CN108101825A - 用于抗体-药物偶联的双取代马来酰胺类连接子及其制备方法和用途 - Google Patents

用于抗体-药物偶联的双取代马来酰胺类连接子及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与抗体偶联的双取代马来酰胺类连接子及其制备方法和用途，具体地，本发明通过一类新的连接子将强细胞毒活性物质和生物大分子进行偶联。该类连接子可选择性与二硫链同时作用，从而大大提高偶联物的物质均一性。本发明的连接子所制备的偶联物对于表达相应抗原的细胞株具有高抑制活性。本发明还提供了上述偶联物的制备方法和用途。

Description

用于抗体-药物偶联的双取代马来酰胺类连接子及其制备方 法和用途
技术领域
本发明涉及一类新型二硫链桥接交联试剂、大分子、治疗用偶联物及其合成方法。更具体而言，本发明涉及通过基于取代马来酰胺的二硫链桥接交联试剂将细胞毒类药物和大分子进行交联而得到的偶联物及其制备方法和用途。
背景技术
多年来，大量研究集中在提高药物或其它制剂向靶细胞、组织或肿瘤递送效率以实现最大疗效和最小毒性。虽然为开发在体内和体外将生物活性分子输入细胞的有效方法已作出许多努力，但是没有一种证明是令人完全满意的。优化药物与其胞内靶分子的结合，同时最大程度减少药物的胞内再分布(如再分布到邻近细胞中)常常是困难或无效的。
目前经胃肠道外给予患者的大部分药物不是靶向的，这导致这种药物全身递送给不需要它们的机体细胞和组织，常常引起不良反应。这可导致药物的不良副作用，常常限制可给予的药物剂量(如化疗(抗癌)，细胞毒，酶抑制剂和抗病毒或抗微生物药物)。比较而言，虽然口服给药被认为是方便和经济的给药模式，但一旦该药物被吸收进入全身循环***中时，也可能对未受疾病影响的细胞产生相同的非特异性毒性问题。其它复杂情况包括口服生物利用度问题和药物在内脏中滞留问题，这使内脏与药物接触过久，从而有产生内脏毒性的风险。因此，开发(药物递送)方法的主要目标是使药物特异性靶向细胞和组织。这种治疗的益处包括避免将这种药物不合适地递送给其它细胞和组织，如未受感染的细胞而产生的全身生理效应。可通过使生物活性物质即活性代谢物在细胞内累积或保留的方法、化合物和制剂实现胞内靶向。
抗体-药物偶联物(ADC)即免疫偶联物在局部递送细胞毒剂或细胞抑制剂即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物中的应用容许将药物模块靶向递送至肿瘤，并在其中发生胞内积蓄，其中***施用这些未偶联的药剂在对试图消除的肿瘤细胞之外也对正常细胞产生了不可接受水平的毒性。改进ADC的治疗指数(即最高的功效与最低的毒性)的努力已经聚集于多克隆和单克隆抗体(mAb)的选择性以及药物连接和药效释放特性。
抗体药物偶联物一般由三部分组成：抗体或抗体类配体，小分子药物，和将配体与药物偶联起来的连接子。目前进入临床试验的抗体药物偶联物结构中，高活性的细胞毒性药物通常是通过连接子连接在配体表面的赖氨酸残基，或者抗体铰链区域的半胱氨酸残基(由链间二硫键部分还原得到)上,最佳的药物/配体比值(DAR)为2-4。抗体表面大量的赖氨酸残基(超过80个)以及偶联反应的非选择性，导致偶联数目和位点的不确定性，进而导致生成的抗体药物偶联物的不均一性。例如，T-DM1(平均DAR值为3.5)的DAR值分布为0-8。同样，尽管抗体铰链区的链间二硫键只有四对，但为达到最佳平均DAR值(2-4)的要求，需要部分还原链间二硫键。由于现有的还原剂(DTT,TCEP等)无法选择性地还原链间二硫键，因此生成的偶联物也不是均一的产物，由多种组分组成，其主要组分的DAR值为0,2,4,6,8，而且对应每一种特定DAR值的组分都存在由于连接位点不同而形成的异构体。抗体药物偶联物产品的不均一性可以导致各成员组分间药物动力学性质，效价以及毒性的不均一性。例如，具有较高DAR值的组分在体内被清除得更快，并导致更高的毒性。
为了解决抗体药物偶联物均一性问题，定点偶联技术近来得到了更多的青睐，这一技术从位点和数量两方面来控制抗体药物之间的偶联。尽管这些技术都能够实现偶联药物位点和数量的可控，所应用的抗体/蛋白都是通过基因重组的方式得到的。基因重组技术需要大量的 工作和精巧的设计，以寻找合宜的位点供药物偶联或聚乙二醇修饰，而现有基因重组技术所获得定点修饰的抗体/蛋白的表达量均较低，因此在大规模制备生产上非常耗时而且研发和最终产业化费用成本非常高。而通过改造后的抗体/蛋白也还需要进一步验证其自身的体内药效与安全性等因素。
针对以上偶联技术存在的问题，通过简单的化学方法对现有抗体实现定点偶联目的，会节省大量的人力物力财力，因此更加富有吸引力。因此，本领域迫切需要提供高效、简单、实用的化学偶联方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够与大多数抗体简单地进行偶联的连接子。
本发明的第一方面，提供了一种取代马来酰胺类连接子片断，结构为式Ia所示：
其中，R为X或ArS-，
X选自下组：卤素，优选为溴或碘；
Ar选自下组：取代或未取代的C6-C10芳基，取代或未取代的5-12元杂芳基；优选地，Ar选自苯基、卤代苯、C1-C4烷基苯基、C1-C4烷氧基苯基、2-吡啶基、2-嘧啶基、1-甲基咪唑-2-基、其中W为与羰基连接的胺基R1，R1选自-NH2、 等；其中：C1-C4烷基苯基进一步优选为4-甲基苯基；C1-C4烷氧基苯基进一步优选为4-甲氧基苯基。
Ar’选自下组：取代或未取代的C6-C10亚芳基，取代或未取代的5-12元亚杂芳基；优选地，Ar’选自取代或未取代的亚苯基。所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基所取代：卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基。
L1为连接于Ar’基团上的-O(CH2CH2O)n-，其中n选自1-20中任一整数，优选为1-10中任一整数。
在另一优选例中，所述连接子片段具有选自下组的结构：
本发明的第二方面，提供了一种含有如本发明第一方面所述的式Ia连接子片断的取代马来酰胺类连接子-药物缀合物，及其药学上可接受的盐或溶剂物，结构如通式Ib所示：
其中，R、Ar’、L1的定义同上；
L2为化学键或AA-PAB结构；其中，AA为二肽或三肽片断(即2-3个氨基酸通过肽键连接形成的片段)，优选包括Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Val-Ala(缬氨酸-甘氨酸)、Phe-Lys(苯丙氨酸-赖氨酸)、Ala-Ala-Asn(甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺)、D-Ala-Phe-Lys(D型甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸)等，PAB为对-氨基苄基氨甲酰基；
CTD为通过酰胺键键合于L2的细胞毒性类小分子药物和/或治疗自身免疫疾病和抗炎症的药物。
在另一优选例中，所述的式Ib化合物选自下组：
本发明的第三方面，提供了一种抗体-药物偶联物，所述的偶联物是用如本发明第二方面所述的式Ib取代马来酰胺类连接子药物缀合物与抗体进行偶联形成的。
在另一优选例中，所述的偶联物共价连接有一个或多个药物组分。
在另一优选例中，所述的偶联物中，抗体和药物是通过共价方式(如通过分别共价连接于连接子上)进行偶联。
本发明的另一方面，提供了一种抗体-药物偶联物，所述的偶联物具有通式Ic和/或Id的结构；
其中，Ar’、L1、L2、CTD的定义同上；
m＝1.0～5.0，优选为3.0-4.2；
Ab选自下组：为蛋白质、酶、抗体、抗体片段、多肽。
在另一优选例中，所述的通式Id为通式Ic中N-苯基马来酰胺开环后产物。
在另一优选例中，所述的抗体或Ab选自下组：单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段(优选为抗体Fab片段)。
在另一优选例中，所述的抗体-药物偶联物中，通过所述抗体或抗体片断铰链区的二硫链还原生成一对半胱氨酸残基，并通过所述半胱氨酸残基中巯基与所述通式Ib中的芳基硫醚发生取代反应，从而将所述通式Ib化合物连接于所述抗体或抗体片段上。
在另一优选例中，所述的CTD为细胞毒性类小分子药物，优选为微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA结合剂。
在另一进一步优选例中，所述的微管蛋白抑制剂选自美登素(maytansine)衍生物，Monomethyl auristatin E(MMAE)，Monomethylauristatin F(MMAF)，MonomethylDolastatin 10，Tubulysin类衍生物，Cryptophycin类衍生物，Taltobulin。
在另一进一步优选例中，所述的DNA结合剂选自PBD类衍生物，duocarmycin类衍生物。
在另一进一步优选例中，所述的拓扑异构酶抑制剂选自阿霉素(Doxorubicin)代谢产物PNU-159682衍生物，伊立替康(irinotecan,CPT-11)代谢产物SN38衍生物。
在另一优选例中，所述的CTD具有选自D1-D12的分子结构：
在另一优选例中，所述抗体是能够与选自下组的肿瘤相关抗原结合的抗体：
在另一优选例中，所述的抗体为HER2抗体，进一步优选为曲妥珠单抗(Trastuzumab)或帕妥珠单抗(Pertuzumab)。
在另一优选例中，所述的抗体为EGFR抗体，进一步优选为Erbitux或Vectibix。
在另一优选例中，所述的抗体为Tissue factor(TF)抗体。
本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，上述药物组合物包括：(a)如本发明第三方面所述的抗体-药物偶联物；和(b)药学上可接受的稀释剂，载剂或赋形剂。
本发明的第五方面，提供了一种如本发明第三方面中任一项所述的抗体-药物偶联物的用途，其特征在于，用于制备***的药物的用途。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：乳腺癌，卵巢癌，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，急性淋巴细胞性白血病，间变性大细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤，***癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，恶性黑色素瘤，鳞状细胞癌，胶质母细胞瘤，肾细胞癌，胃肠道肿瘤，胰腺癌，***癌，直结肠，胃癌，神经胶质瘤，间皮瘤。
本发明的另一方面，提供了一种***的方法，所述的方法包括步骤：对需要的对象施用治疗有效量的如本发明第三方面所述的抗体-药物偶联物。
在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物，优选为人。
本发明的第六方面，提供了一种如本发明第五方面所述的抗体-药物偶联物的制备方法，所述方法包括步骤：
(1)用抗体与还原试剂在缓冲液中反应，得到经还原后的抗体；
(2)用连接子-药物缀合物与步骤(1)得到的经还原后的抗体在缓冲液与一定量有机溶剂混合液中进行交联，得到抗体-药物偶联物。
步骤(1)中所述抗体经还原试剂还原，从而使抗体链间二硫键被还原，产生巯基基团。
