CN108130306A - 高产尿苷的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高产尿苷的基因工程菌及其构建方法与应用，该菌是在大肠杆菌的基因组上整合了核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE，并由强启动子P_trc启动，重构了尿苷合成途径；在基因组上对其自身的PRPP合成酶编码基因prsA进行双拷贝，由强启动子P_trc启动；同时缺失尿苷激酶(udk)、尿苷磷酸化酶(udp)和核苷水解酶(rihA、rihB和rihC)活性；缺失高丝氨酸脱氢酶1(thrA)活性；缺失鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF)活性。该基因工程菌应用于发酵生产尿苷，在5L发酵罐发酵40‑70h可生产尿苷40‑67g/L，最大生产强度可达1.5g/(L×h)，糖苷转化率为15‑25％，是目前报道的发酵法生产尿苷的最高水平。

Description

高产尿苷的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高产尿苷的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

尿苷是一种嘧啶核苷，广泛应用于食品、保健品、化妆品和医药行业。尿苷是构成尿苷酸的前体，尿苷酸不仅可以作为调味品和制药原料，还可作为食品添加剂添加到奶粉中，大幅度提高婴儿的免疫力。尿苷可作为医药中间体生产一些抗病毒抗肿瘤药物，如碘苷、溴苷、氟苷等，治疗癌症或病毒引起的疾病。尿苷具有十分重要的实用价值，市场对尿苷的需求量大，迫切需要成本低且能够大规模生产的尿苷生产工艺。

目前尿苷的生产方法有化学合成法、水解RNA法和微生物发酵法。化学合成法生产尿苷的方法存在反应步骤多、反应条件苛刻、操作繁琐、环境污染较大和原料成本高的问题；水解RNA法需要大量优质RNA，原料不易得，成本高；微生物发酵法因其周期短、易控制、产率高、污染小等优点，是大规模工业化生产尿苷的理想方法。

尿苷生产菌株的选育始于20世纪60年代，常用的出发菌株包括大肠杆菌、产氨短杆菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等，特别是以枯草芽孢杆菌为出发菌株选育尿苷生产菌的报道最多。生物体内尿苷的代谢合成途径比较长，代谢调控***也比较复杂，解除尿苷合成关键酶氨甲酰磷酸合成酶所受反馈阻遏和反馈抑制作用是尿苷能够大量积累的关键。目前，尿苷高产菌株的选育多以枯草芽孢杆菌为出发菌株采用诱变结合结构类似物抗性平板筛选的方法。武田公司以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株，经过多轮NTG诱变，筛选到一株尿苷磷酸化酶几乎活性丧失的菌株No.556，能够积累尿苷55g/L。诱变育种选育尿苷产生菌的方法周期比较长，且多轮诱变所得菌株的遗传背景复杂，生长性状不佳，菌种容易退化，菌种进一步改良的难度大。

随着基因工程育种技术的不断发展，特别是基因编辑技术的改良大大提高了细胞工厂的构建效率，研究人员越来越青睐于对野生菌的染色体直接进行定向修饰从而获得各种生物制品的发酵菌株。朱晖等采用基因工程育种方法，对B.subtilis 168尿苷生物合成途径中的一些相关基因进行了敲除、修饰和过表达，构建了产尿苷的重组菌株B.subtilisTD231-1，尿苷产量为1.48g/L；杨绍梅等以产尿苷的重组菌B.subtilis TD131为出发菌，对其磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶(prs)和氨甲酰磷酸合成酶(pyrAA/pyrAB)进行点突变，同时异源表达了酿酒酵母的5′-核苷酸酶，最终得到菌株B.subtilis TD246，该菌摇瓶发酵尿苷产量为8.16g/L。虽然通过基因工程改造可获得枯草芽孢杆菌尿苷产生菌，但是产苷水平低下，目前还达不到尿苷的工业化生产要求。另外，相对于大肠杆菌，枯草芽孢杆菌感受态效率低和基因重组效率低等原因，导致对枯草芽孢杆菌进行***定向改造的难度较大。而且枯草芽孢杆菌发酵产尿苷时，菌种对营养源特别是有机氮源的需求高。为了大量积累尿苷，发酵培养基中需添加大量的玉米浆等有机氮源，不利于后续产品的分离纯化，同时枯草芽孢杆菌发酵尿苷的周期长达70多个小时，生产效率相对较低。

发明内容

针对上述存在问题，本发明目的是提供一种高产尿苷的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法，并制定了相应的发酵过程控制方案，可应用于尿苷的高效工业化生产。

本发明技术方案概述如下：

本发明提供一种高产尿苷的基因工程菌，其是在大肠杆菌的基因组上整合了核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE，并由强启动子P_trc启动，重构了尿苷合成途径；在基因组上对其自身的PRPP合成酶编码基因prsA进行双拷贝，并由强启动子P_trc启动；同时缺失尿苷激酶、尿苷磷酸化酶和核苷水解酶活性；缺失高丝氨酸脱氢酶1活性；缺失鸟氨酸氨甲酰转移酶活性。

进一步地，所述大肠杆菌为E.coli W3110。

进一步地，所述嘧啶核苷操纵子来源于B.subtilis CGMCC No.11775。

本发明进一步详述的技术方案如下：

一种生产尿苷的基因工程菌E.coli UR11。E.coli UR11菌株是在E.coli W3110(ATCC27325)的基因组上整合了来源于B.subtilis A260(CGMCC No.11775)的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:1)，并由强启动子P_trc(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:2)启动，重构了尿苷合成途径；缺失尿苷激酶(udk)、尿苷磷酸化酶(udp)和核苷水解酶(rihA、rihB和rihC)活性，切断了尿苷的主要降解途径；在基因组上对其自身的PRPP合成酶编码基因prsA(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:3)进行双拷贝，由强启动子P_trc启动，增强菌株PRPP合成酶的活性，从而加强前体物PRPP的供应；缺失高丝氨酸脱氢酶1(thrA)活性，减弱了前体物天冬氨酸的支路代谢；缺失鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF)活性，减弱了前体物氨甲酰磷酸的支路代谢。

