CN108129566B

CN108129566B - 靶向间皮素的c-型单域抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN108129566B
Application number: CN201711496467.XA
Authority: CN
Inventors: 龚睿; 曹广灿; 杨文娟; 石剑; 李璇; 杨春鹏; 张哲�
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2017-12-31
Filing date: 2017-12-31
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2037-12-31
Also published as: CN108129566A

Abstract

本发明公开了一种靶向间皮素的高亲和力C‑型单域抗体及其制备方法与应用。本发明是以人抗体IgG恒定区CH2结构域的突变体m01s为骨架，构建多肽文库，再以间皮素为抗原筛选获得，该类抗体分子量较小，相对于全长单抗，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力，用于治疗和诊断一些间皮素高表达的肿瘤(如卵巢腺癌)，甚至能够开发成口服药；其次，它的血浆半衰期可能达到10个小时；最后，可在原核表达***进行表达，生产成本低、周期短。而由本发明从该类抗体中筛选出的F3针对间皮素高表达的卵巢腺癌细胞OVCAR‑3具有较好的抑制作用，应用前景好。

Description

靶向间皮素的C-型单域抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种靶向间皮素的高亲和力C-型单域抗体及其制备方法与应用。

背景技术

间皮素(mesothelin,MSLN)是近年来新发现的一种肿瘤分化抗原。其前体是糖磷脂酰基醇(GPI)锚定的、糖基化的细胞表面蛋白，可被furin蛋白酶水解为31kD的N-末端分泌型蛋白和40kD的C-末端蛋白，后者主要以膜结合的GPI锚定的形式存在，有限分布于正常间皮细胞及表面上皮细胞，故命名为间皮素。间皮素在正常组织中有限表达，某些肿瘤中高表达：如胰腺癌(100％病例)、卵巢腺癌(70％的病例)、肺腺癌(50％的病例)和恶性间皮瘤(100％的病例)等。间皮素诱导肿瘤发生的机制可能包括以下三个方面：第一，间皮素可以通过与粘蛋白MUC16(即CA125)相互作用而促进肿瘤细胞的腹膜种植和转移；第二，间皮素能通过NF-κB信号通路促进肿瘤细胞的存活和增殖；最后，间皮素的表达会增强肿瘤细胞对某些特定的药物(如：TNF-α、紫杉醇、铂-环磷酰胺复合物)的耐受能力(Tang Z,et al.,Anticancer Agents Med Chem.,2013)。

由此可见，间皮素是一个用于肿瘤治疗的理想靶标。目前，有几种针对抗间皮素的候选药物在进行临床试验，包括抗间皮素抗体偶联免疫毒素、高亲和力鼠/人嵌合抗间皮素抗体和抗间皮素抗体偶联药物以及针对间皮素的肿瘤疫苗、T细胞过继免疫治疗等。

在抗体的研究过程中，人们发现全长抗体的分子量较大(～150kD)，使它们的组织渗透性较差，也难以结合一些空间上有位阻效应的关键表位，从而影响活性。解决的策略之一是将全长抗体进行小型化，由此开发了一系列具有结合功能的抗体片段：如Fab(50-60kD)、单链抗体(scFv，20-30kD)、重链可变区抗体(VH，12-15kD)(单域抗体)等小型化抗体。这些抗体片段相对于全长单抗，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力。

然而，无论是Fab，scFv还是VH，由于它们都缺少Fc段，从而无法和Fc受体(比如neonatal Fc receptor，FcRn)等相结合。目前观点认为IgG在体内具有很长半衰期(一周到数周)的原因是IgG可以通过Fc段在酸性pH(pH 6.0)和FcRn结合，在中性pH(pH7.4)被释放(该结合称为pH依赖的结合)，从而完成其循环再生的过程。由于缺少这种结合，Fab、scFv和VH在体内的半衰期通常只有几分钟到几十分钟，这就限制了它们进一步的应用。因此需要继续研发分子量小，血浆半衰期长的骨架用于抗体库的构建和针对特异抗原的筛选。

最近，一种新的基于抗体Fc段CH2结构域的骨架被认为有希望研发新型的单域抗体，称为C-型单域抗体。CH2(～12kDa)的结构(PDB：1HZH)(Prabakaran P,et al.,ActaCrystallogr D Biol Crystallogr.,2008)与VH相似，主要由七个β-折叠(A到G)所组成，由三个loop和两个α-helix所连接，并含有一对天然的二硫键。三个loop区与VH的三个互补决定区(complementarity determining region,CDR)相似，可以引入突变而进行抗体库的构建。由于是Fc的一部分，CH2含有的Fc与Fc受体(如neonatal Fc receptor，FcRn)等的部分结合位点。经过改造后的CH2骨架，就有可能和FcRn相互结合。基于这种CH2骨架筛选到的C-型单域抗体会具有双效价：既能够结合抗原，又能够结合如FcRn等分子(延长血浆半衰期)，从而实现(或部分实现)全长抗体的功能。这也是CH2骨架相比其它分子量相似的骨架(如VH)的主要优势。