在另一优选例中，所述的还原试剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、beta-巯基乙醇、beta-巯基乙胺盐酸盐、或二硫苏糖醇(DTT)。
在另一优选例中，所述的缓冲液选自下组：磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH2PO4-NaOH)/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)、硼酸-硼砂/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)、组氨酸-氢氧化钠/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)，和PBS/二乙基三胺五乙酸(DTPA)。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，有机溶剂在反应液中的体积占比不超过15％。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中的有机溶剂选自下组：乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基亚砜(DMSO)。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的偶联反应在0-37℃下进行。
在另一优选例中，若所述的步骤(1)采用beta-巯基乙醇、beta-巯基乙胺盐酸盐或DTT还原，在所述的步骤(1)和步骤(2)之间还包括：在还原反应完成后，对产物进行过脱盐柱或超滤以去除还原剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再 一一累述。
附图说明
图1显示了帕妥珠单抗与帕妥珠药物偶联物疏水作用层析(HIC)对比图谱；
图2显示了帕妥珠单抗与帕妥珠药物偶联物质谱对比图谱；
图3显示了ADC-2、P-mcVC-MMAE、Pertuzumab单抗与NCI-N87细胞表面抗原Her2结合实验；
图4显示了ADC-2、P-mcVC-MMAE、Kadcyla、Pertuzumab对人乳腺癌细胞SK-BR-3的增殖抑制实验；
图5显示了ADC-2、P-mcVC-MMAE、Kadcyla、Pertuzumab对人乳腺癌细胞BT-474的增殖抑制实验；
图6显示了ADC-2、P-mcVC-MMAE、Kadcyla、Pertuzumab对人胃癌细胞N87的增殖抑制实验；
图7显示了ADC-2对SKOV-3人卵巢癌细胞、Du-145人***癌细胞和Panc-1人胰腺癌的增殖抑制实验；
图8显示了ADC-2对人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的增殖抑制实验；
图9显示了ADC-4对人胃癌细胞N87的增殖抑制实验；
图10显示了ADC-2、ADC-3与ADC-4对Calu-3人肺癌细胞的增殖抑制实验；
图11显示了ADC-2、ADC-3、P-mcVC-MMAE、Kadcyla抑制人胃癌NCI-N87裸小鼠皮下移植瘤的活性研究。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现了一类连接子结构，该连接子可以全部/部分交叉偶联抗体的轻链-重链及重链-重链，且应用此种偶联方法得到的抗体药物偶联物，与传统抗体药物偶联物相比，具有更窄的药物/抗体比值(DAR)分布。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
在本文中，除特别说明之处，术语“C1-C4烷基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。
术语“C1-C4烷氧基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。
术语“卤素”指F、Cl、Br和I。
术语“C6-C10芳基”指具有6-10个碳原子的芳基，例如苯基、萘基等，所述的芳基可以是取代或未取代的。
术语“C6-C10芳基”指具有6-10个碳原子的芳基，例如苯基、萘基等，所述的芳基可以是取代或未取代的。
术语“5-12元杂芳基”、“5-12元亚杂芳基”指具有5-12个碳原子和一个或多个(优选1-3个)选自O、S和/或N的杂原子的杂芳基或亚杂芳基，优选5-8元杂芳基或亚杂芳基。所述的杂芳基或亚杂芳基可以是取代或未取代的。
本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。
如本文所用，术语“本发明化合物”指式I所示的化合物。该术语还包括及式I化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
除非特别说明，本文中所使用的“氨基酸”意在包括任何常规氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸。
当本文中使用商品名时，该商品名意在包括商品名产品制剂、其相应的仿制药，以及商品名产品的活性药物组分。
本文的术语“抗体”以其最广泛的含义使用并且特别覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(Miller等(2003)Journal of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以为鼠、人、人源化、嵌合的抗体或来源于其它物种。抗体为由能够识别和结合特异性抗原的免疫***产生的蛋白质(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5thEd.,Garland Publishing,NewYork)。靶抗原一般具有由多种抗体的CDRs识别的大量结合位点，也称作表位。特异性结合不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上相应的抗体。抗体包括全-长免疫球蛋白分子或全-长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合所关注靶标的抗原或其部分的分子，这类靶标包括，但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任意的物种。然而，在一个方面中，免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微抗体(minibody)(Olafsen等(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)；Fab表达文库制备的片段；抗-独特型(抗-Id)抗体；CDR(互补决定区)；和以免疫特异性方式结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意的表位-结合片段；单-链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本发明中组成抗体药物偶联物的抗体最好保持其原有野生状态时的抗原结合能力。因此，本发明中的抗体能够，最好专一性地，与抗原结合。涉及的抗原包括，例如，肿瘤相关抗原(TAA)，细胞表面受体蛋白和其他细胞表面分子，细胞存活调节因子，细胞增殖调节因子，与组织生长与分化相关的分子(如已知或预知的具有功能性的)，淋巴因子，细胞因子，参与细 胞循环调节的分子，参与血管生成的分子，以及与血管生成有关的分子(如已知抗体结合的抗原可以是上述分类中一个或一个子集，而其它的子集则包含其它的具有特殊性质的分子/抗原(与目标抗原相比)。
应用在抗体药物偶联物中的抗体包括，但不局限于，针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体。这样的肿瘤相关抗原是业内所熟知的，可以通过业内熟知的抗体制备方法和信息来制备。为了开发可用于癌症诊断与治疗的有效的细胞水平目标物，研究人员力图找寻跨膜或其他肿瘤相关多肽。这些目标物能够特异性地表达在一种或多种癌症细胞表面，而在一种或多种非癌细胞表面表达很少或不表达。通常，相对于非癌细胞表面而言,这样的肿瘤相关多肽在癌细胞表面更加过度表达。确认这样的肿瘤相关因子，可大大提高基于抗体治疗癌症的专一靶向特性。
肿瘤相关抗原包括，但不局限于，以下列出的肿瘤相关抗原(1)-(53)。为方便起见，为业内所熟知的抗原相关信息标示如下，包括名称，其它名称，基因库登录号。与肿瘤相关抗原对应的核酸和蛋白序列可参见公开数据库，例如Genbank。抗体靶向对应的肿瘤相关抗原包括所有的氨基酸序列变种和同种，与参考文献中确认的序列具有至少70％，80％，85％，90％，或95％的同源性，或者具备与引用文献中的肿瘤相关抗原序列具有完全一致的生物性质和特征。
(1)HER2(Gene ID:2064，人类表皮生长因子受体2(英语：human epidermalgrowth factor receptor 2，缩写为HER2，亦称为Neu、ErbB-2、CD340(分化群340)或p185)是一种由ERBB2基因编码的蛋白质。HER2是表皮生长因子受体(EGFR/ErbB)家族中的成员之一)；(2)HER3(Gene ID:2065,表皮因子受体3(ErbB3/HER3)是表皮生长因子跨膜受体家族的成员之一。近年来证实ErbB3/HER3与乳腺癌的发病、复发转移、化疗以及内分泌治疗的疗效密切相关，已成为非常有前景的治疗候选靶点)；(3)CD19(Gene ID:930)；(4)CD20(GeneID:931)；(5)CD22(Gene ID:933)；(6)CD30(Gene ID:943)；(7)CD33(Gene ID:945)；(8)CD37(Gene ID:951)；(9)CD45(Gene ID:5788)；(10)CD56(Gene ID:4684)；(11)CD66e(GeneID:1048)；(12)CD70(Gene ID:970)；(13)CD74(Gene ID:972)；(14)CD79b(Gene ID:974)；(15)CD138(Gene ID:6382)；(16)CD147(Gene ID:682)；(17)CD223(Gene ID:3902)；(18)EpCAM(Gene ID:4072)；(19)Mucin 1(Gene ID:4582)；(20)STEAP1(Gene ID:26872)；(21)GPNMB(Gene ID:10457)；(22)FGF2(Gene ID:2247)；(23)FOLR1(Gene ID:2348)；(24)EGFR(Gene ID:1956)；(25)EGFRvIII(GenBank:GM832119.1)；(26)Tissue factor(TF)(GeneID:2152)；(27)c-MET(Gene ID:4233)；(28)Nectin 4(Gene ID:81607)；(29)AGS-16；(30)Guanylyl cyclase C(Gene ID:2984)；(31)Mesothelin(Gene ID:10232)；(32)SLC44A4(Gene ID:80736)；(33)PSMA(Gene ID:2346)；(34)EphA2(Gene ID:1969)；(35)AGS-5；(36)GPC-3(Gene ID:2719)；(37)c-KIT(Gene ID:3815)；(38)RoR1(Gene ID:4919)；(39)PD-L1(Gene ID:29126)；(40)CD27L(Gene ID:970)；(41)5T4(Gene ID:7162)；(42)Mucin 16(Gene ID:94025)；(43)NaPi2b(Gene ID:10568)；(44)STEAP(Gene ID:26872)；(45)SLITRK6(Gene ID:84189)；(46)ETBR(Gene ID:1910)；(47)BCMA(Gene ID:608)；(48)Trop-2(Gene ID:4070)；(49)CEACAM5(Gene ID:1048)；(50)SC-16；(51)SLC39A6(Gene ID:25800)；(52)Delta-like protein3(DLL3)(Gene ID:10683)；(53)Claudin 18.2(Gene ID:51208)。