本发明还提供一种高产尿苷的基因工程菌的构建方法如下：

本发明中采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110进行定向改造，具体包括如下步骤：

(1)在E.coli W3110(ATCC 27325)中重构尿苷合成代谢途径：在E.coli W3110的基因组上，按顺序依次将来源于B.subtilis A260的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE整合在假基因yghX位点；

(2)将udk、udp、rihA、rihB和rihC五个基因依次敲除，阻断尿苷的降解；

(3)构建启动子P_trc和prsA基因的连接片段P_trc-prsA，并将其整合在trpR基因位点，促进前体物PRPP的积累；

(4)将thrA基因敲除，减弱前体物天冬氨酸的支路代谢；

(5)将argF基因敲除，减弱前体物氨甲酰磷酸的支路代谢；

本发明还提供了上述基因工程菌在生产尿苷中的用途。

本发明还提供了利用上述基因工程菌发酵生产尿苷的方法，包括：

(1)摇瓶发酵：

将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到装有500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期24-30h。

优选的发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-3g/L，KH₂PO₄ 1-3g/L，MgSO₄·7H₂O 1-2g/L，酵母提取物0.1-0.3g/L，玉米浆1-2mL/L，FeSO₄·7H₂O 80-100mg/L，MnSO₄·7H₂O 80-100mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。

摇瓶发酵24-30h后尿苷的产量可达8-12g/L。

(2)发酵罐发酵：

将菌种活化后制备种子液，按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期40-70h；

优选的发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，FeSO₄·7H₂O 80-100mg/L，MnSO₄·H₂O 80-100mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各0.5-2mg/L，苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸各50-200mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

5L发酵罐发酵40-70h后尿苷的产量可达40-67g/L。

有益效果：

本发明提供的菌株具有更好的生长性状，尿苷的生产效率更高，更重要的是该菌遗传背景清晰，基因操作简单高效，方便对其进行进一步的性状改良；本发明所提供的产尿苷菌种构建方法是一种定向的理性的菌种构建方法，相比传统诱变方法更为高效便捷，可操作性强；本发明提供的尿苷的发酵工艺廉价高效，周期短，生产强度更高，并且发酵培养基成份简单，更有利于后续产品的分离纯化。采用本发明所提供的技术方案在5L发酵罐发酵40-70h可生产尿苷40-67g/L，最大生产强度可达1.5g/(L×h)，糖苷转化率为15-25％，是目前报道的发酵法生产尿苷的最高水平。

附图说明

图1：(a)pREDCas9质粒图谱，(b)pGRB质粒图谱。

图2：pyrB基因整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：pyrB片段；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。

图3：pyrC-pyrAA整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNAmarker；1：pyrC上游-pyrC-pyrAA基因片段；2：下游同源臂；3：重叠片段；4:原菌对照；5：阳性菌的鉴定片段。

图4：pyrAB-pyrK-pyrD-pyrF-pyrE整合片段的构建及验证电泳图。其中：M：1kbDNAmarker；1：pyrAB上游片段-pyrAB-pyrK-pyrD-pyrF-pyrE基因片段；2：下游同源臂；3：重叠片段；4:原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。

图5：udk基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。

图6：udp基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。

图7：rihA基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。

图8：rihB基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。

图9：rihC基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。

图10：Ptrc-prsA整合片段的构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。

图11：thrA基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。

图12：argF基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。

图13：E.coli UR11发酵过程曲线。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。

实施例1：

菌株E.coli UR11的构建：

1基因编辑的方法

本发明中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9meditated genomeediting.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行，该方法所用的两个质粒图谱见附图1。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除***，λ噬菌体的Red重组***及Cas9蛋白表达***，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。

该方法的具体步骤如下：

1.1pGRB质粒构建

构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组的方法构建pGRB质粒。

1.1.1靶序列设计

使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)

1.1.2包含靶序列的DNA片段的制备

设计引物：5’-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3’及其反向互补的引物，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下：

退火体系

1.1.3线性载体的制备

载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。

1.1.4重组反应

重组体系如下表。所用重组酶均为One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。

重组体系

1.1.5质粒的转化

取10μL反应液，加入到100mL DH5α化转感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20min，42℃热激45-90s，立即冰浴2-3min，加入900μL SOC，于37℃复苏1h。8000rpm离心2min，弃部分上清，留200μL左右将菌体重悬后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的平板，将平板倒置，于37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子。

1.1.6克隆鉴定

将PCR阳性菌落接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养后保菌，提取质粒，酶切鉴定。

1.2重组DNA片段的制备

用于敲除的重组片段由需敲除基因的上下游同源臂组成(上游同源臂-下游同源臂)；用于整合的重组片段以整合位点的上下游同源臂及待整合的基因片段组成(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。利用引物设计软件primer5，以待敲除基因或待整合位点的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约400-500bp)；以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段。PCR的体系和方法如下表：

PCR扩增体系

重叠PCR的体系如下表：

重叠PCR扩增体系

注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。

PCR反应条件(宝生物PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(此酶活力1min延伸约1kb)；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。

1.3质粒和重组DNA片段的转化

1.3.1pREDCas9的转化

利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至W3110的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上生长单菌落用鉴定引物进行菌落PCR,筛选阳性重组子。

1.3.2含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备

32℃培养至OD₆₀₀＝0.1～0.2时，添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，继续培养至OD₆₀₀＝0.6～0.7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。

