CN108101973B - 椭圆小球藻nf-yc基因及其应用 - Google Patents

椭圆小球藻nf-yc基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了椭圆小球藻NF‑YC基因及其应用，属于微藻基因工程技术领域。椭圆小球藻NF‑YC基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示。该基因来源于椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，将其转化拟南芥，发现转CeNF‑YC的拟南芥总脂肪酸含量比野生型Col‑0提高了9.8％‑15.4％，千粒重比野生型增加18.4％‑44.9％。可见椭圆小球藻NF‑YC基因能大幅提高植物细胞的总油脂含量，可将该基因应用于生物油脂制备领域及作物改良，具有良好的应用前景。

Description

椭圆小球藻NF-YC基因及其应用
技术领域
本发明属于微藻基因工程领域，具体地说，涉及椭圆小球藻NF-YC基因、其编码蛋白及应用。
背景技术
随着传统能源的过度消耗和日益增长的能源需求，能源问题日益严峻，可替代能源的研究成为关注的热点。微藻由于含油量高，易于培养，单位土地油脂产量远高于其他油料作物，被认为是最优潜力的能源资源之一。
微藻是一类单细胞低等植物，繁殖能力强，对生长环境要求低，易于培养，光合作用效率高，含油量高。微藻细胞中的三酰甘油(TAG)可达到干重的20％-50％。三酰甘油(TAG)是植物贮藏脂类的主要贮存形式，它广泛分布于植物的种子、花粉、果实和叶片等器官中，主要参与细胞膜脂构建、能量代谢、逆境反应、种子萌发和花粉发育等众多生命活动。因此，微藻中存在着优良的与油脂代谢相关的候选基因资源。NF-Y(NuclearFactor Y)超基因家族是一类可以结合CCAAT-box的广泛地存在于真核生物中的转录因子家族，它由3个基因家族构成即NF-YA、NF-YB和NF-YC。在高等植物中，该基因家族的成员对油脂合成和积累、植物的生长发育及抗逆等方面都有重要影响。有研究指出高等植物来源的NF-Y基因在CaMV35S启动子驱动下或其他种子特异启动子如未改造的Napin启动子会使得植株发育异常，或种子萌发异常(Mu et al.,2008,Plant Physiology,148:1042-1054；Tan et al.,2011,Plant Physiol,156:1577-1588)。这使得该基因的应用受到限制。目前关于椭圆小球藻中NF-YC基因及其功能未有相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)NF-YC及其编码蛋白的应用。
本发明首先提供椭圆小球藻NF-YC蛋白，其具有：
1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
本发明提供了编码椭圆小球藻NF-YC蛋白的基因，其具有：
1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或
2)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或
3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
本发明提供了含有上述编码椭圆小球藻NF-YC蛋白的基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。
本发明提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在提高细胞中总脂肪酸含量中的应用。
所述细胞为植物细胞。
本发明提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在制备总脂肪酸含量高的转基因植物中的应用。
所述的植物为油类作物。所述油类作物为油菜、拟南芥、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棕榈、芝麻或花生。
本发明提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在提高植物种子千粒重中的应用。所述的植物为油菜、拟南芥、向日葵、大豆、番茄、棕榈、蓖麻、芝麻、花生、水稻、小麦或玉米。
本发明提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在植物种质资源改良中的应用。
本发明提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在生产食用油中的应用。
本发明提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在生产生物柴油中的应用。
