CN108103088A - 重组GLP-1类似物Fc融合蛋白的优化基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药领域,具体涉及重组GLP‑1类似物Fc融合蛋白的优化基因(简称rGLP‑1‑Fc)及其应用。将带有人源GLP‑1类似物Fc融合基因通过优化,导入质粒,并转染至CHOK1SV GS‑KO细胞,经筛选后,获得稳定、高效表达GLP‑1类似物Fc融合蛋白的阳性CHOK1SV GS‑KO细胞株。本发明构建得到的优化基因在阳性细胞株中分泌表达量有显著增高,分泌的融合蛋白具有更高的生物学活性,可直接作用于GLP‑1受体,亲和力较高。能迅速、高效、持久地降低血糖及糖化血红蛋白,具有改善胰岛β细胞功能、降低血脂、减轻体重、延迟胃排空、增加饱腹感等作用。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域,具体涉及重组GLP-1类似物Fc融合蛋白的优化基因(简称rGLP-1-Fc)及其应用。
背景技术
根据IDF最新数据,2015年全球糖尿病患者数量上升到4.15亿,糖尿病发病率为8.8%,预计到在 2040年全球将有6.42亿糖尿病患者,发病率会上升到10.4%。2015年中国糖尿病(20-79岁)患者数量较2013年增加1120万,达1.096亿,居全球首位,预计到2040年20-79岁的糖尿病患者数量达1.507亿。在大多数国家,糖尿病及其并发症是造成过早死亡的主要原因,50%或更多的糖尿病患者死亡都归因于心血管疾病。2015年因为糖尿病造成死亡的患者(20-79岁)人数高达500万,占所有死亡人数的14.5%,相当于每6秒钟就有一个成年人死于糖尿病。糖尿病患病率在全球的快速增长,已给社会和经济发展带来非常沉重的负担,已经成为影响全球发展的主要危险因素。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)主要是由肠道L细胞所产生肠促胰岛素,促进胰脏β-细胞再生,分泌胰岛素和葡萄糖耐受性,激活cAMP和其耦联的第二信使途径,促进β-细胞蛋白激酶(Akt1和MAPK)的表达并增加其含量,降低细胞凋亡的关键酶caspase-3的活性,从根本上预防和治疗糖尿病,因此GLP-1类似物是糖尿病学里的热门研究对象。据IMS数据统计,2015年6个GLP-1受体激动剂类药物总销售额为39.12 亿美元,占32个降糖药物总销售额的10.37%。分析师预计,GLP-1类似物在5年后的市场将会突破60 亿美元。
目前市场上已有多个GLP-1类似物用于糖尿病的治疗,但由于受到二肽基肽酶IV的降解以及血液的快速清除,导致药物的半衰期偏短,功效得不到长效维持,常用的策略是对GLP-1进行氨基酸突变及Fc 融合化。另外,目前工业界普遍采用DHFR表达***,但MTX持续加压引起外源基因在细胞基因组中的不稳定,不仅造成细胞株缺乏稳定性,同时表达量偏低,现有技术水平GLP-1融合蛋白表达量在1g/L左右或低于1g/L,例如杨懿等人构建的GLP-1-IgG2σFc融合蛋白序列***质粒,转染细胞,最终对GLP-1 融合蛋白的表达量为1g/L(杨懿,万德友,刘蕴慧,等.长效GLP-1-IgG2σFc融合蛋白的真核表达与生物活性鉴定[J].生物技术通讯,2016,27(2):173-177.);在专利(许必雄,郭颀然,冯金梦.一种重组人GLP-1-Fc 融合蛋白:,CN 104327187A[P].2015.)中,GLP-1-Fc融合蛋白的表达量也在1g/L左右;在专利(黄岩山, 杨志愉,徐正学,等.GLP-1类似物融合蛋白及其制备方法和用途:,CN103408669B[P].2016.)中,GLP-1-Fc 融合蛋白的得率仅为10μg/mL。另一方面,对信号肽的选择和优化,也是融合蛋白高效表达的一个主要因素。总的来说,目的基因的构建和优化、合适的表达***的选择以及稳定的细胞株的筛选对于药物研发具有重要意义。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题,提供了一种GLP-1类似物Fc融合蛋白的高效表达方法,包括融合蛋白中信号肽基因的选择和优化,融合蛋白基因的优化,细胞株的构建、单克隆筛选、GLP-1类似物Fc融合蛋白表达、纯化与生物学活性检测,使GLP-1类似物Fc融合蛋白的表达量比现有技术有了明显提高。
为了达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种重组融合蛋白基因,所述重组融合蛋白基因具有A-B结构的基因序列,其中A为信号肽基因,B 为编码GLP-1类似物Fc融合蛋白的基因;所述融合蛋白基因中,信号肽A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1 所示。
进一步的,所述编码GLP-1类似物Fc融合蛋白的基因B的核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示。
进一步的,所述重组融合蛋白基因的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了一种含有上述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列的重组表达载体。
优选的,所述重组表达载体为pXC17.4。
本发明提供了一种含有上述重组表达载体的宿主细胞。
优选的,所述宿主细胞为CHOK1SV GS-KO细胞。
本发明同时还提供了一种生产GLP-1类似物Fc融合蛋白中的方法,包括:将SEQ IDNO.1所示的信号肽基因和SEQ ID NO.2所示的编码GLP-1类似物Fc融合蛋白的基因重组,得到优化后的重组融合蛋白基因;将上述重组融合蛋白基因***表达载体中,得到重组表达载体;将上述重组表达载体进行PvuI线性化,转化宿主细胞,筛选获得阳性宿主菌株;培养阳性宿主菌株,诱导GLP-1类似物Fc融合蛋白的表达,回收并纯化所表达的GLP-1类似物Fc融合蛋白。上述方法中重组表达载体优选为pXC17.4,宿主细胞优选为CHOK1SV GS-KO细胞。
除非另外定义,否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
本发明具有以下有益效果:
通过筛选优化得到信号肽基因序列A和编码GLP-1类似物Fc融合蛋白基因序列B,然后构建GLP-1 类似物Fc融合蛋白重组基因片段,接着导入载体pXC17.4中,再转染至CHOK1SV GS-KO细胞,筛选得到阳性宿主,得到rGLP-1-Fc的表达量达到3.4g/L。分泌的融合蛋白由于Fc形成的二聚体结构可显著加强二聚体GLP-1受体的亲和力,并延长GLP-1的体内半衰期,增强功效。克服了细胞株不稳定及表达量偏低等问题,此外生产的rGLP-1-Fc生物学活性高,对于医学药物开发具有重要的应用价值。
附图说明
图1为重组表达质粒pXC17.4-rGLP-1-Fc的示意图。
图2为稳转库铺板96孔培养后Clone Select Image成像示意图。
图3为克隆半固体培养基后ClonePix2的成像示意图。
