CN108103028A - 一种艾滋病免疫吸附治疗细胞株的制备 - Google Patents

Abstract

一种用于生物医学领域的艾滋病免疫吸附治疗细胞株的制备，其特征在于，以免疫磁珠法分选CD4⁺T细胞和巨噬细胞，与骨髓瘤细胞(SP2/0)同置于含有PHA、刀豆蛋白A、IFN‑γ、SP2/0‑IgG、CD4‑IgG的预融合剂中，在PHA活化T细胞、刀豆蛋白A改变胞膜易融性、IFN‑γ活化巨噬细胞IgGFc受体的共同作用下，使CD4‑IgG的IgGFab段与具有CD4表位的CD4⁺T细胞结合，而其IgGFc段与具有IgGFc受体的巨噬细胞结合，SP2/0‑IgG的IgGFab段与SP2/0结合，而其IgGFc段与具有IgGFc受体的巨噬细胞结合，形成CD4⁺T细胞‑CD4‑IgG‑巨噬细胞‑IgG‑SP2/0结合物，进而在融合剂的作用下使3种细胞融合，经细胞融合选择培养基(HAT)培养，获得能长期传代、产生细胞因子、围吞HIV的艾滋病免疫吸附治疗细胞株。

Description

一种艾滋病免疫吸附治疗细胞株的制备

技术领域

本发明涉及生物医学领域中艾滋病的生物细胞治疗。

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的传染病，在全球广泛流行，根据世界卫生组织(WHO)和***艾滋病规划署的有关报告，自1981年美国发现首例艾滋病病例以来，至今全球有208个国家和地区受到了艾滋病的严重威胁，约有4000万人感染了艾滋病，死亡人数已超过2000万，每天约有6000人成为艾滋病感染者，同时每天约有300多人死于艾滋病。在中国HIV感染者正处于高速增长期，目前已远超过100万。艾滋病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病、结核病、糖尿病后又一个人类面临的重大感染性疾病，已成为全球关注的严重的公共卫生和社会问题。

从目前已用于临床的艾滋病治疗方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆转录酶抑制剂：仅能防止尚未感染HIV的易感细胞感染，对已感染的细胞没有治疗作用，且毒副作用较多，包括腺粒体毒性、骨髓抑制、红细胞性贫血、粒细胞和血小板减少、胰腺炎，加之交叉耐药性的产生，这类药已不单独使用，主要做联合用药，且易产生耐药变株，导致临床疗效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制剂：易产生药物性肝损伤、脂质代谢紊乱等毒副作用及耐药性。(3)HIV整合酶抑制剂：通过抑制HIV病毒DNA与宿主细胞DNA整合而发挥作用，与HIV逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合同时使用对抗病毒有协同作用。(4)抑制HIV病毒进入抑制剂：包括阻断gp120与CD4结合、阻断HIV与辅助受体结合、作用于gp41膜亚单位及作用于T淋巴细胞表面CC趋化因子受体5(CCR5)来阻断HIV进入宿主细胞，但对肝和心脏有副作用。(5)细胞因子治疗：主要用于调节T细胞动态平衡。(6)HIV疫苗治疗：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破坏免疫***，病毒突变迅速，导致至今尚未开发出真正安全有效的疫苗。(7)基因治疗：HIV基因治疗的研究从未间断，包括反义技术、RNA诱饵、RNA干扰、细胞内抗体、显性阴性突变体、***基因等，但进入II期临床试验阶段的基因疗法几乎没有。(8)单克隆抗体被动免疫疗法：通过下调CD4+T细胞表面CCR5来降低HIV的易感性、延缓艾滋病的进展和减少HIV的扩散，中和单克隆抗体2G12、2F5和4E10应用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延缓但不能阻止病毒的反弹(9)过继性免疫细胞治疗：体外大量培养HIV自体的CD4+T细胞时会导致病毒大量扩增，增加病毒感染的CD4+T细胞数量，而回输CD4+T细胞可能会增加体内病毒复制的场所，导致病毒载量反弹，总体上看，过继性免疫细胞治疗无明显的毒副作用，也未取得满意的治疗效果。