1.3.3pGRB和重组DNA片段的转化

将pGRB和供体DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。

1.4质粒的消除

1.4.1pGRB的消除

将阳性重组子置于含有0.2％***糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。

1.4.2pREDCas9质粒的消除

将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。

2.菌株构建过程中用到的引物

菌株构建过程中所涉及的所有引物见下表：

3菌株构建的具体过程

3.1将来源于枯草芽孢杆菌的嘧啶核苷操纵子基因整合在W3110的yghX基因位点

B.subtilis A260是以枯草芽孢杆菌168菌株为出发菌株，采用ARTP诱变和高通量筛选相结合的方法选育而来(该菌株已于2015年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路l号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，菌种保藏编号：CGMCC No.11775)。该菌株解除了尿苷酸的反馈调节作用，通过对其嘧啶核苷操纵子基因进行测序发现其氨甲酰磷酸大亚基(pyrAB编码)第949位的谷氨酸缺失，我们已对相关研究结果申请了专利保护(申请公布号CN105671007A)。

本发明中将B.subtilis A260中的嘧啶核苷操纵基因(pyrBCAKDFE，包含pyrB、pyrC、pyrAA、pyrAB、pyrK、pyrD、pyrF、pyrE八个基因)按顺序依次整合在E.coli W3110基因组上的假基因yghX位点处，并由启动子P_trc启动该外源操纵子的转录表达，构建了菌株E.coliUR3。

B.subtilis A260中的嘧啶核苷操纵基因的整合共分了三段。

3.1.1P_trc-pyrB的整合

以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其yghX基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yghX-S、UP-yghX-A)和下游同源臂引物(DN-yghX-S1、DN-yghX-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以B.subtilis A260(CGMCC No.11775)基因组为模板，根据其pyrB基因序列设计引物(pyrB-S、pyrB-A)，并PCR扩增pyrB片段；启动子P_trc则设计在上游同源臂的下游引物和pyrB基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得pyrB基因的整合片段(上游同源臂-P_trc-pyrB-下游同源臂)，构建pGRB-yghX使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yghX-S和gRNA-yghX-A的退火制得。制备E.coli W3110的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli UR1。P_trc-pyrB片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。其中上游同源臂长度为560bp，pyrB基因片段长度为1003bp，下游同源臂长度为602bp，重叠片段的长度为2239bp，PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度应为2239bp，原菌扩增出来的片段长度应为1635bp。

3.1.2pyrC-pyrAA的整合

以B.subtilis A260(CGMCC No.11775)基因组为模板，根据pyrC-pyrAA及其上游序列设计上游同源臂引物(UP-pyrC-pyrAA-S、UP-pyrC-pyrAA-A)，并PCR扩增其上游同源臂片段；以E.coli UR1基因组为模板，根据其yghX基因的下游序列设计下游同源臂引物(DN-yghX-S2、DN-yghX-A)，并PCR扩增其下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得pyrC-pyrAA的整合片段(pyrC的上游片段-pyrC-pyrAA-下游同源臂)。构建pGRB-pyr1使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-pyr1-S和gRNA-pyr1-A的退火制得。制备E.coliUR1的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli UR2。pyrC-pyrAA片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3。其中pyrC的上游片段-pyrC-pyrAA的总长度为2889bp，下游同源臂长度为602bp，重叠片段的长度为3468bp，PCR验证重组子时，阳性重组子扩增片段的总长度应为2889bp，原菌应无条带。

3.1.3pyrAB-pyrK-pyrD-pyrF-pyrE的整合

以B.subtilis A260(CGMCC No.11775)基因组为模板，根据pyrAB-pyrK-pyrD-pyrF-pyrE及其上游序列设计上游同源臂引物(UP-pyrABKDFE-S、UP-pyrABKDFE-A)，并PCR扩增其上游同源臂片段；以E.coli UR1基因组为模板，根据其yghX基因的下游序列设计下游同源臂引物(DN-yghX-S3、DN-yghX-A)，并PCR扩增其下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得pyrAB-pyrK-pyrD-pyrF-pyrE的整合片段(pyrAB的上游片段-pyrABKDFE-下游同源臂)。构建pGRB-pyr2使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-pyr2-S和gRNA-pyr2-A的退火制得。制备E.coli UR2的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coliUR3。pyrAB-pyrK-pyrD-pyrF-pyrE的整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图4。其中pyrAB的上游片段-pyrAB-pyrK-pyrD-pyrF-pyrE的总长度为6757bp，下游同源臂长度为602bp，重叠片段的总长度应为7336bp，鉴定引物所扩增片段长度应为1262bp，原菌应无条带。

3.2udk、udp、rihA、rihB和rihC五个尿苷降解相关基因的敲除

3.2.1udk基因的敲除

以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其udk基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-udk-S、UP-udk-A)和下游同源臂引物(DN-udk-S、DN-udk-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得udk基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-udk使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-udk-S和gRNA-udk-A的退火制得。制备E.coli UR3的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli UR4。udk敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图5。其中，上游同源臂的长度应为477bp，下游同源臂的长度应为436bp，敲除片段的总长应为894bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为894bp，原菌PCR扩增片段长度应为1422bp。

3.2.2udp基因的敲除

以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其udp基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-pdp-S、UP-pdp-A)和下游同源臂引物(DN-udp-S、DN-udp-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得udp基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-udp使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-udp-S和gRNA-udp-A的退火制得。制备E.coli UR4的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli UR5。udp敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图6。其中，上游同源臂的长度应为492bp，下游同源臂的长度应为516bp，敲除片段的总长应为1008bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1008bp，原菌PCR扩增片段长度应为1653bp。