CH2的稳定性较弱，需要进行优化。通过引入一对二硫键得到一个CH2的突变体m01，相对CH2，其Tm值提高近20℃(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2009)；通过截去CH2的N-端的七个处于无规则状态的氨基酸，得到一个截短的突变体CH2s，相对CH2，CH2s的抗聚集能力得到显著提高(Gong R,et al.,Mol Pharm.,2013)。将这两者结合之后得到一个新的突变体m01s(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2011)(图1)，它的Tm值比CH2的Tm值高30℃，具有更好的可溶表达与蛋白酶抗性。更为重要的是，相对于CH2，m01s具有更好的依赖于pH的与人FcRn的结合能力，在不同动物模型中的血浆半衰期可达10小时左右，远远长于与其分子量相似的其它结构域(如VH的血浆半衰期仅有几分钟)(Gehlsen K,et al.,MAbs,2012)。因此，m01s可以作为一个理想的骨架用于抗体库的构建和筛选。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向间皮素的高亲和力C-型单域抗体及其制备方法与应用，该C-型单域抗体经ELISA、流式细胞分析验证，能够与筛选所用抗原间皮素及细胞表面的间皮素相结合；对间皮素高表达的癌细胞增殖具有直接抑制作用。

为实现上述目的，本发明提供了一种靶向间皮素的高亲和力C-型单域抗体，它是以人抗体IgG恒定区CH2结构域的突变体m01s为骨架，构建多肽及蛋白质文库，再以间皮素为抗原筛选获得。

上述方案中，能够实现抗体筛选的多肽及蛋白质文库都可以用于本发明，如酵母展示文库等，在现有技术中，优选采用噬菌体展示文库。

优选地，所述C-型单域抗体为F3，它拥有BC、DE、FG三个loop区，所述Loop BC的氨基酸序列为Seq ID No.1，所述Loop DE的氨基酸序列为seq ID No.3，所述Loop FG的氨基酸序列为Seq ID No.5。

可选地，所述F3的编码Loop BC的基因序列为seq ID No.2，编码Loop DE的基因序列为Seq ID No.4，编码Loop FG的基因序列为Seq ID No.6。

优选地，所述F3的氨基酸全长序列为Seq ID No.7。

可选地，所述F3的基因全长序列为Seq ID No.8。

可选地，对F3除loop以外的区域进行碱基和氨基酸的突变，所获得的与F3功能类似抗体应属于本发明的范畴。相对于F3的核心功能loop区，其他区域是作为骨架连接和折叠作用，简单的突变且对F3的功能无实质性影响，应视为和本发明相同。

本发明还提供了上述靶向间皮素的高亲和力C-型单域抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建含有间皮素基因序列的真核表达载体，转染哺乳动物细胞，表达间皮素，分离纯化得到间皮素；

(2)从以m01s为骨架的噬菌体展示库中，用纯化的间皮素为抗原进行筛选，数轮过后，得到一个高亲和力的特异性结合的克隆；

(3)表达纯化该克隆，得到靶向间皮素的高亲和力C-型单域抗体。

本发明还揭示了上述靶向间皮素的高亲和力C-型单域抗体，在制备高表达间皮素肿瘤细胞的抑制剂中的应用；或在制备高表达间皮素肿瘤细胞检测试剂中的应用，如制备为检测探针。

在上述应用中包括将所述C-型单域抗体制备成含有该抗体的各种蛋白及基于该抗体的衍生物(比如偶联其它分子)等，再如制备成融合抗体或偶联抗体；融合抗体为本发明抗体和数个氨基酸的肽段到蛋白质的融合，包括但不仅限于自身、抗体的Fc段的融合后得到；偶联抗体包括但不仅限于本发明抗体与放射性同位素、毒素偶联后得到。