图4ClonePix2筛选克隆96孔培养后Clone Select Image成像示意图。
图5为单克隆补料发酵过程中细胞的生长趋势示意图。
图6为单克隆补料发酵过程中细胞的表达量变化示意图。
图7为单克隆补料发酵过程中细胞的葡萄糖和谷氨酸变化示意图。
图8为GLP-1类似物Fc融合蛋白的生物学活性测定结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明,但本发明所保护范围不限于此。
说明:载体pXC17.4和CHOK1SV GS-KO细胞购于瑞士lonza公司;Pool铺半固体培养基购于Jackson ImmunoResearch Laboratories公司;对照Trulicity购于礼来公司。
实施例1重组表达质粒pXC17.4-rGLP-1-Fc的构建
1.重组GLP-1类似物Fc融合蛋白基因(rGLP-1-Fc)的全基因合成
根据文献(Haryadi R,Ho S,Kok Y J,et al.Optimization of Heavy Chain andLight Chain Signal Peptides for High Level Expression of TherapeuticAntibodies in CHO Cells[J].Plos One,2015,10(2):e0116878.)提供的信号肽,通过筛选和优化,得到信号肽A(SEQ ID NO:1,19aa),并根据专利(A·M·维克,R·L·小米利肯,W·格莱斯纳.GLP-1类似物融合蛋白质,CN 1802386B[P].2010.)公布的GLP-1类似物的氨基酸序列(共 275aa),将两个氨基酸序列组合在一起,按照中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)的优化策略,对序列进行优化,对序列的5'端添加HindIII和Kozak序列,对序列3'端添加双终止密码子和EcoRI,得到编码GLP-1 类似物Fc融合蛋白基因B(SEQ ID NO:2),将优化后的信号肽A基因和优化得到的编码GLP-1类似物 Fc融合蛋白基因B进行全基因合成,获得重组融合蛋白基因rGLP-1-Fc。
2.重组表达质粒pXC17.4-rGLP-1-Fc的构建
重组融合蛋白基因rGLP-1-Fc通过HindIII和EcoRII双酶切后,回收rGLP-1-Fc片段的核苷酸序列C (SEQ ID NO.4,903bp),与pXC17.4经HindIII和EcoRI双酶切后回收的载体片段的核苷酸序列D(SEQ ID NO.5,6893bp)进行连接,筛选得到最终重组表达质粒pXC17.4-rGLP-1-Fc(7796bp),结果见图1。利用rGLP-1-Fc基因片段的两端设计引物进行测序,结果显示克隆基因片段与理论一致。
实施例2稳定细胞Pool筛选
1.pXC17.4-rGLP-1-Fc电转化
利用PvuI酶切位点对质粒pXC17.4-rGLP-1-Fc进行线性化,并经过纯化、过滤除菌及无菌检测,获得线性化质粒pXC17.4-rGLP-1-Fc(浓度为0.4ug/uL)。另外准备2×107cells的指数生长期CHOK1SV GS-KO 细胞,加入到两个电击杯中,每个电极杯含有1×107cells细胞,体积为0.7mL,各加入100μL浓度为0.4 ug/uL线性化DNA至电击杯中,按照预设程序(脉冲300V、900μF,电阻∞,指数波,4mm gap)将线性化质粒pXC17.4-rGLP-1-Fc电转染至CHOK1SV GS-KO受体细胞。
2.转染细胞铺96孔板及Pool筛选
将电击后细胞重悬于含200mL CD CHO AGT培养基的1L锥形瓶内,轻轻混匀后,倒入加样槽中,用排枪吸取细胞液至96孔板中,每孔50μL(每孔约5000cells),置于恒温CO2培养箱中,37℃、10%CO2培养;培养1d后,每孔加入150μL CD CHO AGT(含33.3μmol·L-1MSX)培养基进行加压,每孔为一个 Pool,置于37℃,10%CO2静置培养。培养约20天左右,用Clone Select Image成像仪对96孔板进行扫板,得到各孔板的汇合度(见图2)。选择汇合度≥55%且<70%的孔,吸取120μL细胞上清,通过Fortebio 测表达量,同时每孔补入180μL预热的CD CHO AGT培养基。选择表达量≥13ug/mL、相对表达量≥22的 24个Pool转24孔板进行扩培。
3.Pool扩大培养及批培养筛选
在24孔板培养3~4天后,将Pool全部转移至6孔板继续扩大培养,培养3~4天后,24个Pool全部参与6孔板批培养,培养7天后Fortebio测定表达量,同时计算SPR(单位pg·d-1·cell-1,简称pcd),挑选表达量(≥80ug/mL)或SPR值(≥9pcd)的8个Pool分别转移至6孔板继续培养。
实施例3单克隆ClonePix2筛选
1.Pool铺半固体培养基
1)Pool半固体培养基培养配方
表1细胞Pool克隆化的半固体培养基配方
室温下吹吸均匀,等待气泡慢慢消失。
2)Pool铺半固体培养基
根据铺板后的每孔150cells/2mL半固体培养基,往半固体培养基中加入所需细胞量的细胞液。用移液管将半固体培养基与细胞轻轻混匀,室温静置几分钟,使大气泡消失或挑破。用移液管吸取2mL上述混合细胞液慢慢加入到六孔板中的每小孔,注意别混入气泡,有气泡就轻轻挑破。分装铺板后,盖上盖子,于37℃,5%CO2静置培养。
2.ClonePix2挑选单克隆
半固体6孔板大约培养10天后,在显微镜下观察有细胞团长出,此时采用ClonePix2对克隆细胞团进行成像(见图3),据荧光强度、细胞大小以及细胞形状成像设定的阈值,采用ClonePix2的针头挑取具有优势的单克隆至目标板96孔板(共413个克隆),置于继续培养。
实施例4单克隆孔板筛选
1.96孔板单克隆筛选
单克隆在96孔板培养约5-6天左右,用Clone Select Image成像仪对96孔板的汇合度进行扫板(见图 4),选择汇合度≥35%的孔吸取120μL细胞上清,通过Fortebio测表达量,同时每孔补入180μL预热的 CD CHO AGT培养基。筛选出表达量≥9.55ug/mL、相对表达量≥20.46的48个克隆转24孔板进行扩培。
2.克隆扩培及批培养筛选
在24孔板培养3~4天后,将48个克隆全部转移至6孔板继续扩大培养,培养3~4天后,克隆全部参与6孔板批培养,培养7天后Fortebio测定表达量,同时计算SPR值,挑选表达量≥260ug/mL或SPR 值≥35pcd的5个较优克隆分别转移至125mL摇瓶,37℃,140rpm,10%CO2振荡培养,培养3~4天后进行冻存。
实施例5 GLP-1类似物Fc融合蛋白发酵生产
1.种子液制备
将筛选到的5个较优单克隆(C2、C6、C8、C9、C15)进行复苏,37℃培养3~4天至细胞密度1-2×106 cells/mL后进行传代,然后培养3天后至细胞密度1~2×106cells/mL后继续传代,再培养3天后至细胞密度1~2×106cells/mL,获得种子液。
2.补料发酵