如本文所用，“药物”泛指任何具有期望的生物活性，并具有反应性官能团以便制备本发明所述偶联物的化合物。期望的生物活性包括，诊断，治愈，缓解，治疗，预防人或其它动物的疾病。因此，只要具有必需的反应性官能团，术语“药物”涉及的化合物包括正式国家药典，以及例如美国正式同种疗法药典，正式全国处方集，或者其任何增补本等确认的药物。 典型的药物列于医师案头用药参考(PDR)和美国食品药品监督管理局(FDA)的橙皮书。随着新型药物不断被发现和发展，本专利规定这些药物也应纳入本发明所述偶联药物的中的“药物”。
较佳地，所述的药物是指：用于癌症治疗的细胞毒性药物，或具有期望生物活性的蛋白或多肽，例如一种毒素，如相思子毒素，蓖麻毒素A，假单胞菌外毒素，和白喉毒素；其他合适的蛋白包括肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经原生长因子，血小板衍生生长因子，组织型纤酶溶原生长因子，以及生物反应调节制剂，例如淋巴因子，白细胞介素-1(IL-1),白细胞介素-2(IL-2),白细胞介素-6(IL-6),粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),粒细胞集落刺激因子，或其它生长因子。
一种优选的本发明药物是美登素或类美登素。美登素化合物通过抑制微管蛋白的微管形成来抑制细胞增殖。类美登素是美登素的衍生物。美登素和类美登素都具有高效的细胞毒性，但是它们在癌症治疗的临床应用上具有很大的局限性，这主要是源于此类分子对肿瘤的低选择性。但是，这种高细胞毒性促使它们成为抗体药物偶联物的首选药物部分。以下列出了去乙酰基美登素的结构。
另一种优选的本发明药物是耳抑素肽类药物。耳抑素肽类药物是海兔毒素10(Dolastatin10)的类似物，而后者是从海洋软体动物海兔体内分离出来的具有生物活性的多肽。海兔毒素10通过结合微管蛋白(与长春新碱同样的结合区域)而抑制微管蛋白聚合。海兔毒素10，耳抑素肽PE，耳抑素肽E都是线性多肽，含有四个氨基酸(其中三个氨基酸是海兔毒素类化合物所独有的)和C-端酰胺基团。两个代表性的耳抑素肽类化合物，单甲基耳抑素肽E(MMAE)和单甲基耳抑素肽F(MMAF)，都是抗体药物偶联物的首选药物。
另一种优选的本发明药物是微管溶素(Tubulysin)。微管溶素首先由研究小组从粘细菌培养物中分离，是非常有效的细胞生长抑制剂，其通过抑制微管蛋白聚合并从而诱导细胞凋亡而起作用。微管溶素中的微管溶素D是最有效的，具有超过大多数其他微管蛋白调节剂(包括埃博霉素、长春碱和紫杉醇)10至100倍的活性。紫杉醇和长春碱目前用于多种癌症的治疗，而埃博霉素衍生物正在临床试验中进行活性评价。微管溶素D的合成衍生物将提供与抑制和关键结合相互作用有关的必要信息，并且作为抗癌剂可以具有优越的性质，所述抗癌剂作为分离的实体或作为靶向抗体或配体上的化学弹头。微管溶素D是复杂的四肽，其可以分为四 个区域，Mep(D-N-甲基哌啶甲酸)、Ile(异亮氨酸)、Tuv(管式缬氨酸，tubuvaline)和Tup(管式苯丙氨酸，tubuphenylalanine)，如下式所示：
另一种优选的本发明药物是可抑制微管聚合的微生物来源的cryptophycin衍生物。Cryptophycin是从蓝藻的培养物中分离得到的一种能抑制微管生成的新型抗肿瘤活性物质，对多种肿瘤有活性。Cryptophycin是一个脂溶性化合物，含有2个肽键及2个酯键，有5个光学活性中心及1个环氧基团。双肽双酯键都在一个大环结构中。Cryptophycin衍生物CP1和CP2结构如下式所示：
另一种优选的本发明药物是新型抗微管剂Taltobulin(HTI-286、SPA-110)。Taltobulin抑制纯化微管的多聚化，干扰细胞内微管组织、诱导有丝***阻断以及诱导细胞凋亡。Taltobulin是细胞增殖强效抑制剂，对18种人肿瘤细胞系的平均IC50为2.5nM。和目前应用的抗微管剂相比，Taltobulin并不是p-糖蛋白的合适的底物，其中Taltobulin结构如下式所示。
一方面，药物是喜树碱类药物衍生物SN-38。SN-38是伊立替康盐酸盐(CPT-11)的生物活性代谢物，为一类拓扑异构酶抑制剂。SN-38引起DNA拓扑异构酶I的抑制最强，剂量依赖性和时间依赖性地抑制DNA的合成，并造成频繁的DNA单链断裂。其中SN-38结构如下式所示。
另一种优选的本发明药物是鹅膏覃碱类药物(alpha-Amanitin)，结构如下式所示。alpha-Amanitin是一种来自毒蘑菇鬼笔鹅蕈(Amanita phalloides)的真菌毒素，二环八肽，能抑制真核RNA聚合酶Ⅱ与RNA聚合酶Ⅲ转录。
另一种优选的本发明药物是苯并二吡咯类抗生素(duocarmycins,CC-1065等)和其它的环丙基吡咯吲哚-4-酮(cyclopropapyrroloind-4-one,CPI)衍生物。这类化合物是有效的DNA小沟结合-烷基化试剂。环丙苯并吲哚-4-酮(cyclopropabenzindol-4-one，CBI)类似物的化学结构更稳定，生物活性更高，而且与它们含有天然CPI烷基化亚基的父系化合物相比更容易合成。一个代表性的CBI衍生物是酚羟基保护衍生物CBI，具有弱化的前药毒性和增强的水溶性(其中CBI-seco类结构通式如下式所示)：
另一种优选的本发明药物是吡咯并苯二氮卓类(pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepines，PBDs)或者PBD二聚体类(PBD dimers)。PBD是一类由链霉菌产生的天然产物，其独特特性在于能够在DNA小沟，确切是在嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列处，形成非扭曲的共价加和物。应用PBD作为部分小分子策略靶向锁定DNA序列以及作为新型的抗癌和抗菌药物引起了越来越多的兴趣。应用一个柔性碳链连接两个PBD单元的C8/C8’的羟基基团，所得的二聚体具有增强的生物活性。PBD二聚体被认为是可以产成序列选择性的DNA损伤，例如倒序的5’-Pu-GATC-Py-3’链间交联，从而导致其生物活性。这些化合物已被证明是高效的细胞毒性药物，可作为抗体药物偶联物的备选药物。
另一种优选的本发明药物是PNU-159682衍生物，PNU-159682是Nemorubicin在人肝微粒体中的主要活性代谢产物，与MMDX和阿霉素相比，活性提高3000倍。
另一方面，药物并不仅仅局限于上述提到的类别，还包括所有可用于抗体药物偶联物的药物。并且尤其是那些能够通过与接头的酰胺键来配位，如通过具有碱性胺基(一级胺或二级胺)来配位的细胞毒素，例如上文中所示的细胞毒素D1-D12的结构。
按照在细胞内药物释放的机制，“连接子”或“抗体药物偶联物的连接子”可被分为两类：不可断裂连接子和可断裂连接子。
对于含有不可断裂连接子的抗体药物偶联物，其药物释放机制为：偶联物与抗原结合并被细胞内吞后，抗体在溶酶体中被酶解，释放出由小分子药物，连接子，和抗体氨基酸残基共同组成的活性分子。由此带来的药物分子结构改变并不减弱其细胞毒性，但由于活性分子是带电荷的(氨基酸残基)，从而导致其不能渗入邻近细胞。因此，此类活性药物不能杀死邻 近不表达靶向抗原(抗原阴性细胞)的肿瘤细胞(旁观者效应,bystandereffect)。
可断裂连接子，顾名思义，可以在目标细胞内断裂并释放出活性药物(小分子药物本身)。可断裂连接子可分为两个主要的类别：化学不稳定连接子和酶不稳定连接子。化学不稳定连接子可以由于血浆和细胞质性质的不同而选择性的断裂。这样的性质包括pH值，谷胱甘肽浓度等。对pH值敏感的连接子，通常又称为酸断裂连接子。这样的连接子在血液的中性环境下相对稳定(pH7.3-7.5)，但是在弱酸性的内涵体(pH5.0-6.5)和溶酶体(pH4.5-5.0)内将会被水解。第一代的抗体药物偶联物大多应用这类连接子，例如腙，碳酸酯，缩醛，缩酮类。由于酸断裂连接子有限的血浆稳定性，基于此类连接子的抗体药物偶联物通常具有较短的半衰期(2-3天)。这种较短的半衰期在一定程度上限制了pH敏感连接子在新一代抗体药物偶联物中的应用。
对于谷胱甘肽敏感的连接子，又称二硫键连接子。药物释放是基于细胞内谷胱甘肽的高浓度(毫摩尔范围)与血液中相对较低的谷胱甘肽浓度(微摩尔范围)差异引起的。对于肿瘤细胞而言尤其如此，其低含氧量导致还原酶的活性增强，因而导致更高的谷胱甘肽浓度。二硫键具有热力学稳定性，因此在血浆中具有较好的稳定性。
酶不稳定连接子，如肽连接子，能够更好地控制药物释放。肽连接子能够被溶酶体内蛋白酶，如组织蛋白酶(CathepsinB)或纤溶酶(在一些肿瘤组织中此类酶含量增加)，有效地切断。这种肽连接被认为在血浆循环中非常稳定，这是因为细胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制剂导致蛋白酶通常在不具备活性。鉴于较高的血浆稳定性和良好的细胞内断裂选择性和有效性，酶不稳定连接子被广泛用做抗体药物偶联物的可断裂连接子。典型的酶不稳定连接子包括Val-Cit(VC),Phe-Lys等。
自释放连接子一般嵌合在可断裂连接子与活性药物之间，或者本身就是可断裂连接子的一部分。自释放连接子的作用机制是：当可断裂连接子在合宜的条件下断裂后，自释放连接子能够自发地进行结构重排，进而释放与之连接的活性药物。常见的***式连接子包括对氨基苄醇类(PAB)和β-葡萄糖醛酸苷类(β-Glucuronide)等。
连接子
本发明的连接子或偶联试剂，包含二芳硫基马来酰胺单元和一个偶联基团。二芳硫基马来酰胺单元用于交联抗体链间的巯基基团(还原后)，而偶联基团用于与小分子药物或药物-连接子单元偶联。由于该二芳硫基马来酰胺单元与抗体中的开放半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的两个硫原子的二齿结合(bidentate binding)，因此这些ADC是均质的并比含有单齿接头的ADC具有更强的稳定性。因此它们将具有增长的体内半衰期，减少全身性释放的细胞毒素的量，并且比具有单齿接头的ADC更加安全的药物性质。
在另一个方面，所产生的药物-连接子单元通过该连接子与抗体偶联，生成部分链间交联的偶联物。与传统的抗体药物偶联物相比，应用本发明方法制备的抗体药物偶联物的药物/抗体比值(DAR)分布更窄，从而大幅提升了产品均一性及药理学特性均一性。