HIV进入人体后，首先被巨噬细胞吞噬，但HIV很快改变了细胞内部的酸性环境，创造了适合其生存的条件，不但不被杀灭反而在其内繁殖。因为CD4是HIV的受体，所以经巨噬细胞内繁殖的HIV通过其囊膜蛋白gp120并在gp41的辅助下进入CD4+细胞(细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等)，在细胞内迅速增殖，每天产生10⁹～10¹⁰病毒颗粒，并不断进入其他正常的和再生的CD4+细胞内复制，制造更多的病毒感染细胞，使外周血CD4+T细胞持续破坏、减少。HIV的gp120与CD4受体结合可直接激活受感染的细胞凋亡，甚至感染HIV的T细胞表达的囊膜抗原也可启动正常T细胞，通过细胞表面CD4分子交联间接地引起CD4+细胞的大量破坏，结果造成以CD4+T细胞缺损为中心的严重免疫缺陷，患者主要表现：外周淋巴细胞减少，T4/T8比例配置，对植物血凝素和某些抗原的反应消失，迟发型***反应下降，NK细胞、巨噬细胞活性减弱，IL2、γ干扰素等细胞因子合成减少。CD4+T细胞是最重要的免疫细胞，感染者一旦失去了大量CD4+T细胞，整个免疫***就会遭到致命的打击，对各种疾病的感染都失去抵抗力。

CD4+T细胞是T淋巴细胞的一种，平均寿命一般为7天左右，难以在体外长期传代扩增、作为CD4+T细胞缺乏的艾滋病的治疗。

发明内容

为了构建一种能在体外长期传代培养、能产生细胞因子、能吸附HIV的艾滋病免疫吸附治疗细胞株，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供一种艾滋病免疫吸附治疗细胞株的构建方法。

本发明的目的是这样实现的：CD4⁺T细胞、巨噬细胞和骨髓瘤细胞在PHA活化T细胞、刀豆蛋白A改变胞膜易融性、IFN-γ活化巨噬细胞IgGFc受体的作用下，先将抗骨髓瘤细胞抗体的IgGFab段与骨髓瘤细胞结合，再将其IgGFc段与具有IgGFc受体的巨噬细胞结合，另将抗CD4⁺T细胞抗体的IgGFab段与CD4⁺T细胞结合，再将其IgGFc段及未结合的IgGFab段与具有IgGFc受体、CD4表位的巨噬细胞结合，借助相应的抗体使CD4⁺T细胞、骨髓瘤细胞和巨噬细胞形成结合物，进而在融合剂的作用下使3种细胞融合，经选择培养培养，获得能长期传代、产生细胞因子、围吞HIV的艾滋病免疫吸附治疗细胞株。

本发明的待融合细胞经本发明的预融合剂处理后，使T细胞活化、胞膜易融性增加、巨噬细胞IgGFc受体激活，被CD4-IgG、SP2/0-IgG连接为CD4⁺T细胞-CD4-IgG-巨噬细胞-IgG-SP2/0结合物，从而拉近被融合细胞的距离、易于胞膜接触和融合，在融合剂(聚乙二醇)的进一步作用下使3种细胞融合，获得高融合率的能在体外无限扩增、产生细胞因子、使HIV从被巨噬细胞的吞噬到传递给CD4⁺T细胞的过程被限制在胞内、更易于围吞HIV而适用于艾滋病体外免疫吸附治疗的杂交瘤细胞株。

具体实施方式

图1是本发明的IgG助融示意图。

图2是本发明的细胞融合实拍图。

在图1中，1表示CD4⁺T细胞，2表示骨髓瘤细胞，3表示抗骨髓瘤细胞单克隆抗体，4表示抗CD4⁺T细胞单克隆抗体，5表示巨噬细胞。巨噬细胞有IgGFc受体，可同时与抗骨髓瘤细胞单克隆抗体[3]IgGFc以及抗CD4⁺T细胞单克隆抗体[4]IgGFc结合，而两种抗体的IgGFab端分别与对应的CD4⁺T细胞和骨髓瘤细胞结合，通过抗体将CD4⁺T细胞、骨髓瘤细胞及巨噬细胞连接在一起，有利于在PEG的作用下融合。