本发明根据椭圆小球藻的转录组的注释，筛选到CeNF-YC的cDNA序列，提取椭圆小球藻的mRNA，反转录后，克隆CeNF-YC的全长CDS序列，并构建到入门载体上，之后通过重组反应，将其构建到植物表达载体上，筛选阳性克隆，转化农杆菌(GV3101)后侵染植物。结果发现，本发明提供的核苷酸序列为SEQ ID NO.1的、来源于椭圆小球藻的CeNF-YC在CaMV35S启动子驱动下异源表达于拟南芥中，转基因拟南芥都不会出现抑制拟南芥生长发育等不良的农艺性状，并且显著提高了转基因拟南芥种子中的油脂含量和种子的千粒重：转CeNF-YC的拟南芥总脂肪酸含量比野生型Col-0提高了9.8％-15.4％，千粒重比野生型增加18.4％-44.9％。拟南芥是模式植物，在拟南芥菜中能发挥作用的基因在多种作物中有类似的功效，因此本发明的核苷酸序列为SEQ ID NO.1的椭圆小球藻CeNF-YC基因可用于油菜，大豆，棉花，花生，棕榈等油料植物的遗传育种以提高油脂含量及千粒重，以及用于小麦，水稻，玉米等作物的育种，以提高种子的千粒重。
附图说明
图1为CeNF-YC基因入门载体图谱。
图2为CeNF-YC基因植物表达载体图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1椭圆小球藻NF-YC基因的获得与表达载体的构建
1、椭圆小球藻总RNA的提取
收集足量的椭圆小球藻细胞，迅速加入液氮，用研钵充分研磨后，取50-100mg的粉末，加入1mLTrizol(Invitrogen)提取缓冲液，充分混匀后，静止10min；加入0.2mL氯仿，充分混匀后，13,500rpm离心10min；取上清，加入0.2mL氯仿，充分混匀后，13,500rpm离心10min；取上清，加入一半体积的异丙醇，室温静止30-50min，13,500rpm离心10min，弃上清。加入75％的乙醇，悬浮沉淀，10,000rpm离心5min，弃上清；加入100％的乙醇，悬浮沉淀，10000rpm离心5min，弃上清；在超净工作台中吹干(大于3-5min)；加50μL DEPC水溶解。-80℃保存待用
2、椭圆小球藻cDNA的合成
利用全式金公司的去DNA反转录试剂盒，利用mRNA生产cDNA。其体系为5μg totalRNA，50mMOligo(dT18)，10μL 2×TS Reaction mix，1μL TransScript RT/RI Enzyme Mix，1μL gDNA Redmover，用RNase-free水补至20μL。轻轻混匀后，42℃孵育40-50min，85℃失活5min。-20℃保存待用。
3、CeNF-YC基因的获得及表达载体的构建
根据转录组中cDNA序列，预测其完整的CDS，并翻译为氨基酸序列后，通过在NCBI蛋白数据库中比对，进一步确定CeNF-YC基因的完整性。以cDNA作为模板，设计上下游扩增引物(上游引物5-AGCAGGCTTTGACTTTATGGACAGTGCAAACAATAATGGTC-3,下游引物5-TGGGTCTAGAGACTTTCCTTCGCCCTGCTTCTGTTGGTG-3)，用高保真Taq酶扩增CeNF-YC基因。扩增程序为2min 98℃预变性，30s 98℃，30s 60℃，30s 72℃，共35个循环。PCR产物纯化后，待用。
利用In-fusion体系，将PCR产物连接到入门载体(命名为pGWC-CeNF-YC，图1)上，具体如下：1μL酶切后的pGWCm(100ng/μL，用AhdI酶切)，1μLPCR产物(80ng/μL)，2μL In-fusion Mix，50℃50-60min；转大肠杆菌DH5α，通过PCR鉴定筛选阳性克隆，经测序鉴定后，通过gateway体系，将其构建到植物表达载体上，命名为pCeNF-YC(见图2)。将重组质粒转化于农杆菌GV3101中，经PCR鉴定后，待用。实施例2CeNF-YC基因的遗传转化及阳性转基因株系的筛选
拟南芥的遗传转化采用蘸花法进行。将实施例1制得的带有pCeNF-YC质粒的农杆菌，在LB液体(加有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和200mg/L利福平)培养基中培养至OD＝0.8，10000rpm离心5min收集菌体，用等体积的悬浮液(10mM MgCl2，5％蔗糖)悬浮，离心收集菌体，用悬浮液悬浮至OD＝1.0，并加入0.005％Silwet L-77，转化开花初期的拟南芥一次，间隔7天再蘸花一次。待种子成熟后，收集T0代种子，种于培养盘中，出苗后10天，喷Barsta(0.3％)筛选，间隔5天，再喷一次；并通过PCR鉴定后，将T1代阳性苗移植于营养钵中培养，待成熟后收种子。
实施例3转CeNF-YC基因的种子中脂肪酸成份分析
收集实施例2的转基因拟南芥的种子，37℃将其烘干后充分研磨，称取0.05g，加入3mL 7.5％KOH-CH3OH(已加入C17:0标准品作为内参)，70℃水浴3-5h，中间颠倒混匀几次。加入2mL HCl-CH3OH(V/V，1:1)溶液，2mL 14％BF3-CH3OH溶液，70℃水浴1.5h。加入1mL0.9％NaCl和4mL正己烷，充分振荡混匀，4,000rpm离心8min，将上层有机相转移至一新管中。氮气吹干，300μL乙酸乙酯溶解。该实验每次每个样品平行做两份，共重复3次。