3.2.3rihA基因的敲除

以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其rihA基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-rihA-S、UP-rihA-A)和下游同源臂引物(DN-rihA-S、DN-rihA-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得rihA基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-rihA使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-rihA-S和gRNA-rihA-A的退火制得。制备E.coli UR5的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli UR6。rihA敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图7。其中，上游同源臂的长度应为527bp，下游同源臂的长度应为515bp，重叠片段的总长应为1021bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1021bp，原菌PCR扩增片段长度应为1857bp。

3.2.4rihB基因的敲除

以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其rihB基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-rihB-S、UP-rihB-A)和下游同源臂引物(DN-rihB-S、DN-rihB-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得rihB基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-rihB使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-rihB-S和gRNA-rihB-A的退火制得。制备E.coli UR6的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli UR7。rihB敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图8。其中，上游同源臂的长度应为474bp，下游同源臂的长度应为438bp，重叠片段的总长应为891bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为891bp，原菌PCR扩增片段长度应为1789bp。

3.2.5rihC基因的敲除

以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其rihC基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-rihC-S、UP-rihC-A)和下游同源臂引物(DN-rihC-S、DN-rihC-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得rihC基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-rihC使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-rihC-S和gRNA-rihC-A的退火制得。制备E.coli UR7的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli UR8。rihC敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图9。其中，上游同源臂的长度应为520bp，下游同源臂的长度应为455bp，重叠片段的总长应为955bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为955bp，原菌PCR扩增片段长度应为1787bp。

3.3将P_trc-prsA整合在trpR基因位点处

以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其trpR基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-trpR-S、UP-trpR-A)和下游同源臂引物(DN-trpR-S、DN-trpR-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；根据prs基因设计引物(prsA-S、prsA-A)，并扩增prsA基因片段。启动子P_trc则设计在上游同源臂的下游引物和prsA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得prsA基因的整合片段(上游同源臂-P_trc-prsA-下游同源臂)，构建pGRB-trpR使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-trpR-S和gRNA-trpR-A的退火制得。制备E.coli UR8的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli UR9。P_trc-prsA整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图10。其中，上游同源臂的长度应为451bp，prsA基因片段长度应为1243bp，下游同源臂的长度应为404bp，整合片段的总长应为2058bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2058bp，原菌PCR扩增片段长度应为1333bp。

3.4thrA基因的敲除

以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其thrA基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-thrA-S、UP-thrA-A)和下游同源臂引物(DN-thrA-S、DN-thrA-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得thrA基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-thrA使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-thrA-S和gRNA-thrA-A的退火制得。制备E.coli UR9的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli UR10。thrA敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图11。其中，上游同源臂的长度应为394bp，下游同源臂的长度应为621bp，敲除片段的总长应为1015bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1015bp，原菌PCR扩增片段长度应为3323bp。

3.5argF基因的敲除

以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其argF基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-argF-S、UP-argF-A)和下游同源臂引物(DN-argF-S、DN-argF-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得argF基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-argF使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-argF-S和gRNA-argF-A的退火制得。制备E.coli UR10的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli UR11。argF敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图12。其中，上游同源臂的长度应为568bp，下游同源臂的长度应为434bp，敲除片段的总长应为1002bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1002bp，原菌PCR扩增片段长度应为1897bp。

实施例2：

利用基因工程菌E.coli UR11发酵生产尿苷的方法如下：

(1)摇瓶发酵：

斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；

摇瓶种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm培养7-10h；

摇瓶发酵培养：按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期24-30h；

斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，NaCl 1-2.5g/L，琼脂15-20g/L，其余为水，pH 7.0-7.2；

种子培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-5g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O1-2g/L，酵母提取物5-10g/L，FeSO₄·7H₂O 1-3mg/L，MnSO₄·H₂O 1-3mg/L，其余为水，pH7.0-7.2；

发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-3g/L，KH₂PO₄ 1-3g/L，MgSO₄·7H₂O1-2g/L，酵母提取物0.1-0.3g/L，玉米浆1-2mL/L，FeSO₄·7H₂O 80-100mg/L，MnSO₄·7H₂O80-100mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。

摇瓶发酵24-30h后尿苷的产量可达8-12g/L。

(2)发酵罐发酵：

斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12-16h，转接茄形瓶继续培养12-16h；

种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达到5-6g/L；

发酵培养：按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期40-70h；

斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，NaCl 1-2.5g/L，琼脂15-20g/L，其余为水，pH 7.0-7.2；

种子培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母提取物5-10g/L，胰蛋白胨5-10g/L，KH₂PO₄5-15g/L，MgSO₄·7H₂O 2-5g/L，FeSO₄·7H₂O 5-15mg/L，MnSO₄·H₂O 5-15mg/L，V_B1 1-3mg/L，V_H 0.1-1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，FeSO₄·7H₂O 80-100mg/L，MnSO₄·H₂O80-100mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各0.5-2mg/L，苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸各50-200mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。

5L发酵罐发酵40-70h后尿苷的产量可达40-67g/L。

实施例3：

菌株E.coli UR11在5L发酵罐上的发酵实验：

斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12h，转接茄形瓶继续培养12h；

种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养6h；

发酵培养：按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期64h；

斜面培养基组成为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl2.5g/L，琼脂25g/L，其余为水，pH 7.0；

种子培养基组成为：葡萄糖25g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨3g/L，KH₂PO₄ 1.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。

发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母提取物4g/L，胰蛋白胨5g/L，柠檬酸钠2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，FeSO₄·7H₂O 20mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各2mg/L，苏氨酸200mg/L、赖氨酸200mg/L、蛋氨酸200mg/L、谷氨酰胺200mg/L、精氨酸200mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。