该抗体药物偶联物可用于靶向输送药物到达目标细胞群体，例如肿瘤细胞。抗体药物偶联物可以特异性的与细胞表面蛋白结合，所产生的结合物随即被细胞内吞。在细胞内，药物以活性药物的方式释放出来产生功效。抗体包括嵌合抗体，人源化抗体，人抗体；可与抗原结合的抗体片段；或者抗体Fc融合蛋白；或者蛋白。“药物”是高活性药物(见定义部分)，在某种情况下，药物可以是聚乙二醇。
抗体-药物偶联物
本发明提供的抗体药物偶联物由抗体、连接子、连接子和药物组成，所述连接子是可断裂连接子组合或不可断裂连接子。
抗体是球状蛋白，含有一系列氨基酸位点可用于偶联药物-连接子。由于其三级和四级结构，只有溶剂可及的氨基酸可供偶联。事实上，高收率的偶联通常发生在赖氨酸残基的ε-氨基基团或半胱氨酸残基的巯基基团上。
抗体蛋白表面的大量赖氨酸侧链导致大量的位点可供药物偶联，从而导致生成的抗体药物偶联物是混合物，含有不同的药物偶联数量(药物/抗体比值，DAR)和偶联位点。
本发明提供的偶联产品，尽管仍然是混合物，但与传统方式偶联得到的抗体药物偶联物相比，其DAR分布范围很窄。其平均DAR值接近4，接近最佳抗体药物偶联物平均DAR值(2-4)范围。此外，偶联产品极少不含有裸抗(DAR＝0)，这一组分对细胞毒杀不起作用。同时，偶联产品也不含有重度偶联产品(DAR＝8),这一组分在体内的清除速度很快，相对于低DAR的组分而言。因此，本发明提供的抗体药物偶联物产品非均一性得到很大的改善。
抗体-药物偶联物的制备方法
抗体药物偶联物制备路线如下所示。抗体链间二硫键被还原产生共8个巯基基团骤，取代马来酰胺类连接子药物缀合物与还原后的抗体巯基交联，生成相应的抗体药物偶联物，其中该抗体药物偶联物存在如以下反应中的一种或二种形式。
将抗体原液用反应缓冲液稀释至2-10mg/mL，加入140-200倍过量摩尔比的二硫苏糖醇(DTT)，或加入6.0-20倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于10-35℃搅动2-48小时；在此所述反应缓冲液可以是按以下比例制备的缓冲液：50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH2PO4-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9；50mM磷酸氢二钠-柠檬酸/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9；50mM硼酸-硼砂/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9；50mM组氨酸-氢氧化钠/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9和PBS//1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9。
将上述反应液冷至0-10℃，若采用DTT还原，需在还原反应完成后过脱盐柱或超滤除去过量的DTT，再加入取代马来酰胺类化合物(预先10mg/ml溶在乙腈(ACN)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)或二乙基乙酰胺(DMA)中)，并保证反应液中有机溶剂的体积占比不超过15％，偶联反应于0-37℃搅动2-4小时。若采用TCEP还原，也可不需除去剩余TCEP，直接加入取代马来酰胺类化合物进行偶联。
采用脱盐柱将偶联反应混合物用琥珀酸钠/NaCl缓冲液或组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。或超滤数遍。然后过滤除菌，所得产物低温保存。优选温度为-100—60℃，过滤装置的孔径优选0.15-0.3微米。
所得抗体药物偶联物的药物抗体偶联比(DAR)较为均一，采用本专利中所述的不同取代马来酰胺连接头也将产物均一性有一定差别的抗体药物偶联物，如需要获得均一性更好的样品，可进一步利用但不限于以下方法进行分离纯化：疏水作用层析方法(HIC)、分子排阻色谱法(SEC)、离子交换层析(IEC)。
药物组合物和施用方法
由于本发明提供的抗体-药物偶联物，可以靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，从而通过结合物内吞或药物渗入使得药物以活性形式释放到细胞内，因此，本发明的抗体-药物偶联物可以用于治疗目标疾病，上面提到的抗体-药物偶联物可以以治疗有效量，通过合适的途径给予受试者(例如人)。需要治疗的受试者可以是有风险，或怀疑患有与特定抗原的活性或表达量有关病症的患者。这样的患者可以通过常规体检来鉴定。
常规方法，已知的医学领域的普通技术人员，可以用于施用药物组合物给受试者，这取决于疾病的要治疗的类型或疾病的部位。此组合物还可以通过其它常规途径，例如，口服、肠胃外给药、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、口腔、***或通过植入进行给药。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。此外，它可以施用到通过施用可注射的贮库途径，例如使用1-，3-，或6个月的贮库可注射或可生物降解的材料和方法的主题。
注射组合物可以含有各种载体如植物油，二甲基乙酰胺(dimethylactamide)，二甲基甲酰胺，乳酸乙酯，碳酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇，多元醇(甘油，丙二醇，液体聚乙二醇，等等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过点滴方法，由此含有抗体和生理上可接受的赋形剂的药物制剂输注给药。生理上可接受的赋形剂可以包括，例如，5％葡萄糖，0.9％盐水，林格溶液或其它合适的赋形剂。肌内制剂，例如，抗体的一个合适的可溶盐形式的无菌制剂，可以溶解和施用的药用赋形剂诸如水换注射液，0.9％盐水，或5％葡萄糖溶液。
当用本发明的抗体-药物偶联物治疗时，可以通过本领域常规的方法进行递送。例如，它可以通过使用脂质体、水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊、或生物粘附性微球被引入到细胞中。或者，所述核酸或载体可在本地通过直接注射或通过使用输注泵递送。其它方法包括通过使用缀合物和生物可降解的聚合物的使用各种运输和载体***。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的抗体-药物偶联物以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成溶液剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。
本发明所述的抗体-药物偶联物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的双功能抗体偶联物的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的抗体-药物偶联物每天以约0.0001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
实验表明，本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的新型连接子，可通过简单的化学方法与抗体偶联，与传统抗体药物偶联物相比，应用这种连接子得到的偶联物DAR值分布非常窄，因此生成的产品均一性高，获得的交联物单一分布的组份(DAR为4)占比80％以上。
2、本发明提供的抗体-药物偶联物，裸抗和低交联度的ADC占比几乎为零(质谱检测不出DAR为0和1的组份)。
3、申请人通过大量的实验证明，本发明提供的抗体-药物偶联物，在***方面具有一定安全性和有效性。偶联后乙二醇所赋予的亲水性可以用来调节生物分子特性；交联物的体外肿瘤细胞增殖抑制活性较传统mcVC-PAB交联生物学活性、药物代谢稳定性、安全性等成药性质方面有所提高或保持。
4、本发明提供的偶联方法，适用于大部分抗体，从而可以避免对每一种抗体进行繁琐的重组改造以引入定点偶联位点，因此具有广泛的应用前景。
5、本发明提供的偶联方法与现有偶联方法相比，本发明的基于马来酰胺的二硫链桥接交联试剂的优点包括：具有较快的交联速度，交联反应时间通常在2-4小时以内便可反应完毕。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
一、化合物合成与制备方法
方案一：
本发明第一方面中列出的式Ia所代表的取代马来酰胺类连接子片断分子可通过方案一中的方法合成，通过n甘醇与氟代硝基苯取代反应得到中间体B，后经还原硝基获得氨基化合物C，2,3-二溴马来酰亚胺与芳基硫酚进行取代反应后获得中间体D，后与氯甲酸甲酯反应获得中间体E，2,3-二溴马来酰亚胺也可直接与氯甲酸甲酯反应获得中间体E’，中间体C与中间体E或中间体E’反应获得连接子片断分子F。反应路线与具体实例举例如下：
实施例1(式1-12化合物的合成与制备)
1.1化合物F-1(式1)的合成
1.1.1中间体B-1的合成(步骤a)
称取4-氟硝基苯(10.0g，0.071mol)，二甘醇(75.2g，0.71mol)和碳酸钾(14.7g，0.11mol)置于250mL圆底瓶，氮气保护下在80℃搅拌22小时。慢慢降温至室温，二氯甲烷萃取，依次用1mol/L稀盐酸、水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂。柱层析(硅胶，200-300目，PE/EtOAC10:1)得到产物，淡黄色透明液体(15.1g，产率94％)。LC-MS(M+)理论值:227.08，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:228.12。
1.1.2中间体C-1的合成(步骤b)
中间体化合物B-1(3.0g，9.52mmol)溶在丙酮(30mL)，冰水浴冷却，慢慢滴加新鲜制备琼斯试剂(15mL)，反应混合物室温搅拌3小时，冰水浴冷却，慢慢滴加异丙醇，冰水浴中继续搅拌15分钟后，旋蒸除去有机溶剂，***萃取水相3次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得黄色油状粗品，该中间体不经纯化分离直接用于下步反应。上述中间体溶于四氢呋喃(30mL)中，加入10％钯炭(300mg)，在30℃氢化反应6小时。抽滤除去催化剂后，旋蒸除去溶剂，得棕黄色油状粗品。不需进一步纯化用于下步反应。LC-MS(M+)理论值:211.08，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:212.05。
1.1.3中间体D-1的合成(步骤c)
2,3-二溴马来酰亚胺(7.0g，27.69mmol)溶于甲醇(80mL)中，依次加入乙酸钠(4.5g，55.4mmol)和苯硫酚(11.3mL，110.7mmol)。反应混合物室温搅拌30分钟，旋蒸除去有机溶剂，二氯甲烷萃取，依次用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂。粗品用石油醚/乙酸乙酯重结晶，抽滤干燥，得亮黄色固体D-1(6.5g，产率75％)。
1.1.4中间体E-1的合成(步骤d)