在图2中，融合细胞经HAT筛选2周，倒置显微镜下拍摄(40X)，得到杂交瘤细胞克隆。

下面结合图1和图2，对本发明的实施方案作具体的描述。

1、CD4+T细胞和巨噬细胞的分离

参照有关文献，以密度梯度离心法从新鲜血液(新生儿脐带血或献血员血液)中分离单个核细胞，然后以免疫磁珠法分离CD4+T细胞和巨噬细胞。

2、免疫吸附治疗细胞株(杂交瘤细胞株)的构建

(1)试剂的准备：①培养基及主要试剂：DMEM培养基、HAT选择培养基购自Sigma公司，优级胎牛血清(FBS)购白天津市灏洋生物制品科技责任有限公司；DMSO(--甲基亚砜)为国产分析纯试剂；②预融合剂：基础液：在DMEM培养基中配入5μg/ml植物血凝素(PHA)、3.0％刀豆蛋白A、4.5μg/L IFN-γ。甲液：在基础液中配入与CD4⁺T细胞等效价的CD4-IgG(抗-CD4抗体或称CD4抗体)。乙液：在基础液中配入与骨髓瘤细胞等效价的抗骨髓瘤细胞抗体(SP2/0抗体或称SP2/0-IgG)。其中PHA活化T细胞、刀豆蛋白A改变胞膜易融性、IFN-γ活化巨噬细胞IgGFc受体，CD4-IgG的IgGFab段与具有CD4表位的CD4⁺T细胞结合，而其IgGFc段与具有IgGFc受体的巨噬细胞结合，SP2/0-IgG的IgGFab段与SP2/0结合，而其IgGFc段与具有IgGFc受体的巨噬细胞结合，形成CD4⁺T细胞-CD4-IgG-巨噬细胞-IgG-SP2/0结合物，待融合细胞经预融合剂处理后，才能在融合剂的进一步作用下使3种细胞融合，获得能长期传代、产生细胞因子、更易于围吞HIV的艾滋病免疫吸附治疗细胞株。

(2)骨髓瘤细胞的准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，立即放入热水解冻(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×10⁵/ml，倍增时间通常为10～15h；与人体相关的实际应用中考虑选择同源细胞株，如上海复祥生物科技有限公司向ATCC细胞库引进的NCI-H929人骨髓瘤细胞株)。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合时将SP2/0从培养瓶上吹下，转入离心管中，1000r/m离心5-10min，重复洗涤细胞2次，轻轻敲打混匀后取少量悬液计数，用基础液调整好密度，按经验保证在融合时其密度为80％左右。

(3)待融合的CD4+T细胞和巨噬细胞的准备：将CD4+T细胞和巨噬细胞分别以DMEM培养液(基础液)调整总细胞数为1×10⁸～2×10⁸，用于细胞融合，并以台盼兰染色、相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

(4)融合前处理：按CD4+T细胞∶巨噬细胞∶骨髓瘤细胞＝1∶0.5∶0.2的比例，将CD4+T细胞悬液和骨髓瘤细胞悬液分别加入两离心管中，1000r/m离心5min，弃去上清，各自加入2ml甲液和乙液，骨髓瘤细胞管再按比例加入巨噬细胞悬液，混匀，37℃1h，再将两离心管中的细胞悬液混合，37℃1h，立即以1000r/m离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀。

(5)细胞融合：在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μL的30％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，转置56℃水浴放散抗体5分钟(除去结合的抗体)，1500r/m离心5min，弃去上清，加入50mL HAT培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。

(6)杂交瘤细胞株的筛选：观察96孔板细胞生长情况，7-10天后仅有细胞融合的HIV易感细胞株能够生长***，此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，选择生长状态良好的HIV易感细胞株的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，37℃，5％CO2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，取细胞或培养上清检测HIV易感细胞株的特性，并进行HIV易感细胞株的冻存。