5L发酵罐发酵64h后尿苷的产量达到了67g/L。发酵过程曲线见附图13。

虽然上述已公开了本发明较佳的实施方式，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 高产尿苷的基因工程菌及其构建方法与应用

<141> 2018-01-10

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9492

<212> DNA

<213> B. subtilis

<400> 1

atgaagcatt taacgacgat gagtgaactt agcactgagg aaatcaaaga tttgcttcaa 60

acagcacaag agctcaaaag cggaaaaaca gacaatcagc ttacaggaaa gtttgcagca 120

aacctgtttt tcgaaccgag cacgagaacg cggttcagct ttgaggtcgc agaaaaaaag 180

ctgggcatga atgtgcttaa ccttgatgga acaagcacaa gcgtgcaaaa aggcgaaacc 240

ttatatgaca cgatccggac gcttgaatca atcggtgtgg acgtctgcgt catcaggcac 300

agtgaggatg agtattatga agagcttgtc agccaggtga acattccgat tctgaatgcg 360

ggagacgggt gcggccagca tccaacacaa tcactgcttg atttaatgac gatttatgaa 420

gagttcaata cgtttaaagg gcttaccgtc tccattcacg gcgacatcaa gcatagcaga 480

gtggcaaggt caaatgcgga agtgttgaca agattgggtg cccgggtcct attttccggc 540

ccttcggaat ggcaggatga agaaaataca ttcggcacgt atgtctcaat ggatgaagca 600

gttgagtctt ccgatgttgt catgctgctg cgcattcaaa atgaacgaca tcagtccgct 660

gtcagtcagg aaggctattt aaacaaatac ggcttgaccg tagaacgggc tgagcgtatg 720

aagcggcatg cgatcatcat gcatcctgct ccggtaaaca gaggagtgga gattgatgac 780

agcttagtag aaagcgaaaa atcaagaatc ttcaagcaaa tgaaaaatgg cgtatttatc 840

agaatggcag tgatacagcg tgccttacaa accaatgtga aaagaggaga agcagcgtat 900

gtcatatctc attaaaaacg gctggatact aaacgaaaat ggtgaaaaaa cacaagcgga 960

tatccgagtg actggagaaa ccatcaccgc aatcggcaag cttgatgcaa cggataatga 1020

aacggtaatt gatgcaaaag gtttgctcgt ttcacctggg tttgttgatc tccacgtgca 1080

tttcagagag ccgggcggag agaaaaaaga aactattgaa accggggcaa aagcagcggc 1140

gcgcggcggc tatactacag tagcagcaat gccgaatacg cggccggttc ctgatacaaa 1200

ggagcagatg gaatgggtgc aaaacagaat taaagaaaca tcatgcgtaa gagttcttcc 1260

atatgcatcc attacgatca gacaaatcgg cgatgaaatg acaaactttg aagcgttaaa 1320

agaagccggg gcatttgctt ttacagatga cggcgttggt atacagacag caggaatgat 1380

gtatgaagcg atgaaacggg cagccgcaat tgacaaagcg attgttgcac attgcgagga 1440

caactcctta atttacggag ggagcgtaca tgaggggaca ttctccaaag cgaacgggct 1500

aaacggcatt ccttctgtgt gtgaatcggt tcatattgct cgcgatgtgc tgctggctga 1560

ggcggcaaac tgccattatc atgtatgcca tatcagcaca aaagaatctg tcagagttgt 1620

acgcgatgcg aaaaaagcgg gaatcagagt gacagcagaa gtatcgccgc atcatttgct 1680

gctttgtgat gaggacatcc cggggctgga cacaaactat aaaatgaatc ctccgctccg 1740

cagcccagaa gacagagctg ctttaattga aggtctttta gacggaacaa ttgattttat 1800

cgcaacagac catgcaccgc atacggaaga agagaagaac acagaaatga agctggcgcc 1860

attcggaatt gtcggcttag aaacagcatt cccgcttctt tacacacact ttgtcaaaaa 1920

tggcagctgg tcactgaagc agctgattga ctacatgaca atcaagccat gcgaagcgtt 1980

cggtctccca tatggaacat tacaaacggg gcaagctgcg gacattacgt taatcgattt 2040

agaaaaagaa gcagttatag acaaagagac atttttatca aaaggaaaaa atacaccatt 2100

caacggcatc agttgcaccg gctggccggt cgctacaatt gcggcaggga agcttgctta 2160

tgaagagggg agacttgtca aatgaagaga cgattagtac tggaaaacgg agcggtattc 2220

gagggagaag ctttcggaag cttagaacac aacatgggag aagtcgtttt taatactggg 2280

atgacaggct atcaggaaat tttatctgat ccttcttact gcggacagat cgtaacatta 2340

acatacccgc ttatcggaaa ttacggcatt aaccgtgatg attttgaatc cattacccct 2400

tttgtcaaag ggctgatcat caaagaatta tgtgagctgc cttccaactg gcgttcagca 2460

tacaccttag acgagtattt aaaaatgaaa aacattcccg gactccaggg aattgataca 2520

aggaagctga caagaatgat ccgcacggca ggcgcgctaa aaggaacatt cgcttcatct 2580

gatgaagata tcgaagcagt gctgaaaaga ctgaacgaaa cggaattgcc aagaaatcaa 2640

gtatcccaag tatcagcaaa aacagcatat ccgagcccgg gaagaggcaa acgcattgtc 2700

ttggttgact tcggcatgaa acacgggatt ctaagagagc tgaacaaacg gaaatgtgac 2760

gtcatcgttg tgccttacaa cattacagcg gaagaggtgc ttcagctgaa accggacggt 2820

atcatgcttt ctaacggacc tggagacccg aaggatgtgc ctgaagcgat tgaaatgatt 2880