中间体D-1(3.0g，9.6mmol)和N-甲基***啉(1.37mL，12.5mmol)溶于乙酸乙酯(40mL)中，冰水浴冷却，慢慢滴加入氯甲酸甲酯(1.11mL，14.4mmol)，反应混合物室温搅拌30分钟。反应液用乙酸乙酯稀释后，加水萃取，依次用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂。粗品用石油醚/乙酸乙酯重结晶，抽滤干燥，得亮黄色固体E-1(3.5g，产率98％)。
1.1.5化合物F-1的合成(步骤e)
中间体C-1(2.0g，9.5mmol)溶于无水二氯甲烷(40ml)中，加入中间体E-1(3.5g，9.5mmol)，氮气保护下反应混合物室温搅拌24小时，称取硅胶(12g，200-300目)加入，反应混合物继续室温搅拌过夜。旋干溶剂，干法柱层析(硅胶，200-300目，二氯甲烷/甲醇10:1)得到产物F-1为橘黄色油状(4.1g，产率85％)。LC-MS(M+)理论值:507.08，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:508.11。
1.2化合物F-2(式2)的合成
化合物F-2的合成与例1.1中化合物F-1的合成步骤相同，只是将步骤a中的二甘醇换为三甘醇。经5步反应得到产物F-2为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:551.11，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:552.13。
1.3化合物F-3(式3)的合成
化合物F-3的合成与例1.1中化合物F-1的合成步骤相同，只是将步骤a中的二甘醇换为四甘醇。经5步反应得到产物F-3为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:595.13，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:596.14。
1.4化合物F-4(式4)的合成
化合物F-3的合成与例1.1中化合物F-1的合成步骤相同，只是将步骤a中的二甘醇换为五甘醇。经5步反应得到产物F-3为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:639.16，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:640.18。
1.5化合物F-5(式5)的合成
化合物F-3的合成与例1.1中化合物F-1的合成步骤相同，只是将步骤a中的二甘醇换为六甘醇。经5步反应得到产物F-3为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:683.19，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:684.21。
1.6化合物F-6(式6)的合成
化合物F-3的合成与例1.1中化合物F-1的合成步骤相同，只是将步骤a中的二甘醇换为八甘醇。经5步反应得到产物F-3为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:771.24，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:772.26。
1.7化合物F-7(式7)的合成
化合物F-3的合成与例1.1中化合物F-1的合成步骤相同，只是将步骤a中的二甘醇换为十甘醇。经5步反应得到产物F-3为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:895.29，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:896.31。
1.8化合物F-8(式8)的合成
化合物F-8的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤c中的苯硫酚换为对甲 基苯硫酚。共经5步反应得到产物F-8为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:623.16，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:624.18。
1.9化合物F-9(式9)的合成
化合物F-9的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤c中的苯硫酚换为对甲氧基苯硫酚。共经5步反应得到产物F-9为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:655.15，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:656.17。
1.10化合物F-10(式10)的合成
化合物F-9的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤c中的苯硫酚换为4-(N-甲基甲酰胺)苯硫酚。共经5步反应得到产物F-10为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:709.18，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:710.23。
1.11化合物F-11(式11)的合成
化合物F-10的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤c中的苯硫酚换为2-巯基吡啶。共经5步反应得到产物F-10为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:597.12，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:598.13。
1.12化合物F-12(式12)的合成
化合物F-11的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤c中的苯硫酚换为2-巯基嘧啶。共经5步反应得到产物F-11为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:599.11，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:600.13。
1.13化合物F-13(式13)的合成
化合物F-12的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤a中的对氟硝基苯换为间氟硝基苯。共经5步反应得到产物F-12为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:595.13，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:596.15。
1.14化合物F-14(式14)的合成
化合物F-12的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤e中的中间体E换为溴代的中间体E’。共经4步反应得到产物F-13为无色油状。LC-MS(M+)理论值:534.95，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:536.01。
1.15化合物F-15(式15)的合成
化合物F-15的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤c中的苯硫酚换为2-巯基-1-甲基咪唑。共经5步反应得到产物F-15为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:603.15，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:604.14。
1.16化合物F-16(式16)的合成
化合物F-16的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤c中的苯硫酚换为4-(N-吗啉甲酰胺)苯硫酚。共经5步反应得到产物F-16为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:821.23，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:822.21。
1.17化合物F-17(式17)的合成
化合物F-17的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤c中的苯硫酚换为4-(N-2-甲氧基乙基甲酰胺)苯硫酚。共经5步反应得到产物F-17为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:797.23，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:798.31。
1.18化合物F-18(式18)的合成
化合物F-18的合成与例1.3中化合物F-3的合成步骤相同，只是将步骤c中的苯硫酚换为4-(N-甲氧基-N-甲基甲酰胺)苯硫酚。共经5步反应得到产物F-18为橘黄色油状。LC-MS(M+)理论值:769.20，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:770.28。
式Ia所代表的取代马来酰胺类连接子片断分子还可通过以下反应路线中所示的方法合成，通过n甘醇与氟代硝基苯取代反应得到中间体B，后经与溴乙酸叔丁酯反应获得中间体Z，中间体Z还可通过n甘醇与与溴乙酸叔丁酯反应后再与溴乙酸叔丁酯进行取代反应获得；中间体Z经还原得到中间体Y；2,3-二溴马来酰亚胺与芳基硫酚进行取代反应后获得中间体D，后与氯甲酸甲酯反应获得中间体E，中间体E与中间体Y反应获得中间体X，中间体X中的叔丁酯在酸性条件下脱除获得连接子片断分子W。反应路线举例如下：
方案二：
本发明第二方面中列出的式Ib所代表的取代马来酰胺类连接子药物缀合物(式13-式19)可通过方案二中所列的路线进行合成，通过化合物F与细胞毒药物CTD(D1-D11，毒性药物分子可通过商业渠道获得)进行缩合偶联，可获得系列分子G。反应路线与具体实例举例如下：
实施例2(式19-25化合物的合成与制备)
2.1化合物G-1(式19)的合成
化合物F-3(200mg，0.34mmol)与化合物D1(220mg,0.34mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10 mL)中，室温下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(77mg，0.40mmol)与1-羟基苯并***(HOBT)(54mg,0.40mmol)，反应混合物室温搅拌过夜。反应液用乙酸乙酯稀释后，加水萃取，依次用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂。粗品通过硅胶层析柱分离纯化(二氯甲烷/甲醇)，抽滤干燥，得黄色无定形固体G-1(3.5g，产率98％)。LC-MS(M+)理论值:1226.40，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1227.42。