严格按照TurboMass(PerkinElmer公司)操作规程，开启GC/MS仪器设备。GC参数设置如下：色谱柱为BPX-70，30m×0.25mm×0.25μm；柱箱温度设置为梯度升温(100℃，保持1min；15℃/min升至190℃，保持1min；10℃/min，升至220℃，保持4min)。载气是氦气，流量为1mL/min。取1μL样品进行GC-MS检测，根据气相色谱分析结果，不同脂肪酸所对应的峰面积与C17:0内标峰面积作比较来计算出各脂肪酸组分含量以及总脂肪酸含量见表1。
表1转基因株系脂肪酸分析(μg/mg)
Figure BDA0001518711520000051
Figure BDA0001518711520000061
从实验结果来看，转CeNF-YC拟南芥的种子中的脂肪酸组成没有发生变化，但其含量发生了显著的变化，转CeNF-YC的拟南芥总脂肪酸含量比野生型Col-0提高了提高了9.8％-15.4％，C18:0提高了1.9％-28％，C18:1提高了1.1％-7.9％，C18:3提高了22.6％-28.5％，C20:1提高了7.6％-16.0％。
实施例4转CeNF-YC基因的种子千粒重分析
收集实施例2的转基因拟南芥种子，37℃将其烘干后，统计1,000粒种子的质量，每个株系重复3次。Col-0、CeNF-YC-39、CeNF-YC-40和CeNF-YC-41的千粒重分别为：16.33±2.08mg、23.67±2.08mg、23.33±2.52mg和20.33±1.53mg。
从实验结果来看，转CeNF-YC基因可以使拟南芥的千粒重显著增加，比野生型增加18.4％-44.9％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 椭圆小球藻NF-YC基因及其应用
<130> KHP171119055.0
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggacagtg caaacaataa tggtctcgaa agcagctcag gggcagatgg tggggcacag 60
ccttctcccg caaatctgga ggtgccagga cagggcttac cgcagtttgg agtgggtggc 120
ctcgcctacc ccgcgccgca gtatctacac ccccaggcag cagcccagca ggagcagttg 180
cgccagtttt ggcagggcca gatgcaggag atccatcagg ttggcaccga tcccgcagaa 240
tttaagaacc accagcttcc attggctcgc attaaaaaga tcatgaagtc agatgaggat 300
gtgaggatga tcagtgcaga ggcccctgtc ctgtttgccc gggcctgcga gatgtttatt 360
ttggagctga cgctgcgctc ctggaaccac tctgaggaga acaagcgccg cacattgcag 420
cgcaacgaca ttgcagctgc catcacccgc actgacattt ttgattttct ggtagacatt 480
gtgccgaggg acgagcgtgg tgacgaccct gtcccggtgg gagcacccag gcctgcacag 540
ggaggcccct cctccacatc gccggccaca gctggcaatc cctcgccacc catctcaggg 600
gcgatgccgg cggggatggg gtggccacag ccgcaggggc aggcacagca ggggcccacc 660
cccgagcagc tgaacgccgc ggggggtggc aggcccccgc cccagctgca ggggcagctg 720
gaccctgccc ttatgctgtc cctctacaac cagcagcact tccagcagca gcagcagagg 780
gggcagcctg gggagcagca gccgtcggag cagttacagg gcctgcaata tccgaccaat 840
cagcagcagc agcagcagca gcagtcgcac caacagaagc agggcgaata g 891
<210> 2
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Ser Ala Asn Asn Asn Gly Leu Glu Ser Ser Ser Gly Ala Asp
1 5 10 15
Gly Gly Ala Gln Pro Ser Pro Ala Asn Leu Glu Val Pro Gly Gln Gly
20 25 30
