CN108103204B - 基于多重PCR及二代测序的Rh血型分型方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多重PCR及二代测序的Rh血型分型方法及装置。由于RHD及RHCE基因相似性极高，在扩增子比对到人类基因组参考序列时，容易出现错误比对的问题，本发明在比对前将多重PCR引物序列剪切去除，能够提高序列匹配精确度，避免了比对错误引起的分型结果误判，大大的提高了RH血型分型的准确率，避免了假阳性结果的出现。
Description
技术领域
本发明属于生物信息学领域，具体涉及一种基于多重PCR和二代测序的Rh血型分型方法及装置。
背景技术
目前，被国际输血协会(ISBT)确认的29个红细胞血型***中最具多态性和复杂性的血型***即是Rh血型***。传统上认为Rh血型***在临床中的重要性仅次于ABO血型***，Rh血型与溶血性输血反应、新生儿溶血病、自体免疫溶血性贫血相关，Rh血型检测已成为器官移植以及异体输血等的必备检测项目。
RHD是Rh血型***中最为重要的血型表型，根据红细胞表面是否含有D抗原将Rh血型分为Rh阳性和Rh阴性，其中Rh阳性有多种变异型，包括弱D(weak D)、部分D(partial D)、放散D(Del D)等，这些变异型的红细胞表面存在不完全的或变异的RhD抗原，若输注给阴性个体，则可能刺激产生抗体，导致溶血性输血反应。对于Rh阳性变异型个体，其作为受血者，只能输入RhD阴性血，作为输血者，只能供RhD阳性个体使用。
普遍使用的血清学检测方法并不能实现准确的Rh血型分型，常常存在假阴性的情况，输血者承担着很大的致病风险，近年来，基因检测开始逐步应用于Rh血型检测中。RH基因位于染色体1p34-36.9上，由RHD和RHCE两个紧密连锁的基因构成，主要抗原有D，C，c，E，e；RHD编码D抗原，RHCE编码C，c，E，e抗原。RHD及RHCE基因结构相似，同源性高达97％，各由10个外显子，9个内含子组成，其基因全长分别为57295bp和57831bp，二者方向相反，以3’端相邻，之间含有1个功能未知的小膜1基因(small membrane protein 1，SMP1)，长约30kb，编码一种18kD的膜蛋白(SMP1分子)。由于RHD及RHCE基因的相似度极高，基于多重PCR和二代测序的RH血型分型分析时往往会存在误判的情况，导致部分检测结果不准确，尤其容易出现假阳性。为了解决以上问题，开发一种准确率高的Rh血型分型方法和装置，非常有现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于多重PCR和二代测序的Rh血型分型方法及装置。
本发明所采取的技术方案是：
一种基于多重PCR及二代测序的Rh血型分型方法，包括如下步骤：
S1：利用针对RHD基因全外显子设计的多重PCR引物，构建待测样品的扩增子文库，利用二代测序平台对扩增子文库进行测序，获取测序片段序列；
S2：将测序片段序列上的多重PCR引物序列剪切去除；
S3：将步骤S2处理后的测序片段序列与人类基因组参考序列进行序列比对，获得扩增子在RHD和RHCE基因相应位置上的深度信息，判断RHD基因各外显子的缺失信息；
S4：将步骤S2处理后的测序片段序列进行突变位点分析，确定RHD基因的突变信息；
S5：获取步骤S3和S4的处理结果，并进行Rh血型判定：如果RHD基因全外显子缺失，则判定为RH阴性；如果RHD基因部分外显子缺失，则判定为部分D；如果RHD全外显子完整，且RHD基因无突变，则判定为RH阳性；如果RHD全外显子完整，且RHD基因存在突变，则根据突变信息判定突变表型。
作为上述方法的优选，步骤S3中，序列比对后进行过滤，去除短片段、低质量序列、不能完全比对到人类基因组上的序列。
作为上述方法的优选，步骤S3中，判断RHD基因各外显子的缺失信息方法包括：计算各外显子中各扩增子的rate值，其中，rate值＝扩增子在RHD基因上的深度/扩增子在RHCE基因上的深度；当外显子中所含的所有扩增子的rate值均小于设定的rate值阈值，则判定该外显子缺失，其余情况均判定为该外显子未缺失，其中，所述rate值阈值设定选自区间[0.05,0.12]中任意一点。
作为上述方法的优选，步骤S4中，所述突变位点分析采用Life Technologies公司的TVC软件。