本发明的有益效果：通过从m01s为骨架的噬菌体展示库中，以哺乳细胞表达的间皮素为抗原，筛选得到了一种靶向间皮素的高亲和力C-型单域抗体；首先，相对于全长单抗(分子量～150kD)，该类抗体分子量较小，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力，用于治疗和诊断一些间皮素高表达的肿瘤(如卵巢腺癌)，甚至能够开发成口服药；其次，因其所基于的m01s骨架具有与FcRn的结合能力，它的血浆半衰期也可能达到10个小时，这就远长于基于V_H等其它骨架的单域抗体的血浆半衰期(一般是几分钟到十几分钟)；其三，可在原核表达***进行表达，生产成本低、周期短。而由本发明从该类抗体中筛选出的F3针对间皮素高表达的卵巢腺癌细胞OVCAR-3具有较好的抑制作用，应用前景好。

附图说明

图1为人抗体IgG的CH2结构域的突变体m01s的结构示意图。

图2为纯化的间皮素的SDS电泳图。

图3为纯化的C-型单域抗体F3的SDS电泳图。

图4为ELISA测定的F3和间皮素结合的剂量反应曲线。

图5为ELISA测定的F3、F3-1、F3-2和间皮素结合的剂量反应曲线。

图6为流式细胞分析检测F3与OVCAR-3细胞表面表达的间皮素结合的流式图。

图7为CCK8法检测F3对OVCAR-3细胞增殖的活性抑制效果对比图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：克隆间皮素的基因

在培养细胞的6孔板中接种约2×10⁶个人卵巢癌细胞OVCAR-3，培养12～16h，细胞长成单层。移除培养基，用Trizol Reagent(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，得到的细胞总RNA溶解于50μL无RNA酶的水中。然后用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)，采用随机引物，逆转录得到cDNA。

根据间皮素的基因序列(GenBank No.AY743922)，分析其氨基酸序列，设计间皮素基因的正、反向引物扩增间皮素多肽的胞外域(氨基酸296-600)(Feng Y,et al.,MolCancer Ther.,2009)：正向引物GGAATTCTG GAAGTGGAGAAGACAGC(横线标注为EcoR I酶切位点)；反向引物CGAGCCGTCCCCGAGAGG(1)、CCGCTCGAGCCGTCCCC(2)(横线标注为Xho I酶切位点)。先用正向引物与反向引物1以cDNA为模板进行PCR，得到间皮素基因片段，再用正向引物与反向引物2以间皮素基因片段为模板进行PCR，从而得到含有EcoR I和Xho I酶切位点的间皮素基因片段。

琼脂糖凝胶电泳回收间皮素基因片段，用EcoR I和XhoI双酶切间皮素基因和载体pSecTag2A，回收后将间皮素基因与载体pSecTag2A连接、转化，构建载体pSecTag2A-MSLN，从测序鉴定序列正确的克隆中提质粒用于后续实验。

实施例2：表达并纯化间皮素

转染前1天将293F细胞(控制细胞密度为5×10⁵个/ml)接种培养40mL的细胞液，在37℃，8％CO₂，135r/min的恒温培养箱中培养过夜。取40μg质粒置于14mL的Falcon管中。加入4mLD-PBS，轻轻混匀3次，每隔6秒混一次。加入60μL(2mg/mL)PEI，按上述方法混匀。将混合物室温静置20-30min，一滴一滴加入细胞中，使混合物与细胞尽量充分接触。将已转染质粒的细胞，置于37℃，8％CO₂，135r/min的恒温培养箱中培养。

观察细胞样品，并收取转染24h，48h，72h，96h，120h的细胞样品，用鼠源anti-His作为一抗(所用载体在所表达蛋白的C端提供6×His Tag标签用于检测)通过蛋白免疫印迹(Western Blot)检测间皮素的表达。

检测到293F细胞转染pSecTag2A-MSLN后表达间皮素后，扩大细胞培养与转染规模，大量表达间皮素蛋白。收集培养基上清，用Ni-NTA填料(GE公司)纯化间皮素，随后用截留分子量为10kD的超滤离心管(Merck Millipore公司)超滤浓缩间皮素，经SDS-PAGE验证其纯度，结果如图2所示，泳道1为间皮素。

实施例3：噬菌体展示库的构建以筛选

m01s是人抗体IgG的CH2结构域的突变体，相对于CH2，它的N-末端的七个氨基酸被截短以增强抗聚集能力，与FcRn的pH依赖的结合增强；除了本身的二硫键(Nativedisulfide bond)外，还含有一对人工的二硫键(Engineered disulfide bond)以增强稳定性。m01s所含的三个loop区分别是Loop BC，Loop DE和Loop FG，它们可以用来引入突变从而构建抗体库。

以m01s为骨架(其基因序列为Seq ID No.10、氨基酸序列为Seq ID No.9)，按照已有文献(Gong R,et al.,PLoS ONE,2012)的方法构建噬菌体库，以哺乳动物细胞表达的间皮素为抗原进行了筛选，经过4轮筛选，得到一个富集的克隆，命名为F3。