Leu Pro Gln Phe Gly Val Gly Gly Leu Ala Tyr Pro Ala Pro Gln Tyr
35 40 45
Leu His Pro Gln Ala Ala Ala Gln Gln Glu Gln Leu Arg Gln Phe Trp
50 55 60
Gln Gly Gln Met Gln Glu Ile His Gln Val Gly Thr Asp Pro Ala Glu
65 70 75 80
Phe Lys Asn His Gln Leu Pro Leu Ala Arg Ile Lys Lys Ile Met Lys
85 90 95
Ser Asp Glu Asp Val Arg Met Ile Ser Ala Glu Ala Pro Val Leu Phe
100 105 110
Ala Arg Ala Cys Glu Met Phe Ile Leu Glu Leu Thr Leu Arg Ser Trp
115 120 125
Asn His Ser Glu Glu Asn Lys Arg Arg Thr Leu Gln Arg Asn Asp Ile
130 135 140
Ala Ala Ala Ile Thr Arg Thr Asp Ile Phe Asp Phe Leu Val Asp Ile
145 150 155 160
Val Pro Arg Asp Glu Arg Gly Asp Asp Pro Val Pro Val Gly Ala Pro
165 170 175
Arg Pro Ala Gln Gly Gly Pro Ser Ser Thr Ser Pro Ala Thr Ala Gly
180 185 190
Asn Pro Ser Pro Pro Ile Ser Gly Ala Met Pro Ala Gly Met Gly Trp
195 200 205
Pro Gln Pro Gln Gly Gln Ala Gln Gln Gly Pro Thr Pro Glu Gln Leu
210 215 220
Asn Ala Ala Gly Gly Gly Arg Pro Pro Pro Gln Leu Gln Gly Gln Leu
225 230 235 240
Asp Pro Ala Leu Met Leu Ser Leu Tyr Asn Gln Gln His Phe Gln Gln
245 250 255
Gln Gln Gln Arg Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gln Pro Ser Glu Gln Leu
260 265 270
Gln Gly Leu Gln Tyr Pro Thr Asn Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
275 280 285
Ser His Gln Gln Lys Gln Gly Glu
290 295
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaggcttt gactttatgg acagtgcaaa caataatggt c 41
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgggtctaga gactttcctt cgccctgctt ctgttggtg 39

Claims (9)

1.椭圆小球藻NF-YC蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.含有权利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料为载体。
4.权利要求1所述的椭圆小球藻NF-YC蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在提高植物细胞中总脂肪酸含量中的应用。
5.权利要求1所述的椭圆小球藻NF-YC蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在制备总脂肪酸含量高的转基因植物中的应用。
6.权利要求1所述的椭圆小球藻NF-YC蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在提高植物种子千粒重中的应用。
7.权利要求1所述的椭圆小球藻NF-YC蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在植物种质资源改良中的应用。
8.权利要求1所述的椭圆小球藻NF-YC蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在生产食用油中的应用。
9.权利要求1所述的椭圆小球藻NF-YC蛋白或权利要求2所述的基因在生产生物柴油中的应用。
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