aaaggtgttc ttggaaaagt gccattattc ggaatatgtc tcggccacca attattcgcg 2940

ctggcgtgcg gggcgaatac tgaaaaaatg aaattcggcc acaggggctc aaaccacccg 3000

gtaaaagagc tggctacagg aaaagttgcc ttaacatctc aaaaccatgg atatacagtt 3060

tcgtctatca gtaaaacaga actggaagtg acgcatatcg caattaacga cgatacgatt 3120

gaagggctga agcataaaac attgccggca tttacggttc aatatcatcc cgaagcctca 3180

cctggtcctg aggatgccaa ccatctattt gacagattca tcgaaatgat cgaaacaaca 3240

gagaaagaag gggaagcggt atgccaaaac gcgtagacat taacaaaatt ttagtaatcg 3300

gatctggacc gatcatcatc ggccaagcag cagaatttga ctatgcggga acacaagcct 3360

gtcttgcttt gaaagaagaa ggctatgaag tcatccttgt caactcaaac cctgcaacga 3420

tcatgacaga tacagaaatg gctgaccggg tttacatcga accgctcaca cctgaattcc 3480

tgacacgaat catcagaaaa gagcgcccgg atgccattct tcctacactc ggaggccaaa 3540

ccggtttgaa tcttgcggtt gagctttctg aaagaggcgt tttggcagaa tgcggcgtcg 3600

aagtgcttgg cacgaaactg tctgcgattc agcaagctga agaccgtgac ttgttcagaa 3660

cattaatgaa tgaactgaat gaaccggtgc ctgaaagtga gattatccac tcccttgaag 3720

aagcagaaaa attcgtcagt caaattggat tccctgtcat tgtccgcccg gcatatacat 3780

taggcggaac aggcggaggc atctgctcga atgaaacaga gctaaaagaa atcgttgaga 3840

acggcttgaa attaagcccg gtacaccaat gtctgcttga aaaaagcatc gccggctata 3900

aagaaatcga gtatgaagtc atgagagaca gccaggatca cgccattgtc gtttgtaaca 3960

tggaaaacat tgatccagtt ggaatccata ctggagacag tattgttgtc gcgccgagcc 4020

aaacgctcag cgatcgcgaa tatcagctct tgcggaatgt atcgttaaaa ctgattcgcg 4080

cgcttgggat cgaaggcgga tgtaatgtcc agctcgcctt agatccagac agcttccaat 4140

attacattat tgaagtaaat ccgcgtgtca gccgttcatc tgcccttgca tcaaaagcaa 4200

cggggtaccc gattgcaaag ctcgctgcta aaattgcagt cggactttca ttagatgaaa 4260

tgatgaaccc ggtgacagga aaaacatatg cagcatttga acctgctctt gactatgtcg 4320

tatccaaaat tccgcgctgg ccgtttgata agtttgaatc agcaaacaga aagcttggca 4380

cgcaaatgaa agcgacaggt gaggtcatgg caatcggccg cacgcttgaa gagtcattgc 4440

tgaaggcagt gcgatcactg gaagcggatg tgtatcatct tgaattgaag gacgccgctg 4500

acatttcaga tgagcttctt gaaaagcgaa ttaaaaaggc cggtgatgaa cgcttattct 4560

acttagctga agcgtacaga agaggctaca cggtagaaga cctccatgaa ttttccgcta 4620

tcgatgtctt cttcttgcat aagctgttcg gaatcgtaca gtttgaaaaa gaattgaagg 4680

ccaatgcggg cgatacagat gtgctgagac gggcaaaaga actcggcttc tctgatcagt 4740

acatcagccg tgaatggaaa atgaaagaat ctgagcttta cagcttgaga aaacaagcgg 4800

ggattgcgcc ggtattcaaa atggtagata catgcgcggc ggaatttgag tcagaaacgc 4860

catacttcta tagcacatat gaagaagaaa atgaatctgt cgttacagat aagaaaagtg 4920

tgatggtgct tggttcgggt ccgattcgaa tcggtcaggg tgtcgagttc gactatgcga 4980

cggttcactc tgtatgggca attaaacaag caggctatga agccattatt gtcaacaaca 5040

acccggaaac cgtttcaaca gacttcagca tctcagacaa gctgtatttt gaaccgctta 5100

cgattgaaga tgtcatgcac atcattgacc tcgaacagcc aatgggcgtt gtcgtacaat 5160

ttggcggaca aactgcgatt aaccttgctg acgagctttc tgcacgcgga gtgaaaatcc 5220

ttggaacttc attagaagat ttagaccgtg ccgaagaccg ggataaattt gaacaagcgc 5280

ttggagaact tggtgttcct cagccgcttg gcaaaacagc gacatcagtt aatcaggcgg 5340

taagcatcgc aagtgatatc ggttatccgg tactggtacg cccttcctat gtacttggcg 5400

gccgggcgat ggagattgtt taccatgaag aggaactgct tcattacatg aaaaatgcag 5460

tcaaaatcaa tccacagcac cctgtattaa ttgatagata cttgaccgga aaagaaattg 5520

aagtcgatgc agtatccgac ggtgaaacag tcgtcattcc gggaattatg gagcacattg 5580

aacgtgcggg cgttcactcc ggagactcaa tcgctgttta tccgcctcag tctctcacag 5640

aggacattaa gaaaaaaatt gaacaataca cgatcgcatt ggctaaaggg ctgaatattg 5700

tcggtttgct caatattcaa ttcgtcttgt cgcaaggcga ggtgtacgtg ctagaagtga 5760

atccgagatc aagcagaacc gtaccgtttt taagcaaaat tacgggtatc ccaatggcga 5820

atctcgcaac aaaaatcatt cttggtcaaa agctggctgc gtttggctat acagagggcc 5880

ttcagcctga acagcaaggt gtatttgtaa aagcgccggt cttctccttt gccaagctga 5940

gaagagtgga tattacgtta gggcctgaaa tgaaatcaac aggtgaagtc atggggaaag 6000