将获得的种子液以8×105cells/mL接种至50mL/250mL摇瓶中,培养3天至细胞密度1.5~2×106 cells/mL时,开始取样测定细胞生长趋势(见图5)和表达量(见图6),同时检测细胞发酵生化参数(见图7),并对细胞进行补料培养,维持Feed比例2%、葡萄糖4g/L、谷氨酸4mM及半胱氨酸0.2%。直至培养至第10天,此时5个单克隆的表达量范围在2.8~3.4g/L,其中C8的表达量最高,达到3.4g/L。
实施例6融合蛋白质的纯化与生物学活性检测
1.融合蛋白质的分离纯化
发酵10天后,结束培养,离心收集上清,采用装载protein A柱(BestchromShanghai CN)的FPLC AKTA 纯化设备(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)进行纯化与浓缩,同时用20mM PBS-0.15M NaCl(pH 7.0) 溶液进行平衡。最后用0.1M HAc-NaAc(pH 3.0)溶液洗脱融合蛋白。
2.融合蛋白质的生物学活性检测(见图8)
cAMP测定:本分析方法是基于体外细胞的生物测定法。rGLP-1-Fc能够激活转染有人GLP-1R的 HEK293细胞(HEK293/GLP-1R,HD BIOSCIENCES(CHINA)CO.,LTD公司),并呈剂量依赖性地在细胞内产生cAMP。HEK293/GLP-1R细胞经过不同克隆(C2、C6、C8、C9、C15)的rGLP-1-Fc或Trulicity 刺激孵育后,细胞被裂解,使用CISBIO cAMP检测试剂盒测定所产生的cAMP,用多功能酶标仪激发平板并读数,结果见图8,显示克隆C8所表现出的细胞学活性最高,EC50值为0.08675nM,相比于对照 Trulicity的活性提高了约1.27倍。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东东阳光药业有限公司
<120> 重组GLP-1类似物Fc融合蛋白的优化基因及其应用
<130> 2017
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 信号肽A
<400> 1
atggagctgg gcctgagatg ggtgttcctg gtggctatcc tggagggagt gcagtgc 57
<210> 2
<211> 825
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 序列B
<400> 2
catggcgagg gcacctttac ctccgacgtg tcctcctacc tggaagaaca ggccgccaaa 60
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agcggaggcg gtggatctgc cgagtctaag tacggccctc cctgccctcc ttgtcctgct 180
cctgaagctg ctggcggccc ttccgtgttc ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg 240
atgatctccc ggacccccga agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca ggaagatccc 300
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agagaggaac agttcaactc cacctaccgg gtggtgtccg tgctgacagt gctgcaccag 420
gactggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcca acaagggcct gcccagctcc 480
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<211> 294
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重组融合蛋白氨基酸序列
<400> 3
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Glu Glu Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
65 70 75 80
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
85 90 95
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
100 105 110
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
115 120 125
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
130 135 140
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
145 150 155 160
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
165 170 175
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
180 185 190
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
195 200 205
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
210 215 220
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
225 230 235 240
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
245 250 255
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
260 265 270
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
275 280 285
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290
<210> 4
<211> 903
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核苷酸序列C
<400> 4
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gagtgcagtg ccatggcgag ggcaccttta cctccgacgt gtcctcctac ctggaagaac 120
