为吸附不同浓度牛血清蛋白的纳米探针在拉曼光谱下的测试图,由图1可见,拉曼图中主要有三个峰,其中(II)峰峰强呈明显降低趋势,寻找(II)峰峰强与吸附的牛血清蛋白浓度的关系可得图2。
图2由图1中(II)峰峰强作为Y轴与吸附不同浓度的牛血清蛋白的log函数作为X轴做图拟合曲线得。图2 说明该纳米探针器件在吸附10-10~10-6mol/L的牛血清蛋白后,用拉曼的方法可以检测到其峰强与浓度有函数关系,可以得到方程: Y=778872.44X R2=0.99898X∈(10-10~10-6mol/L)。
三、通过不同浓度银氨溶液调节PS-CHO@Ag复合微球上银纳米颗粒大小及包覆程度的试验及结果:
在实施例1其他条件不改变的情况下,仅改变AgNO3含量,将0.02gAgNO3分别以0.001g、0.005g、0.01g取代进行PS-CHO@Ag复合微球的制备。
图3、4、5、6分别是AgNO3为0.001g、0.005g、0.01g和0.2g时取得的PS-CHO@Ag复合微球在相同放大比例下的透射电镜图。
对比图3、4、5、6可见:随着银氨溶液浓度增大,微球表面包覆的银纳米颗粒逐渐增多,粒径逐渐增大,且包覆面积增大。
四、通过不同反应温度调节PS-CHO@Ag复合微球上银纳米颗粒大小及包覆程度的试验及结果:
在实施例1其他条件不改变的情况下,仅改变反应温度,将恒温水浴的温度80℃改为50℃进行PS-CHO@Ag复合微球的制备。
图7、8恒温水浴的温度分别为50℃和80℃下制得的PS-CHO@Ag复合微球的相同放大倍数的透射电镜图。
对比图7、8可见:当反应温度由80℃降低为50℃时,微球表面包覆的银纳米颗粒成长速度变慢,包覆面积减小,银纳米颗粒粒径减小。
Claims (6)
1.一种拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件,其特征在于:所述纳米探针器件为在载玻片表面固定有拉曼增强蛋白质检测的纳米探针,所述拉曼增强蛋白质检测的纳米探针的核心为具有氧化还原活性的聚苯乙烯醛基微球,在所述微球表面包覆银纳米粒子,在所述银纳米粒子外包裹蛋白质分子。
2.如权利要求1所述拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)在以偶氮二异丁腈为引发剂,聚乙烯吡咯烷酮为分散剂,乙醇和水作为溶剂的条件下,将苯乙烯与丙烯醛共聚,制得聚苯乙烯醛基微球;
2)将聚苯乙烯醛基微球溶于无水乙醇后,与银氨水溶液混合,在80℃恒温条件下搅拌反应,取得表面包覆银纳米粒子的聚苯乙烯醛基微球;
3)将BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液与表面包覆银纳米粒子的聚苯乙烯醛基微球混合,在37℃下振荡孵育1小时,经超声离心除去过量的BSA蛋白质后,取得拉曼增强蛋白质检测的纳米探针溶液;所述BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中BSA蛋白质的浓度为10-10mol/L~10- 6mol/L;
4)将载玻片浸没于拉曼增强蛋白质检测的纳米探针溶液中,经过1小时后取出,再放入25℃恒温真空干燥箱烘干1小时,取出,得拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件。
3.根据权利要求2所述拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件的制备方法,其特征在于所述步骤1)中,将聚乙烯吡咯烷酮溶于乙醇和去离子水中,取得聚乙烯吡咯烷酮溶液;将引发剂偶氮二异丁腈溶于苯乙烯中,取得溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯;再将聚乙烯吡咯烷酮溶液和溶有引发剂AIBN的单体苯乙烯混合后,再加入丙烯醛,经反应后再加入盐酸,在80℃条件下反应12h,取得反应成生的固相,以乙醇和水超声洗涤,经离心取得聚苯乙烯醛基微球。
4.根据权利要求3所述拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件的制备方法,其特征在于所述步骤1)中,所述苯乙烯和丙烯醛的投料质量比为1∶1。
5.根据权利要求2所述拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件的制备方法,其特征在于所述步骤2)中,所述银氨水溶液中银离子与聚苯乙烯醛基微球的投料质量比为1∶100。
6.根据权利要求2所述拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件的制备方法,其特征在于所述步骤3)中,所述BSA蛋白质的磷酸盐缓冲溶液由BSA蛋白质和pH为7.2的磷酸盐缓冲液混合组成。
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