作为上述方法的优选，步骤S5中，所述根据突变信息判定突变表型的方法包括：将突变信息用annovar数据库注释，注释结果关联到dbRBC数据库，确定突变表型。
一种基于多重PCR及二代测序的Rh血型分型装置，包括：
测序数据获取单元：用于获取待测样品的扩增子文库在二代测序平台下测得的测序片段序列，所述扩增子文库是利用针对RHD基因全外显子设计的多重PCR引物构建而成；
引物剪切单元：与测序数据获取单元相连，用于将测序片段序列上的多重PCR引物序列剪切去除；
缺失分析单元：与引物剪切单元相连，用于将引物剪切单元处理后的测序片段序列与人类基因组参考序列进行序列比对，获得扩增子在RHD和RHCE基因相应位置上的深度信息，判断RHD基因各外显子的缺失情况；
突变位点检测单元：与引物剪切单元相连，用于将引物剪切单元处理后的测序片段序列进行突变位点分析，确定RHD基因的突变信息；
分型判定单元：与缺失分析单元和突变位点检测单元相连，用于获取缺失分析单元和突变位点检测单元的处理结果，并进行Rh血型判定：如果RHD基因全外显子缺失，则判定为RH阴性；如果RHD基因部分外显子缺失，则判定为部分D；如果RHD全外显子完整，且RHD基因无突变，则判定为RH阳性；如果RHD全外显子完整，且RHD基因存在突变，则根据突变信息判定突变表型。
作为上述装置的优选，所述缺失分析单元中，序列比对后进行过滤，去除短片段，低质量序列、不能完全比对到人类基因组上的序列。
作为上述装置的优选，所述缺失分析单元中，判断RHD基因各外显子的缺失信息包括：计算各外显子中各扩增子的rate值，其中，rate值＝扩增子在RHD基因上的深度/扩增子在RHCE基因上的深度；当外显子中所含的所有扩增子的rate值均小于设定的rate值阈值，则判定该外显子缺失，其余情况均判定为该外显子未缺失，其中，所述rate值阈值设定选自区间[0.05,0.12]中任意一点。
作为上述装置的优选，所述突变位点检测单元中，突变位点分析采用LifeTechnologies公司的TVC软件。
作为上述装置的优选，所述分型判定单元中，根据突变信息判定突变表型包括：将突变信息用annovar数据库注释，注释结果关联到dbRBC数据库，确定突变表型。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种基于多重PCR及二代测序的Rh血型分型方法及装置。由于RHD及RHCE基因相似性极高，在扩增子比对到人类基因组参考序列时，容易出现错误比对的问题，本发明在比对前将多重PCR引物序列剪切去除，能够提高序列匹配精确度，避免了比对错误引起的分型结果误判，大大的提高了RH血型分型的准确率，避免了假阳性的出现。
附图说明
图1：基于多重PCR和二代测序的Rh血型分型方法流程图；
图2：基于多重PCR和二代测序的Rh血型分型装置示意图。
具体实施方式
由于RHD及RHCE基因相似性极高，基于多重PCR基因捕获和二代测序的Rh血型分型分析时，往往会存在误判的情况，造成准确性不高，出现假阳性，为了解决这一问题，发明人发现了错误比对的原因，并有针对性地设计了纠错方案，开发出一种准确率高的Rh血型分型方法和装置。
参照图1，基于多重PCR和二代测序的Rh血型分型方法，包括如下步骤：
S1：利用针对RHD基因全外显子设计的多重PCR引物，构建待测样品的扩增子文库，利用二代测序平台对扩增子文库进行测序，获取测序片段序列。
其中，由于RHD及RHCE基因相似性极高，针对RHD基因全外显子设计的多重PCR引物既能匹配RHD基因，又能匹配RHCE基因，分别扩增得到RHD基因扩增子和RHCE基因扩增子，若RHD基因与RHCE基因上的引物匹配区段序列存在差异，将扩增子比对到人类基因组参考序列时，RHCE扩增子上的差异位点则会干扰比对判定，导致无法准确将RHD基因扩增子和RHCE扩增子比对到各自对应的基因上，容易出现错误比对，从而导致误判；需要说明的是，多重PCR引物设计时，现有技术无法实现设计的引物均与RHD基因和RHCE基因匹配区段序列无差异，因此无法避免上述缺陷。
其中，构建待测样品的扩增子文库采用本领域常规方法，根据所采用的二代测序平台选择相应的文库构建方法，二代测序平台包括但不仅限于Ion Pronton、Ion PGM、Solexa、Roche/454、SOLID。