2.2化合物G-2(式20)的合成
化合物G-2的合成与例2.1中化合物G-1的合成步骤相同，只是将其中的化合物D1换为化合物D2。得到产物G-2为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1294.63，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1295.64。
2.3化合物G-3(式21)的合成
化合物G-3的合成与例2.1中化合物G-1的合成步骤相同，只是将其中的化合物D1换为化合物D3。得到产物G-3为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1308.61，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1309.63。
2.4化合物G-4(式22)的合成
化合物G-4的合成与例2.1中化合物G-1的合成步骤相同，只是将其中的化合物D1换为化合物D9。得到产物G-4为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1302.41，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1303.43。
2.5化合物G-5(式23)的合成
化合物G-5的合成与例2.1中化合物G-1的合成步骤相同，只是将其中的化合物D1换为化合物D6。得到产物G-5为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1290.51，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1291.53。
2.6化合物G-6(式24)的合成
化合物G-6的合成与例2.1中化合物G-1的合成步骤相同，只是将其中的化合物D1换为化合物D7。得到产物G-6为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1274.44，LC-MS(ESI,M+H+)实测值1275.45。
2.7化合物G-7(式25)的合成
化合物G-7的合成与例2.1中化合物G-1的合成步骤相同，只是将其中的化合物D1换为化合物D11。得到产物G-7为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1291.38，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1292.40。
方案三：
本发明第二方面列出的式Ib所代表的取代马来酰胺类连接子药物缀合物(式22-式41)可通过方案三中所列的路线进行合成，通过化合物F与二肽/三肽-PAB连接子的氨基(该连接子可通过商业渠道获得)进行缩合，PAB基团再与二(对硝基苯)碳酸酯活化后与细胞毒药物CTD(D1-D11)进行缩合偶联，可获得系列分子K。反应路线与具体实例举例如下：
3.1化合物K-1(式26)的合成
3.1.1中间体I-1的合成(步骤f)
化合物F-3(2.0g，3.36mmol)溶于无水N,N二甲基甲酰胺(25ml)中，氮气保护下依次加入EDCI(963mg，5.04mmol)，HOBt(681mg，5.04mmol)和N-甲基***啉(1.11ml，10.08mmol)，反应混合物氮气保护下室温搅拌20分钟，最后加入化合物H-1(Val-Cit-PAB,1.91g，5.04mmol)。反应混合物氮气保护下室温搅拌过夜。旋干溶剂，干法柱层析(硅胶，200-300目，DCM/MeOH10:1)得到产物I-1为橘黄色油状(2.0g，产率62.2％)。LC-MS(M+)理论值:1631.60，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1632.62。
3.1.2中间体J-1的合成(步骤g)
化合物I-1(1.5g，1.57mmol)溶于无水N,N二甲基甲酰胺(10mL)中，氮气保护下依次加入N,N-二异丙基乙胺(0.52mL，3.14mmol)和二(对硝基苯)碳酸酯(717mg，2.335mmol)，室温搅 拌15小时。旋干溶剂，干法柱层析(硅胶，200-300目，DCM/MeOH 20:1)得到产物J-1为橘黄色油状(1.4g，产率79.9％)。LC-MS(M+)理论值:1121.35，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1122.37。
3.1.3化合物K-1的合成(步骤h)
化合物J-1(0.5g，0.52mmol)与溶于无水N,N二甲基甲酰胺(5mL)中，氮气保护下依次加入N,N-二异丙基乙胺(0.172mL，1.04mmol)，HOBt(70mg，0.52mmol)和化合物D1(340mg,0.52mmol)，反应混合物氮气保护下室温搅拌过夜。旋干溶剂，干法柱层析(硅胶，200-300目，DCM/MeOH10:1)得到产物K-1为黄色无定形固体(310mg，产率36.33％)。LC-MS(M+)理论值:1631.60，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1632.62。
3.2化合物K-2(式27)的合成
化合物K-2的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D2(一甲基澳瑞他汀E)。共经3步反应得到产物K-2为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1699.83，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1610.85。
3.3化合物K-3(式28)的合成
化合物K-3的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的化合物F-3换为F-5，将步骤h中的化合物D1换为化合物D2(一甲基澳瑞他汀E)。共经3步反应得到产物K-3为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1787.88，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1788.90。
3.4化合物K-4(式29)的合成
化合物K-4的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的化合物F-3换为F-6，将步骤h中的化合物D1换为化合物D2(一甲基澳瑞他汀E)。共经3步反应得到产物K-4为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1875.93，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1876.95。
3.5化合物K-5(式30)的合成
化合物K-5的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的化合物F-3换为F-7，将步骤h中的化合物D1换为化合物D2(一甲基澳瑞他汀E)。共经3步反应得到产物K-5为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1963.99，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1965.01。
3.6化合物K-6(式31)的合成
化合物K-6的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的化合物H-1换为H-2(Val-Ala-PAB)，将步骤h中的化合物D1换为化合物D2(一甲基澳瑞他汀E)。共经3步反应得到产物K-6为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1613.78，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1614.80。
3.7化合物K-7(式32)的合成
化合物K-7的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的化合物H-1换为H-3(Phe-Lys-PAB)，将步骤h中的化合物D1换为化合物D2(一甲基澳瑞他汀E)。共经3步反应得到产物K-7为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1718.84，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1719.86。
3.8化合物K-8(式33)的合成
化合物K-8的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的化合物H-1换为H-4(Ala-Ala-Asn-PAB)，将步骤h中的化合物D1换为化合物D2(一甲基澳瑞他汀E)。共经3步反应得到产物K-8为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1699.79，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1700.80。
3.9化合物K-9(式34)的合成
化合物K-8的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的化合物H-1 换为H-5(D-Ala-Phe-Lys-PAB)，将步骤h中的化合物D1换为化合物D2(一甲基澳瑞他汀E)。共经3步反应得到产物K-9为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1789.88，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1790.90。
3.10化合物K-10(式35)的合成
化合物K-10的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D3(一甲基澳瑞他汀F)。共经3步反应得到产物K-10为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1713.81，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1714.83。
3.11化合物K-11(式36)的合成
化合物K-11的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D4(Monomethyl Dolastatin 10,MMAD)。共经3步反应得到产物K-11为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1752.80，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1753.82。