经过测序，F3的氨基酸全长序列为：Seq ID No.7，其编码DNA全长序列为：Seq IDNo.8；

F3与m01s的氨基酸序列在3个loop区有所差异，F3的三个loop区中，Loop BC的氨基酸序列为Seq ID No.1，基因序列为Seq ID No.2；编码Loop DE的氨基酸序列为Seq IDNo.3，基因序列为Seq ID No.4；编码Loop FG的氨基酸序列为Seq ID No.5，基因序列为SeqID No.6。

实施例4：F3的表达纯化

按照已有文献(Gong R,et al.,Methods Mol Biol.,2012)对F3进行表达和纯化。构建原核F3表达载体，转化入E.coli HB2151中。再接种菌种于含100μg/ml氨苄的SB培养基(1L培养基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和10g MOPS，pH值用NaOH调至7.0)中，待OD₆₀₀达到0.7～1.0时加入IPTG至终浓度为200μg/ml，于37℃、220rpm的条件下进行诱导表达14～16h。4℃、6000rpm、15min离心收集菌体，弃培养基，沉淀重悬于Buffer A(50mM Tris-HCL，450mM NaCL，pH 8.0)中，再经多粘菌素B(polymyxin B)处理1小时后离心收集上清。用Ni-NTA树脂(QIAGEN公司)纯化F3，经SDS-PAGE验证其纯度，如图3所示。随后用截留分子量为3kD的超滤离心管(Merck Millipore公司)超滤浓缩F3。所得到的F3的C-末端含6×His标签和FLAG标签。

实施例5：ELISA测定F3和间皮素的结合

将间皮素(2μg/mL)包被在ELISA板上，4℃孵育过夜后用PBS+3％milk于37℃封闭1h。加入系列稀释的F3，37℃孵育2小时后用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗四次，再加辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗FLAG单克隆抗体于37℃孵育1小时后，用PBST洗四次，再加入ABTS进行检测。骨架m01s作为阴性对照。如图4所示，F3和间皮素结合的EC₅₀为26nM，m01s不能和间皮素结合。

与现有中国发明授权专利“CN201310667427.2一种抗间皮素的纳米抗体及其编码基因和该纳米抗体的用途”相比，现有技术中公开的间皮素抗体的EC₅₀为273nM，本发明抗体的结合活性要高得多。

实施例6：ELISA测定F3、F3-1、F3-2和间皮素的结合

重复实验例5的过程，仅将F3替换为F3-1和F3-2。

F3-1为采用了m01(引入一对二硫键得到的CH2突变体)为骨架的抗体，和F3的区别在于没有截去N-末端的七个氨基酸；其氨基酸和DNA序列分别为：Seq ID No.11和12。

F3-2为采用了CH2为骨架的抗体，和F3的区别在于没有截去N-末端的七个氨基酸，也没有引入人工二硫键；其氨基酸和DNA序列分别为：Seq ID No.13和14。

F3-1和F3-2可以采用DNA人工合成后再表达方式得到，制备方法为现有技术，不做赘述。

实验结果如图5所示，F3-1和F3-2的结合活性远不如F3，在研究中，发明人发现F3-1的抗聚集性要大大弱于F3，而F3-2的骨架不稳定。

实施例7：流式细胞分析检测F3与OVCAR-3细胞表面表达的间皮素的结合

取OVCAR-3细胞(约1×10⁶个)，与F3在37℃孵育2小时，PBSA、PBS分别清洗3次后加入鼠抗FLAG单克隆抗体，37℃孵育1小时。用PBSA、PBS分别清洗3次后加入荧光二抗(TexasRed偶联的羊抗鼠IgG)，于37℃孵育1h后，再用PBSA、PBS分别清洗洗3次后于在流式细胞仪上进行分析。以m01s(骨架)作为阴性对照。结果如图6所示，证明F3能够结合高表达间皮素细胞(人卵巢腺癌细胞OVCAR-3)的表面。

实施例8：CCK8法检测F3对OVCAR-3细胞增殖的抑制活性

将100μL的OVCAR-3(1×10⁴个/孔)细胞接种96孔板，放置培养箱(37℃，5％CO₂)中培养16-18h。加入不同浓度的F3蛋白溶液作为实验组，以正常培养的细胞(含有培养基，无蛋白)作为对照组(PBS)，骨架m01s作为阴性对照，每组设3个平行对照。培养24h、48H和72h后，分别弃除培养孔中的培养液，每孔加入100μL细胞培养液和10μL CCK-8试剂，置于培养箱内孵育1h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，即A450。根据测定的A450，按照公式计算细胞存活率，从而间接反映候选克隆对于肿瘤细胞增殖的抑制活性，结果如图7所示，F3对间皮素高表达细胞系(如OVCAR-3)具有直接抑制作用。