S2：将测序片段序列上的多重PCR引物序列剪切去除。
其中，剪切去除多重PCR引物的测序片段序列可以正确比对到对应的基因上，大大提高了检测准确性。
S3：将步骤S2处理后的测序片段序列与人类基因组参考序列进行序列比对，获得扩增子在RHD和RHCE基因相应位置上的深度信息，判断RHD基因各外显子的缺失信息。
优选的，序列比对后进行过滤，去除短片段，低质量序列、不能完全比对到人类基因组上的序列；
优选的，判断RHD基因各外显子的缺失信息的方法包括：计算各外显子中各扩增子的rate值，其中，rate值＝扩增子在RHD基因上的深度/扩增子在RHCE基因上的深度；当外显子中所含的所有扩增子的rate值均小于设定的rate值阈值，则判定该外显子缺失，其余情况均判定为该外显子未缺失，其中，所述rate值阈值设定选自区间[0.05,0.12]中任意一点；实施例中，rate值阈值设定为0.1。
S4：将步骤S2处理后的测序片段序列进行突变位点分析，确定RHD基因的突变信息。
其中，突变位点分析采用常规软件或方法完成，作为优选的，采用LifeTechnologies公司提供的Torrent Variant Caller(TVC)软件。
S5：获取步骤S3和S4的处理结果，并进行Rh血型判定：如果RHD基因全外显子缺失，则判定为RH阴性；如果RHD基因部分外显子缺失，则判定为部分D；如果RHD全外显子完整，且RHD基因无突变，则判定为RH阳性；如果RHD全外显子完整，且RHD基因存在突变，则根据突变信息判定突变表型。
作为优选的，突变信息判定突变表型的方法包括：将突变信息用annovar数据库注释，注释结果关联到dbRBC数据库，确定突变表型。
参照图2，基于多重PCR和二代测序的Rh血型分型装置，包括：
测序数据获取单元：用于获取待测样品的扩增子文库在二代测序平台下测得的测序片段序列，所述扩增子文库是利用针对RHD基因全外显子设计的多重PCR引物构建而成。
引物剪切单元：与测序数据获取单元相连，用于将测序片段序列上的多重PCR引物序列剪切去除。
缺失分析单元：与引物剪切单元相连，用于将引物剪切单元处理后的测序片段序列与人类基因组参考序列进行序列比对，获得扩增子在RHD和RHCE基因相应位置上的深度信息，判断RHD基因各外显子的缺失情况。
作为优选的，缺失分析单元中，序列比对后进行过滤，去除短片段，低质量序列、不能完全比对到人类基因组上的序列。
作为优选的，缺失分析单元中，判断RHD基因各外显子的缺失信息包括：计算各外显子中各扩增子的rate值，其中，rate值＝扩增子在RHD基因上的深度/扩增子在RHCE基因上的深度；当外显子中所含的所有扩增子的rate值均小于设定的rate值阈值，则判定该外显子缺失，其余情况均判定为该外显子未缺失，其中，所述rate值阈值设定选自区间[0.05,0.12]中任意一点。
突变位点检测单元：与引物剪切单元相连，用于将引物剪切单元处理后的测序片段序列进行突变位点分析，确定RHD基因的突变信息。
作为优选的，突变位点检测单元中，突变位点分析采用Life Technologies公司的TVC软件。
分型判定单元：与缺失分析单元和突变位点检测单元相连，用于获取缺失分析单元和突变位点检测单元的处理结果，并进行Rh血型判定：如果RHD基因全外显子缺失，则判定为RH阴性；如果RHD基因部分外显子缺失，则判定为部分D；如果RHD全外显子完整，且RHD基因无突变，则判定为RH阳性；如果RHD全外显子完整，且RHD基因存在突变，则根据突变信息判定突变表型。
作为优选的，分型判定单元中，根据突变信息判定突变表型包括：将突变信息用annovar数据库注释，注释结果关联到dbRBC数据库，确定突变表型。
下面结合具体实施例，对本发明作进一步描述，实施例及其说明用于解释本发明，但并不构成对本发明的不当限定。
本实施例对南方医科大学附属南方医院提供的20例待测样品进行Rh血型分型，流程如下：
(1)多重PCR扩增和二代测序
将20例血液样品采用TIANGEN公司的QIAamp MinElute Virus Spin Kit进行核酸提取，获得全基因组DNA，将全基因组DNA为模板，利用针对RHD基因全外显子设计的多重PCR引物(详见表1)进行多重PCR扩增，根据Ion Proton平台，构建扩增子文库，进行上机测序，获取测序片段序列。
表1、多重PCR引物序列