aggccgccaa agagtttatc gcctggctcg tgaagggcgg tggtggcggc ggaggatctg 180
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agaccaagcc cagagaggaa cagttcaact ccacctaccg ggtggtgtcc gtgctgacag 480
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tgcccagctc catcgaaaag accatctcca aggccaaggg ccagccccgg gaaccccagg 600
tgtacacact gcctccaagc caggaagaga tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgtc 660
tcgtgaaagg cttctacccc tccgatatcg ccgtggaatg ggagtccaac ggccagcctg 720
agaacaacta caagaccacc ccccctgtgc tggactccga cggctccttc ttcctgtact 780
cccggctgac cgtggacaag tccagatggc aggaaggcaa cgtgttctcc tgctccgtga 840
tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagtccct gtccctgtct ctgggatgat 900
gag 903
<210> 5
<211> 6893
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核苷酸序列D
<400> 5
aattcattga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac 60
ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg 120
tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 180
gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 240
gtctggcggc cgcgacctgc aggcgcagaa ctggtaggta tggaagatcc ctcgagatcc 300
attgtgctgg cggtaggcga gcagcgcctg cctgaagctg cgggcattcc cgatcagaaa 360
tgagcgccag tcgtcgtcgg ctctcggcac cgaatgcgta tgattctccg ccagcatggc 420
ttcggccagt gcgtcgagca gcgcccgctt gttcctgaag tgccagtaaa gcgccggctg 480
ctgaaccccc aaccgttccg ccagtttgcg tgtcgtcaga ccgtctacgc cgacctcgtt 540
caacaggtcc agggcggcac ggatcactgt attcggctgc aactttgtca tgcttgacac 600
tttatcactg ataaacataa tatgtccacc aacttatcag tgataaagaa tccgcgccag 660
cacaatggat ctcgaggtcg agggatctct agaggatcct ctacgccgga cgcatcgtgg 720
ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg 780
gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg 840
caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg 900
cggcggtgct caacggcctc aacctactac tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata 960
agggagagcg tcgacctcgg gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 1020
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 1080
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 1140
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 1200
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 1260
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 1320
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 1380
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa 1440
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 1500
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 1560
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 1620
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 1680
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 1740
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 1800
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 1860
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 1920
atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 1980
tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 2040
ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 2100
ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 2160