序列表

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 靶向间皮素的高亲和力C-型单域抗体及其制备方法与应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> F3 Loop BC

<400> 1

Asp Tyr Tyr Tyr His Ala Ser Pro Ile Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> F3 Loop BC

<400> 2

gattattact accacgctag tcctattgct 30

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> F3 Loop DE

<400> 3

Tyr Asp Tyr Asn Ser Tyr

1 5

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> F3 Loop DE

<400> 4

tacgattaca actcctat 18

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> F3 Loop FG

<400> 5

Ser Thr Ile His Ser Asn Thr His Ile Ser Ile Pro

1 5 10

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> F3 Loop FG

<400> 6

tccaccattc atagcaatac ccatatcagt attccc 36

<210> 7

<211> 108

<212> PRT

<213> F3

<400> 7

Pro Ser Val Leu Cys Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

1 5 10 15

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Lys Asp Tyr Tyr Tyr His

20 25 30

Ala Ser Pro Ile Ala Lys Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Asp Asp Tyr Asp Tyr Asn Ser Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Lys Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

65 70 75 80

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Thr Ile His Ser Asn Thr His Ile

85 90 95

Ser Ile Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105

<210> 8

<211> 324

<212> DNA

<213> F3

<400> 8

ccgtcagtct tgtgcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60

gaggtcacat gcgtggtgaa agattattac taccacgcta gtcctattgc taagttcaaa 120

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga tgattacgat 180

tacaactcct atcgtgtggt cagcaaactc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 240

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaccatt catagcaata cccatatcag tattcccatc 300

gagtgcacca tctccaaagc caaa 324

<210> 9

<211> 103

<212> PRT

<213> m01s

<400> 9

Pro Ser Val Phe Cys Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

1 5 10 15

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

20 25 30

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

35 40 45

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

50 55 60

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

85 90 95

Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100

<210> 10

<211> 309

<212> DNA

<213> m01s

<400> 10

ccgtcagtct tctgcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 120

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 240

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagtg caccatctcc 300

aaagccaaa 309

<210> 11

<211> 115

<212> PRT

<213> F3-1

<400> 11

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Cys Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Lys Asp Tyr Tyr Tyr His Ala Ser Pro Ile Ala Lys Phe Lys Trp

35 40 45

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Asp

50 55 60

Asp Tyr Asp Tyr Asn Ser Tyr Arg Val Val Ser Lys Leu Thr Val Leu

65 70 75 80

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Thr

85 90 95

Ile His Ser Asn Thr His Ile Ser Ile Pro Ile Glu Cys Thr Ile Ser

100 105 110

Lys Ala Lys

115

<210> 12

<211> 345

<212> DNA

<213> F3-1

<400> 12

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttgtgcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtga aagattatta ctaccacgct 120

agtcctattg ctaagttcaa atggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 180

aagccgcggg atgattacga ttacaactcc tatcgtgtgg tcagcaaact caccgtcctg 240

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaccat tcatagcaat 300

acccatatca gtattcccat cgagtgcacc atctccaaag ccaaa 345

<210> 13

<211> 115

<212> PRT

<213> F3-2

<400> 13

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Lys Asp Tyr Tyr Tyr His Ala Ser Pro Ile Ala Lys Phe Lys Trp

35 40 45

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Asp

50 55 60

Asp Tyr Asp Tyr Asn Ser Tyr Arg Val Val Ser Lys Leu Thr Val Leu

65 70 75 80

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Thr

85 90 95

Ile His Ser Asn Thr His Ile Ser Ile Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

100 105 110

Lys Ala Lys

115

<210> 14

<211> 345

<212> DNA

<213> F3-2

<400> 14

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttgctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtga aagattatta ctaccacgct 120

agtcctattg ctaagttcaa atggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 180

aagccgcggg atgattacga ttacaactcc tatcgtgtgg tcagcaaact caccgtcctg 240

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaccat tcatagcaat 300

acccatatca gtattcccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaa 345

Claims

1.一种靶向间皮素的C-型单域抗体，其氨基酸全长序列为Seq ID No.7。

2.权利要求1所述靶向间皮素的C-型单域抗体的应用，将所述C-型单域抗体制备成含有该抗体的蛋白及基于该抗体的衍生物。