attcgacact tgaaaaggcg ctctacaaag ccttgatcgc ttcaggtatt caaatcccga 6060

actacggttc cgtgctttta acagtagctg ataaggacaa agaagggctt gccattgcta 6120

agcggttcca cgcgatcggc tacaacattt tagcgacgga aggaacggca ggctacctga 6180

aagaagcttc cattccagcg aaggtcgtcg gaaaaatcgg tcaggatggc ccgaacttgc 6240

ttgatgtcat cagaaacgga gaagcgcagt ttgtcatcaa tacgctgaca aaaggaaagc 6300

agccggcaag agacggtttt agaatcagac gtgaatcagt agaaaatggt gttgcctgcc 6360

taacatcttt agatacggca gaggcgatat tgcgagtgct ggaaagcatg acattccgtg 6420

ctgatcaaat gccggcagtc aacacaaatc aggaggcggc agtcactata tgaaaaaagc 6480

gtatttgaca gtatgttcta accagcaaat tgcagaccgg gtgtttcaaa tggttctgaa 6540

aggggagctt gtccaagggt ttacaacccc tggacagttc cttcatctta aagtgagcga 6600

agcggttacg cctcttttga gaaggccgat cagcatcgca gacgtcaact ttgaaaaaaa 6660

tgaagtcacc atcatttatc gggtagatgg ggaagggaca agactcttgt cactgaagca 6720

gcagggagaa cttgtggatg tcctcgggcc tttgggaaat ggctttcctg ttaatgaagt 6780

tcaacccgga aagacggctt tgctggtagg aggcggagta ggtgtgccgc ctctccaaga 6840

gctgtcgaaa cgcttgattg aaaaaggggt aaatgtcatc cacgttttag gattccaatc 6900

ggcaaaggat gttttttacg aggaagaatg ccggcagtac ggagacacgt atgtggcaac 6960

agctgacgga agctacgggg aaaccggatt tgtcacagat gtgattaaac ggaaaaagct 7020

agagtttgat atcctcctca gctgcgggcc gacaccgatg ctcaaggcgt taaaacagga 7080

atatgcccat aaagaagtat atctgtccat ggaggaacga atgggctgcg gaatcggcgc 7140

atgcttcgcg tgtgtgtgcc atacaaacga aagtgagaca tcctatgtaa aagtatgtct 7200

cgacgggcct gtatttaaag ctcaggaggt ggcgctgtaa tgctagaggt gaaattgccg 7260

ggacttgatt tgaaaaaccc aatcattcct gcatcaggct gcttcggttt tggaaaagaa 7320

ttttcacgtt tttatgattt gtcttgtctt ggagctatca tgattaaggc tacgacaaag 7380

gagccgcgct ttgggaatcc gacgccgcgg gtagctgaga ctggtgctgg aatgctcaat 7440

gcgatcggtc tccaaaatcc ggggctggat agtgtgttgc atcatgagct gccgtggctt 7500

gagcagtttg atacaccgat cattgccaat gtcgcaggtt ctcaagtcga tgattatgtt 7560

gaagtcgcag aacatatcag caaagcgcct aatgttcatg ctcttgaatt gaatatttcc 7620

tgcccgaatg tgaaaacagg cggaatcgct tttggcacga atcctgaaat ggctgccgat 7680

ttgacaaaag cggtgaaaga ggtttcggat gtacccgttt atgtgaagct atccccgaac 7740

gtggctaata tcacagaaat tgcattagcg atcgaggaag cgggagcgga cggtcttacg 7800

atgatcaaca cactaatcgg catgagactc gatttaaaaa ccggcaaacc gatattagcg 7860

aataaaacag ggggactttc gggccctgct gtgaagccgg ttgccattcg catggtgtat 7920

gaagtcagcc agatggtcaa catcccgatt atcggaatgg gaggcgtgca aacggctgaa 7980

gatgccctgg aatttcttct cgcgggagca agcgcagtcg ctgtcggaac agcaaacttt 8040

gtgaatcctt ttgcatgtcc agagattatt gaacagctcc catctgtttt gctccaatac 8100

ggctatcaat caattgaaga atgcatcgga aggagctgga atcatgaaaa acaacctgcc 8160

catcatcgcg cttgattttg cgtcagctga agaaacactt gcgttcttag cgccttttca 8220

gcaagaaccg ttatttgtaa aggttgggat ggagcttttt tatcaagaag ggccatctat 8280

cgtgaaacaa ctaaaagaaa gaaactgcga gctattttta gatctaaagc ttcatgacat 8340

cccgactact gtaaacaaag cgatgaagcg ccttgccagt cttggagtag acctcgtcaa 8400

tgttcatgct gccgggggca aaaaaatgat gcaggcagct ctcgaaggct tagaagaagg 8460

tacgccggct ggaaaaaaac gtccgtcact tatcgcggta acccagctga caagcacatc 8520

tgaacaaatc atgaaagatg aactgctgat cgaaaagtct ctgattgata cggttgtgca 8580

ctacagcaaa caggcggaag aaagcggact ggatggagtg gtctgctctg ttcatgaagc 8640

aaaagccatt taccaagcgg tgtcgccttc atttctgact gtcactccgg ggatcagaat 8700

gtcagaggac gctgcgaatg accaagttcg cgtagcgacg cctgccattg caagagagaa 8760

aggttcatca gcgattgtag taggacgctc gattacaaaa gcggaagacc cggtaaaagc 8820

ctataaggct gtcagacttg aatgggaggg aatcaaatct tgaaacaaat catcgcaaaa 8880

catctattag acatccaagc tgtattttta cgcccgaacg agccgttcac atgggcaagc 8940

ggcattttat caccgatcta ctgtgacaac cgccttacgc tatctttccc agaggtcaga 9000

aacgatgttg cttcaggtat cagcaagctt gttaaagagc attttcctga agctgaaatg 9060

attgcgggaa cagcaactgc cggtattcct catgctgctc ttgcggcgga ccatttgaat 9120