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 2220
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 2280
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 2340
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gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 2460
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cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 2580
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 2640
gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 2700
ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 2760
ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tgatggctct 2820
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taatcacact ggctcacctt cgggtgggcc tttctgcgtt tataaggaga cactttatgt 2940
ttaagaaggt tggtaaattc cttgcggctt tggcagccaa gctagatccg gctgtggaat 3000
gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 3060
atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 3120
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atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 3240
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ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctagctt ggggccaccg ctcagagcac 3360
cttccaccat ggccacctca gcaagttccc acttgaacaa aaacatcaag caaatgtact 3420
tgtgcctgcc ccagggtgag aaagtccaag ccatgtatat ctgggttgat ggtactggag 3480
aaggactgcg ctgcaaaacc cgcaccctgg actgtgagcc caagtgtgta gaagagttac 3540
ctgagtggaa ttttgatggc tctagtacct ttcagtctga gggctccaac agtgacatgt 3600
atctcagccc tgttgccatg tttcgggacc ccttccgcag agatcccaac aagctggtgt 3660
tctgtgaagt tttcaagtac aaccggaagc ctgcagagac caatttaagg cactcgtgta 3720
aacggataat ggacatggtg agcaaccagc acccctggtt tggaatggaa caggagtata 3780
ctctgatggg aacagatggg cacccttttg gttggccttc caatggcttt cctgggcccc 3840
aaggtccgta ttactgtggt gtgggcgcag acaaagccta tggcagggat atcgtggagg 3900
ctcactaccg cgcctgcttg tatgctgggg tcaagattac aggaacaaat gctgaggtca 3960
tgcctgccca gtgggagttc caaataggac cctgtgaagg aatccgcatg ggagatcatc 4020
tctgggtggc ccgtttcatc ttgcatcgag tatgtgaaga ctttggggta atagcaacct 4080
ttgaccccaa gcccattcct gggaactgga atggtgcagg ctgccatacc aactttagca 4140
ccaaggccat gcgggaggag aatggtctga agcacatcga ggaggccatc gagaaactaa 4200
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gtcgtctgac tgggttccac gaaacgtcca acatcaacga cttttctgct ggtgtcgcca 4320
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catgccttct caatgagact ggcgacgagc ccttccaata caaaaactaa ttagactttg 4500
agtgatcttg agcctttcct agttcatccc accccgcccc agagagatct ttgtgaagga 4560
accttacttc tgtggtgtga cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa 4620
ggtaaatata aaatttttaa gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt 4680
attttagatt ccaacctatg gaactgatga atgggagcag tggtggaatg cctttaatga 4740
ggaaaacctg ttttgctcag aagaaatgcc atctagtgat gatgaggcta ctgctgactc 4800
tcaacattct actcctccaa aaaagaagag aaaggtagaa gaccccaagg actttccttc 4860
agaattgcta agttttttga gtcatgctgt gtttagtaat agaactcttg cttgctttgc 4920
tatttacacc acaaaggaaa aagctgcact gctatacaag aaaattatgg aaaaatattc 4980
tgtaaccttt ataagtaggc ataacagtta taatcataac atactgtttt ttcttactcc 5040