(7)杂交瘤细胞株的生物学特性

(A)体外传代培养

将杂交瘤细胞株作扩增培养，培养3个月，传代15代，细胞仍呈贴壁生长，随机取5个细胞培养瓶，分别消化贴壁细胞，以台盼兰染色，用相差显微镜检查，计数100个细胞，活细胞数分别为94％、89％、93％、89％、92％；而未融合的正常CD4+T细胞的寿命通常为1周，巨噬细胞的寿命为2-3周，最长不超过75天。

(B)杂交瘤细胞株易于清除胞外的HIV，使胞外HIV显著地减少

为了比较杂交瘤细胞株、巨噬细胞系、CD4+T细胞(CD3单抗刺激扩增)各自清除HIV的功效，本发明设计了简易的测试方法：分别取5支(共20支)灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管，吸取细胞浓度均为90％的CD4+T细胞(I)、单核巨噬细胞系(II)、CD4+T细胞和单核巨噬细胞系等量混合细胞株(III)、杂交瘤细胞株(IV)至200mm刻度。另取5例艾滋病患者的血浆，各约13～15mL，检测其HIV-1p24的含量，称为滤前血浆HIV-1p24的含量。然后将每例患者的血浆各自平分放入分别装有CD4+T细胞(I)、巨噬细胞系(II)、CD4+T细胞和巨噬细胞系等量混合细胞株(III)、杂交瘤细胞株(IV)的血沉管。5-10分钟后血浆从血沉管下端缓慢渗出，分别收集流出液，并检测其HIV-1p24的含量。

检测方法根据HIV-1p24抗原检测试剂盒(酶联免疫法，上海启发生物科技有限公司)操作，以已知浓度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作为对照，最低检测限低于5pg/ml，测定范围0～400pg/ml，线性范围0.5pg/ml～80pg/ml，15min内450nm测定吸光度(OD)，空白对照校准品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，当吸光度＞0.12时被认为是阳性。

检测结果(表1)发现，5例AIDS血浆各自滤过装有CD4+T细胞(I)、巨噬细胞系(II)、CD4+T细胞和巨噬细胞系等量混合细胞株(III)、杂交瘤细胞株(IV)的血沉管后，其中的HIV被不同程度的清除。例如：编号为1的AIDS血浆，滤前血浆中HIVp24抗原的含量为316.5pg/ml，当滤过装有CD4+T细胞(I)柱时，其滤液的HIVp24抗原含量检测值为278.5pg/ml，被清除了38pg/ml(316.5-278.5＝38)，其清除率为12.01％(38/316.5＝12.01％)；当滤过HIV易感细胞株(IV)柱时，其滤液的HIVp24抗原含量检测值为193.3pg/ml，被清除了116.8pg/ml(316.5-193.3＝123.2)，其清除率为36.9％(123.2/316.5＝38.93％)，依次计算，滤过CD4+T细胞(I)后的平均清除率为16.74％、滤过巨噬细胞系(II)后的平均清除率为17.92％、滤过CD4+T细胞和巨噬细胞系等量混合细胞株(III)后的平均清除率为19.23％、滤过杂交瘤细胞株(IV)后的平均清除率为36.70％。

表1 AIDS血浆分别滤过CD4+T细胞、巨噬细胞系、杂交瘤细胞株后的p24检测结果(pg/ml)

上述实验表明，虽然CD4+T细胞(I)、单核巨噬细胞系(II)、CD4+T细胞和巨噬细胞系等量混合细胞株(III)、杂交瘤细胞株(IV)对HIV均有吞噬或吸附作用，但HIV易感细胞株对于HIV的吞噬、吸附作用具有特殊的效果(p＜0.01)