(2)剪切多重PCR引物
自建流程将测序片段序列上的多重PCR引物序列剪切去除，构建相应的Fastq文件。
(3)缺失分析
使用Life Technologies公司提供的tmap套件，将引物剪切后的测序片段序列与人类基因组参考序列(GRCh37/hg19)进行序列比对，将比对结果排序与建立索引，对排序完成的bam文件进行质控信息提取，去除短序列(长度小于30bp)，低质量序列、不能完全比对到人类基因组上的序列，获得扩增子在RHD和RHCE基因相应位置上的深度信息，计算各外显子中各扩增子的rate值，rate值＝扩增子在RHD基因上的深度/扩增子在RHCE基因上的深度；当外显子中所含的所有扩增子的rate值均小于0.1，则判定该外显子缺失，其余情况均判定为该外显子未缺失，从而判断RHD基因各外显子的缺失情况。
(4)突变位点检测
将引物剪切后的测序片段序列利用Life Technologies公司提供的TorrentVariant Caller(TVC)进行变异位点检测，确定RHD基因的突变信息。
(5)分型判定
如果RHD基因全外显子缺失，则判定为RH阴性；如果RHD基因部分外显子缺失，则判定为部分D；如果RHD全外显子完整，且RHD基因无突变，则判定为RH阳性；如果RHD全外显子完整，且RHD基因存在突变，则将RHD基因突变信息用annovar数据库注释，注释结果关联到dbRBC数据库，确定突变表型。
检测结果对比
将实施例中的剪切引物步骤去除，作为对比例，利用qPCR/sanger结果作为对照标准(qPCR检测缺失，sanger检测点突变)，具体检测结果如表2。
表2、20例样本检测结果
以上结果可见，20例样品中对比例检测结果存在5例假阳性错误，利用本发明实施例进行纠错后，检测结果与qPCR结果一致，检测准确率达到100％。
表3、样本001剪切引物前后，比对到RHD基因及RHCE基因各外显子reads数
如表3所示，以样本001为例，剪切引物前，有部分序列比对到RHD基因，该样本结果判定为部分D，具体为RH(D1-3CE4-10)，剪切引物纠错后，序列匹配精确度提高，比对到RHD基因上的序列更少，该样本检测结果为RHD全基因缺失，与qPCR结果一致，实现纠错效果。
表4、样本003剪切引物前后，比对到RHD基因及RHCE基因各外显子reads数
如表4所示，以样本002为例，RHD全外显子完整，引物剪切前后，序列比对到两基因上的数目有稍微的改变，但不影响结果判断。
表5、样本003剪切引物前后，比对到RHD基因及RHCE基因各外显子reads数
如表5所示，以样本003为例，剪切引物前，有部分序列比对到RHD基因，判定外显子EXON2存在，血型分型为部分D，剪切引物后，序列匹配精确度提高，比对到RHD基因上的序列更少，能够准确判定为RHD全基因缺失，与qPCR检测结果一致，实现纠错效果。
序列表
<110> 东莞博奥木华基因科技有限公司
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<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
tcctgtgctc caaatctttt aaca 24
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
tcatgcactc aaaatctatc acg 23
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
tctgcaataa aaatgtttgt tttgc 25
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
tttctctgac tccagtgcct gc 22
Claims (10)
1.一种基于多重PCR及二代测序的Rh血型分型方法，包括如下步骤：
S1：利用针对RHD基因全外显子设计的多重PCR引物，构建待测样品的扩增子文库，利用二代测序平台对扩增子文库进行测序，获取测序片段序列；其中，所述多重PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:34所示；
S2：将测序片段序列上的多重PCR引物序列剪切去除；