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tttaatttgt aaaggggtta ataaggaata tttgatgtat agtgccttga ctagagatca 5160
taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc 5220
ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt 5280
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tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatctcta 5400
gcttcgtgtc aaggacggtg aggcgcgcct actgagtcat tagggacttt ccaatgggtt 5460
ttgcccagta cataaggtca ataggggtga atcaacagga aagtcccatt ggagccaagt 5520
acactgagtc aatagggact ttccattggg ttttgcccag tacaaaaggt caataggggg 5580
tgagtcaatg ggtttttccc attattggca cgtacataag gtcaataggg gtgagtcatt 5640
gggtttttcc agccaattta attaaaacgc catgtacttt cccaccattg acgtcaatgg 5700
gctattgaaa ctaatgcaac gtgaccttta aacggtactt tcccatagct gattaatggg 5760
aaagtaccgt tctcgagcca atacacgtca atgggaagtg aaagggcagc caaaacgtaa 5820
caccgccccg gttttcccct ggaaattcca tattggcacg cattctattg gctgagctgc 5880
gttctacgtg ggtataagag gcgcgaccag cgtcggtacc gtcgcagtct tcggtctgac 5940
caccgtagaa cgcagcctca ggacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgc 6000
ggccgggaac ggtgcattgg aacgcggatt ccccgtgcca agagtgacgt aagtaccgcc 6060
tatagagtct ataggcccac ccccttggct tcttatgcat gctatactgt ttttggcttg 6120
gggtctatac acccccgctt cctcatgtta taggtgatgg tatagcttag cctataggtg 6180
tgggttattg accattattg accactcccc tattggtgac gatactttcc attactaatc 6240
cataacatgg ctctttgcca caactctctt tattggctat atgccaatac actgtccttc 6300
agagactgac acggactctg tatttttaca ggatggggtc tcatttatta tttacaaatt 6360
cacatataca acaccaccgt ccccagtgcc cgcagttttt attaaacata acgtgggatc 6420
tccacgcgaa tctcgggtac gtgttccgga catgggctct tctccggtag cggcggagct 6480
tctacatccg agccctgctc ccatgcctcc agcgactcat ggtcgctcgg cagctccttg 6540
ctcctaacag tggaggccag acttaggcac agcacgatgc ccaccaccac cagtgtgccg 6600
cacaaggccg tggcggtagg gtatgtgtct gaaaatgagc tcggggagcg ggcttgcacc 6660
gctgacgcat ttggaagact taaggcagcg gcagaagaag atgcaggcag ctgagttgtt 6720
gtgttctgat aagagtcaga ggtaactccc gttgcggtgc tgttaacggt ggagggcagt 6780
gtagtctgag cagtactcgt tgctgccgcg cgcgccacca gacataatag ctgacagact 6840
aacagactgt tcctttccat gggtcttttc tgcagtcacc gtccttgaca cga 6893
Claims (10)
1.一种重组融合蛋白基因,其特征在于,所述重组融合蛋白基因具有A-B结构的基因序列,其中A为信号肽基因,B为编码GLP-1类似物Fc融合蛋白的基因;所述融合蛋白基因中,信号肽A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白基因,其特征在于,所述编码GLP-1类似物Fc融合蛋白的基因B的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的重组融合蛋白基因,其特征在于,所述重组融合蛋白基因的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
4.含有权利要求2所述重组融合蛋白基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体为pXC17.4。
6.含有权利要求4或5所述重组表达载体的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为CHOK1SV GS-KO细胞。
8.权利要求2所述重组融合蛋白基因在生产GLP-1类似物Fc融合蛋白中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,包括:将具有权利要求1所述的信号肽基因和具有权利要求2所述的编码GLP-1类似物Fc融合蛋白的基因重组,得到优化后的重组融合蛋白基因;将上述重组融合蛋白基因***表达载体中,得到重组表达载体;将上述重组表达载体进行PvuI线性化,转化宿主细胞,筛选获得阳性宿主菌株;培养阳性宿主菌株,诱导GLP-1类似物Fc融合蛋白的表达,回收并纯化所表达的GLP-1类似物Fc融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述重组表达载体为pXC17.4;所述宿主细胞为CHOK1SV GS-KO细胞。
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