(C)杂交瘤细胞株能在长期培养中分泌CD4⁺T细胞因子

取5例艾滋病(AIDS)患者的血浆，各1.0ml，与0.5ml浓度为10¹⁰/ml的HIV易感细胞株混合，加5.0ml细胞培养液；另取1.0ml正常血浆，与5.5ml细胞培养液混合(空白对照)，均在37℃连续培养4周，然后从第2周开始，每周分别取更换的细胞培养液，进行CD4⁺T细胞因子检测，从检测结果(表2)可知，在第2、3、4周的培养液中，IFN-γ、IL-2、IL-4的平均检测值(μg/L)分别为2.8、2.9、2.9、2.8、2.8、2.9、2.7、2.9、2.9，相应各组均为p＞0.05，而空白对照未检出相应的细胞因子，未转化的正常CD4⁺T细胞在1周内死亡，于第2周时已死亡的CD4⁺T细胞无法产生细胞因子，只有杂交瘤细胞株能在体外长期培养，并在培养过程中产生细胞因子，而这些细胞因子具有重要的生理功能，所以，本申请能为相关细胞因子的体外制备、以用于相关疾病的治疗奠定基础。

表2 杂交瘤细胞株体外长期培养过程产生的细胞因子检测结果(μg/L)

(7)杂交瘤细胞株的应用

(A)用于制备细胞因子：使寿命约为1周的CD4⁺T细胞转化为能在体外长期培养、并在培养过程中产生IFN-γ、IL-2、IL-4等CD4⁺T细胞因子，所以，本申请能为CD4⁺T细胞因子的体外制备、以用于相关疾病的治疗奠定基础，特别是以破坏CD4⁺T细胞为病理特征的艾滋病患者，可取含HIV的患者自身血浆与杂交瘤细胞株在体外长期培养、不断提取培养液中的细胞因子，用于艾滋病的治疗。

(B)用于基于体外循环HIV截留的艾滋病免疫吸附治疗：杂交瘤细胞株经体外传代扩增后，收获细胞，制备杂交瘤细胞株吸附柱，在建立的体外循环装置中，艾滋病患者的静脉血液被引出体外，并分离为血浆和血细胞，血浆经过杂交瘤细胞株吸附柱时，其中的HIV被吸附柱中的杂交瘤细胞株吸附，清除HIV后的血浆与血细胞汇合后回输体内，如此可降低艾滋病患者体内的HIV病毒载量，且无药物的副作用。

Claims (4)

1.一种艾滋病免疫吸附治疗细胞株的制备，其特征在于，先将抗骨髓瘤细胞抗体IgGFab段与骨髓瘤细胞结合，再将其IgGFc段与具有IgGFc受体的巨噬细胞结合，另将抗CD4⁺T细胞抗体的IgGFab段与CD4⁺T细胞结合，再将其IgGFc段及未结合的IgGFab段与具有IgGFc受体、CD4表位的巨噬细胞结合，借助相应抗体使CD4⁺T细胞、骨髓瘤细胞和巨噬细胞形成结合物，进而在融合剂的作用下使3种细胞融合，获得艾滋病免疫吸附治疗细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种艾滋病免疫吸附治疗细胞株的制备，其特征在于，预融合剂包括(1)基础液：在DMEM培养基中配入5μg/ml植物血凝素、3.0％刀豆蛋白A、4.5μg/LIFN-γ；(2)甲液：在基础液中配入与CD4⁺T细胞等效价的CD4-IgG(抗-CD4抗体或称CD4抗体)；(3)乙液：在基础液中配入与骨髓瘤细胞等效价的抗骨髓瘤细胞抗体。

3.根据权利要求1、2所述的一种艾滋病免疫吸附治疗细胞株的制备，其特征在于，融合前处理是指按CD4+T细胞∶巨噬细胞∶骨髓瘤细胞＝1∶0.5∶0.2的比例，将CD4+T细胞悬液和骨髓瘤细胞悬液分别加入两离心管中，1000r/m离心5min，弃去上清，各自加入2ml甲液和乙液，骨髓瘤细胞管再按比例加入巨噬细胞悬液，混匀，37℃1h，再将两离心管中的细胞悬液混合，37℃1h，1000r/m离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀。

4.根据权利要求1所述的一种艾滋病免疫吸附治疗细胞株的制备，其特征在于，所述艾滋病免疫吸附治疗细胞株具有CD4⁺T细胞和巨噬细胞固有的免疫特性，能在体外无限扩增、制备细胞因子、封闭HIV感染、适用于艾滋病体外免疫吸附治疗。