S3：将步骤S2处理后的测序片段序列与人类基因组参考序列进行序列比对，获得扩增子在RHD和RHCE基因相应位置上的深度信息，判断RHD基因各外显子的缺失信息；
S4：将步骤S2处理后的测序片段序列进行突变位点分析，确定RHD基因的突变信息；
S5：获取步骤S3和S4的处理结果，并进行Rh血型判定：如果RHD基因全外显子缺失，则判定为RH阴性；如果RHD基因部分外显子缺失，则判定为部分D；如果RHD全外显子完整，且RHD基因无突变，则判定为RH阳性；如果RHD全外显子完整，且RHD基因存在突变，则根据突变信息判定突变表型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S3中，序列比对后进行过滤，去除短片段、低质量序列、不能完全比对到人类基因组上的序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S3中，判断RHD基因各外显子的缺失信息的方法包括：计算各外显子中各扩增子的rate值，其中，rate值＝扩增子在RHD基因上的深度/扩增子在RHCE基因上的深度；当外显子中所含的所有扩增子的rate值均小于设定的rate值阈值，则判定该外显子缺失，其余情况均判定为该外显子未缺失，其中，所述rate值阈值设定选自区间[0.05,0.12]中任意一点。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4中，所述突变位点分析采用LifeTechnologies公司的TVC软件。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5中，所述根据突变信息判定突变表型的方法包括：将突变信息用annovar数据库注释，注释结果关联到dbRBC数据库，确定突变表型。
6.一种基于多重PCR及二代测序的RH血型分型装置，包括：
测序数据获取单元：用于获取待测样品的扩增子文库在二代测序平台下测得的测序片段序列，所述扩增子文库是利用针对RHD基因全外显子设计的多重PCR引物构建而成；其中，所述多重PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:34所示；
引物剪切单元：与测序数据获取单元相连，用于将测序片段序列上的多重PCR引物序列剪切去除；
缺失分析单元：与引物剪切单元相连，用于将引物剪切单元处理后的测序片段序列与人类基因组参考序列进行序列比对，获得扩增子在RHD和RHCE基因相应位置上的深度信息，判断RHD基因各外显子的缺失情况；
突变位点检测单元：与引物剪切单元相连，用于将引物剪切单元处理后的测序片段序列进行突变位点分析，确定RHD基因的突变信息；
分型判定单元：与缺失分析单元和突变位点检测单元相连，用于获取缺失分析单元和突变位点检测单元的处理结果，并进行Rh血型判定：如果RHD基因全外显子缺失，则判定为RH阴性；如果RHD基因部分外显子缺失，则判定为部分D；如果RHD全外显子完整，且RHD基因无突变，则判定为RH阳性；如果RHD全外显子完整，且RHD基因存在突变，则根据突变信息判定突变表型。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于：所述缺失分析单元中，序列比对后进行过滤，去除短片段，低质量序列、不能完全比对到人类基因组上的序列。
8.根据权利要求6所述的装置，其特征在于：所述缺失分析单元中，判断RHD基因各外显子的缺失信息包括：计算各外显子中各扩增子的rate值，其中，rate值＝扩增子在RHD基因上的深度/扩增子在RHCE基因上的深度；当外显子中所含的所有扩增子的rate值均小于设定的rate值阈值，则判定该外显子缺失，其余情况均判定为该外显子未缺失，其中，所述rate值阈值设定选自区间[0.05,0.12]中任意一点。
9.根据权利要求6所述的装置，其特征在于：所述突变位点检测单元中，突变位点分析采用Life Technologies公司的TVC软件。
10.根据权利要求6所述的装置，其特征在于：所述分型判定单元中，根据突变信息判定突变表型包括：将突变信息用annovar数据库注释，注释结果关联到dbRBC数据库，确定突变表型。
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