cttccgatgt gttatgtgag gagcaagccg aaggcgcacg gaaaaggcaa tcagattgag 9180

ggagctgtgc aagaagggca aaaaacagtc gtcattgaag acttaatttc cacaggaggc 9240

agcgtgcttg aagcttgtgc agctttacaa gcggccggct gtgaagtgct tggtgtcgtc 9300

tcaatcttta cgtacggact tcctaaagcg gaggaagcct tcgcaaaggc agaactgcca 9360

tactactcat taaccgatta tgatacgctc acagaggtcg cgcttgaaaa cggaaatatt 9420

cattcagatg atctaaaaaa gctgcaaaca tggaaacgaa atcccgagtc aaaagattgg 9480

tttaaaaaat aa 9492

<210> 2

<211> 74

<212> DNA

<213> E. coli W3110

<400> 2

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60

acaggaaaca gacc 74

<210> 3

<211> 948

<212> DNA

<213> E. coli W3110

<400> 3

gtgcctgata tgaagctttt tgctggtaac gccaccccgg aactagcaca acgtattgcc 60

aaccgcctgt acacttcact cggcgacgcc gctgtaggtc gctttagcga tggcgaagtc 120

agcgtacaaa ttaatgaaaa tgtacgcggt ggtgatattt tcatcatcca gtccacttgt 180

gcccctacta acgacaacct gatggaatta gtcgttatgg ttgatgccct gcgtcgtgct 240

tccgcaggtc gtatcaccgc tgttatcccc tactttggct atgcgcgcca ggaccgtcgc 300

gtccgttccg ctcgtgtacc aatcactgcg aaagtggttg cagacttcct ctccagcgtc 360

ggtgttgacc gtgtgctgac agtggatctg cacgctgaac agattcaggg tttcttcgac 420

gttccggttg ataacgtatt tggtagcccg atcctgctgg aagacatgct gcagctgaat 480

ctggataacc caattgtggt ttctccggac atcggcggcg ttgtgcgtgc ccgcgctatc 540

gctaagctgc tgaacgatac cgatatggca atcatcgaca aacgtcgtcc gcgtgcgaac 600

gtttcacagg tgatgcatat catcggtgac gttgcaggtc gtgactgcgt actggtcgat 660

gatatgatcg acactggcgg tacgctgtgt aaagctgctg aagctctgaa agaacgtggt 720

gctaaacgtg tatttgcgta cgcgactcac ccgatcttct ctggcaacgc ggcgaacaac 780

ctgcgtaact ctgtaattga tgaagtcgtt gtctgcgata ccattccgct gagcgatgaa 840

atcaaatcac tgccgaacgt gcgtactctg accctgtcag gtatgctggc cgaagcgatt 900

cgtcgtatca gcaacgaaga atcgatctct gccatgttcg aacactaa 948

Claims (9)

1.一种高产尿苷的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上整合了核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE，并由强启动子P_trc启动；在基因组上对其自身的PRPP合成酶编码基因prsA进行双拷贝，并由强启动子P_trc启动；同时缺失尿苷激酶、尿苷磷酸化酶和核苷水解酶活性；缺失高丝氨酸脱氢酶1活性；缺失鸟氨酸氨甲酰转移酶活性。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上，将核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE整合在假基因yghX位点处；将udk、udp、rihA、rihB和rihC五个基因敲除；构建启动子P_trc和prsA基因的连接片段P_trc-prsA，并将其整合在trpR基因位点；将thrA基因敲除；将argF基因敲除。

3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli W3110。

4.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述嘧啶核苷操纵子来源于B.subtilis CGMCC No.11775。

5.一种高产尿苷的基因工程菌的构建方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110进行定向改造，包括如下步骤：

(1)在E.coli W3110中重构尿苷合成代谢途径：在E.coli W3110的基因组上，按顺序依次将来源于B.subtilis CGMCC No.11775的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE整合在假基因yghX位点处；

(2)将udk、udp、rihA、rihB和rihC五个基因依次敲除，阻断尿苷的降解；

(3)构建启动子P_trc和prsA基因的连接片段P_trc-prsA，并将其整合在trpR基因位点，促进前体物PRPP的积累；

(4)将thrA基因敲除，减弱前体物天冬氨酸的支路代谢；

(5)将argF基因敲除，减弱前体物氨甲酰磷酸的支路代谢。

6.权利要求1-4任一项所述的基因工程菌在生产尿苷中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，包括：

将权利要求1-3任一基因工程菌活化后制备种子液；

采用摇瓶发酵：按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中，终体积为30mL，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期24-30h；

或，采用发酵罐发酵：按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期40-70h。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述摇瓶发酵的发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-3g/L，KH₂PO₄ 1-3g/L，MgSO₄·7H₂O 1-2g/L，酵母提取物0.1-0.3g/L，玉米浆1-2mL/L，FeSO₄·7H₂O 80-100mg/L，MnSO₄·7H₂O 80-100mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述发酵罐发酵的发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，FeSO₄·7H₂O 80-100mg/L，MnSO₄·H₂O 80-100mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各0.5-2mg/L，苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸各50-200mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。