3.12化合物K-12(式37)的合成
化合物K-12的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D5(Tubulysin衍生物1)。共经3步反应得到产物K-12为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1506.59，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1507.61。
3.13化合物K-13(式38)的合成
化合物K-13的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D6(Tubulysin衍生物2)。共经3步反应得到产物K-13为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1695.71，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1696.73。
3.14化合物K-14(式39)的合成
化合物K-14的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D7(Cryptophycin衍生物)。共经3步反应得到产物K-14为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1679.64，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1680.66。
3.15化合物K-15(式40)的合成
化合物K-15的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D8(Taltobulin)。共经3步反应得到产物K-15为棕黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1455.65，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1456.67。
3.16化合物K-16(式41)的合成
化合物K-16的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D9(PBD dimer)。共经3步反应得到产物K-16为棕黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1707.61，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1708.63。
3.17化合物K-17(式42)的合成
化合物K-17的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D10(Duocarmycin衍生物1)。共经3步反应得到产物K-17为棕黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1618.55，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1619.57。
3.18化合物K-18(式43)的合成
化合物K-18的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D11(Duocarmycin衍生物2)。共经3步反应得到产物K-18为棕黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1696.58，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1697.60。
3.19化合物K-19(式44)的合成
化合物K-19的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤h中的化合物D1换为化合物D12(PNU-159682衍生物)。共经3步反应得到产物K-19为棕黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1737.61，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1738.68。
3.20化合物K-20(式45)的合成
化合物K-20的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的中间体F-3换为中间体F-14。共经3步反应得到产物K-20为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1639.64，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1640.61。
3.21化合物K-21(式46)的合成
化合物K-21的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的中间体F-3换为中间体F-11。共经3步反应得到产物K-21为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1701.82，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1702.86。
3.22化合物K-22(式47)的合成
化合物K-22的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的中间体F-3换为中间体F-16。共经3步反应得到产物K-22为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1925.92，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1926.88。
3.23化合物K-23(式48)的合成
化合物K-24的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的中间体F-3换为中间体F-16,将步骤h中的化合物D1换为化合物D11(Duocarmycin衍生物2)。共经3步反应得到产物K-24为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1848.64，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1849.58。
3.24化合物K-24(式49)的合成
化合物K-25的合成与例3.1中化合物K-1的合成步骤相同，只是将步骤f中的中间体F-3换为中间体F-16,将步骤h中的化合物D1换为化合物D13(SN38衍生物)。共经3步反应得到产物K-25为黄色无定形固体。LC-MS(M+)理论值:1714.64，LC-MS(ESI,M+H+)实测值:1715.61。
二、抗体偶联物制备方法与检测
实施例一：ADC-1的制备
将帕妥珠抗体原液用50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH2PO4-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 7.4反应缓冲液稀释至5mg/mL，加入6.0倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于35℃搅动10小时。
将上述反应液冷至8℃，未经纯化加入适量的二甲亚砜(DMSO)，再加入6倍过量摩尔比的化合物G-2(10mg/ml预先溶在DMSO中)，保证反应体系中DMSO的体积占比不超过15％，于37℃搅动3小时进行偶联。
采用脱盐柱将偶联反应混合物用pH 6.0的组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。然后经由0.15微米孔径的过滤装置除菌，-60℃保存。
实施例二：ADC-2的制备
将帕妥珠抗体原液用50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH2PO4-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 7.4反应缓冲液稀释至5mg/mL，加入10倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于10℃搅动4小时。
将上述反应液冷至5℃，未经纯化加入适量的二乙基乙酰胺(DMA)，再加入6倍过量摩尔比的化合物K-2(10mg/ml预先溶在DMA中)，保证反应体系中DMA的体积占比不超过10％，于25℃搅动2.5小时进行偶联。
采用脱盐柱将偶联反应混合物用pH 6.0的组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。然后经由0.22微米孔径的过滤装置除菌，-80℃保存。
实施例三：ADC-3的制备
将帕妥珠抗体原液用50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH2PO4-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 7.4反应缓冲液稀释至5mg/mL，加入20倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于15℃搅动2小时。
将上述反应液冷至10℃，未经纯化加入适量的乙腈(ACN)，再加入6倍过量摩尔比的化合物K-3(10mg/ml预先溶在ACN中)，保证反应体系中ACN的体积占比不超过10％，于10℃搅动4小时进行偶联。
采用脱盐柱将偶联反应混合物用pH 6.0的组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，然后过滤除菌，所得产物低温保存；如经由0.20微米孔径的过滤装置除菌，-90℃保存。
实施例四：ADC-4的制备
将帕妥珠抗体原液用50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH2PO4-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 7.4反应缓冲液稀释至5mg/mL，加入8倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于25℃搅动48小时。
将上述反应液冷至0℃，未经纯化加入适量的二甲基甲酰胺(DMF)，再加入6倍过量摩尔比的化合物K-4(10mg/ml预先溶在DMF中)，保证反应体系中DMF的体积占比不超过8％，于0℃搅动2小时进行偶联。
采用脱盐柱将偶联反应混合物用pH 6.0的组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。然后经由0.3米孔径的过滤装置除菌，-100℃保存。
将实施例二所得样品与帕妥珠单抗进行疏水作用层析(HIC)对比(图1)和、质谱对比(图2)，由此可知，应用本发明所述连接子得到的偶联物DAR值分布非常窄，其平均DAR值接近4，获得的交联物单一分布的组份(DAR为4)占比80％以上，因此生成的产品均一性高；经鉴定，m为3.0-4.2。将实施例二、三、四分别采用上述相同的方法进行分析，DAR可得到相同的结果，m均在1-5.0范围内。
三、抗体偶联物的生物学检测
1.分子结合实验检测
Biacore仪检测蛋白分子间亲和力的工作原理是基于表面等离子共振(SurfacePlasmon Resonance，SPR)技术。SPR是一种光学物理现象，当一束P偏振光在一定的角度范围内入射到棱镜端面，在棱镜与金属薄膜(Au)的界面将产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与 表面等离子波的传播常数相匹配时，引起金属膜内自由电子产生共振。分析时，先在传感芯片表面固定一层生物分子识别膜，然后将待测样品流过芯片表面，若样品中有能够与芯片表面的生物分子识别膜相互作用的分子，会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，通过检测SPR角度变化，获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等信息。
使用Biacore进行结合实验来检测Pertuzumab，ADC-2，ADC-4共3个批次单克隆样品与Human ErbB2的结合活性。
表1 3个单克隆抗体样品与Human ErbB2的亲和力和动力学参数
样品 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
Pertuzumab 1.902E+05 1.239E-03 6.517E-10
ADC-2 2.232E+05 1.294E-04 5.799E-10
ADC-4 1.956E+05 1.310E-04 6.969E-10
本实验用表面等离子共振技术表征3个单克隆抗体样品Pertuzumab,ADC-2，ADC-4与Human ErbB2的的结合活性，结果显示均有结合。实验结果表明，上述3个单克隆抗体样品与Human ErbB2的亲和力相似，均在0.5-0.7nM范围。
2.细胞水平ADC-2与Her2的亲和力测定实验
以下实验中所用的实验材料来源于：RPMI1640培养基、0.25％胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清、100×丙酮酸钠、100×青链霉素购自Gibco公司，异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的二抗购自Invitrogen公司,NCI-N87胃癌细胞来自中国科学院昆明细胞库。其他试剂均是分析纯。FACSCalibur流式细胞仪(BD)。
在本实施例中，研究了ADC-2，P-mcVC-MMAE，Pertuzumab与Her2高表达细胞结合的亲和力。
本实施例选择Her2高表达人胃癌NCI-N87细胞。NCI-N87细胞在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中于37℃，5％CO2培养箱中培养，取传代培养4～5天的细胞计数，收集细胞至15mL离心管中，用冷PBS洗涤细胞2次，4℃条件，1000rpm离心5min，用含5％胎牛血清的PBS重悬细胞，37℃条件孵育30min，然后4℃，1000rpm离心5min，去上清，用冷PBS重悬细胞，按1×106细胞/1.5mL分装至EP管中，4℃，1000rpm离心5min，去上清，加入0.5mL不同浓度的ADC-2、P-mcVC-MMAE、Pertuzumab、人IgG，冰上放置40min,4℃，1000rpm离心5min，用1mL冷PBS洗涤2次，加入200μL荧光标记(FITC)标记的二抗，冰上避光放置40min后，4℃，1000rpm离心5min，去上清，1mL冷PBS洗涤2次，加入0.5mL冷PBS重悬细胞，冰上避光放置，采用FACSCalibur流式细胞仪检测测定不同浓度的ADC-2、P-mcVC-MMAE、Pertuzumab与细胞结合的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)，人IgG结合的荧光强度为非特异性结合。
如图3所示，ADC-2、P-mcVC-MMAE、Pertuzumab单抗均能与NCI-N87细胞表面抗原Her2结合，且随着抗体浓度的增加，ADC-2、P-mcVC-MMAE、Pertuzumab与Her2受体的结合也增加，三者与NCI-N87细胞Her2结合的亲和力相当，没有明显差别。
3.体外细胞增殖测定生物活性实验
以下实验中所用的实验材料来源于：DMEM培养基、DMEM/F12K培养基、RPMI 1640培养基、0.25％胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清、100×丙酮酸钠、100×青链霉素购自Gibco公司。磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)购自Sigma公司。BT-474人乳腺癌细胞、SK-RB-3人乳腺癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞、NCI-N87人胃癌细胞来自中国科学院昆明细胞 库，Panc-1人胰腺癌、MDA-MB-468人乳腺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞来自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，SKOV-3人卵巢癌细胞、Du-145人***癌细胞来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。其它试剂均为分析纯。96孔平底聚苯乙烯(Corning，产品目录号3599)。Synergy 2酶标仪(Bio-Tek)。
在本实施例中，研究了ADC-2，ADC-4，P-mcVC-MMAE,Kadcyla，Pertuzumab对肿瘤细胞系增殖的作用。
本实施例使用磺酰罗丹明B(SRB)比色法来评价药物组合的抗增殖作用。SRB是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在510nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。本实施例选择的细胞系有：BT-474、SK-RB-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7人乳腺癌细胞、NCI-N87人胃癌细胞、SKOV-3人卵巢癌细胞、Du-145人***癌细胞、Panc-1人胰腺癌。
BT-474、SK-BR-3、NCI-N87细胞在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中,SKOV-3、Du-145、Panc-1、MCF-7、MDA-MB-231细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中,MDA-MB-468细胞在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，于37℃，5％CO2培养箱中培养至对数生长期，将处于对数生长期的上述细胞分别以2×103～9×103个细胞每孔的密度接种至96孔培养板，每孔100μL，培养24小时后，加入不同浓度的药物作用5天，分别以3、4或5-倍稀释制备9个浓度，每个浓度设复孔，并设相应浓度的溶媒对照及无细胞培养基孔。药物作用结束后，倾去培养液，加入4℃预冷的三氯乙酸溶液(30％，w/v)100μl，于4℃固定1小时，随后用去离子水冲洗5遍，室温干燥后，每孔加入0.4％(w/v)的SRB染液(Sigma，1％冰乙酸配制)100μL，室温下孵育染色30min后，用1％冰乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。每孔加入10mMTris溶液100μL，室温下孵育染色15min后，用1％冰乙酸冲洗五次洗去未结合的SRB，室温干燥后，每孔加入10mM Tris缓冲液(pH＝10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，采用Synergy 2酶标仪(Bio-Tek)波长510nm和690nm处测定光吸收值(OD值)，并得到A＝OD510-OD690。
抑制率(％)＝(A对照-A给药)/A对照×100％。
本实验使用了ADC-2，ADC-4，P-mcVC-MMAE,Kadcyla，Pertuzumab对多种Her2高表达的肿瘤细胞系进行了体外细胞培养增殖作用的研究，同时使用ADC-2对多种非Her2高表达的肿瘤细胞系也进行了体外细胞培养增殖作用的研究。如图4-6所示，ADC-2、P-mcVC-MMAE、Kadcyla处理Her2高表达的SK-BR-3和BT-474人乳腺癌细胞、NCI-N87人胃癌细胞，均能明显抑制肿瘤细胞增殖，ADC-2和P-mcVC-MMAE对肿瘤细胞增殖抑制活性要明显高于Kadcyla，ADC-2与P-mcVC-MMAE的抗肿瘤细胞增殖活性基本相当，其中ADC-2对BT-474肿瘤细胞增殖抑制活性略高于P-mcVC-MMAE；与Pertuzumab裸抗比较，抗体药物偶联物ADC-2、P-mcVC-MMAE、Kadcyla对肿瘤细胞增殖抑制活性都显著提高。如图7所示，ADC-2对非Her2高表达的SKOV-3人卵巢癌细胞、Du-145人***癌细胞和Panc-1人胰腺癌，也显示出良好的肿瘤细胞增殖抑制作用。对不表达Her2的人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞，ADC-2抗肿瘤细胞增殖活性则显著降低(图8)，表明抗体药物偶联物ADC-2对不表达靶标抗原的细胞基本无作用，因而，预示其毒副作用将明显降低。如图9所示，ADC-4对Her2高表达的NCI-N87人胃癌细胞显示强效肿瘤细胞增殖抑制作用。此外，如图10所示，ADC-2、ADC-3与ADC-4对于Her2中表达的Calu-3人肺癌细胞显示强效肿瘤细胞增殖抑制作用。
4.体内抗肿瘤功效测定实验
可以在体内测量本发明的组合的功效，即在啮齿类动物中植入癌细胞的同种异体移植物或异种移植物，并用所述组合处理肿瘤。将受试小鼠用药物或对照处理，并监测数周或更长时间以测量到达肿瘤倍增的时间，对数细胞杀伤，和肿瘤抑制。
1)实验动物
BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，♀，购自上海灵畅生物科技有限公司。生产许可证号：SCXK(沪)2013-0018；动物合格证号2013001815683。饲养环境：SPF级。
2)实验步骤
裸小鼠皮下接种人胃癌NCI-N87细胞，待肿瘤生长至100-250mm3后，将动物随机分组(D0)。给药剂量和给药方案见表1。每周测2-3次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：
V＝1/2×a×b2其中a、b分别表示长、宽。
T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)x100其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。
3)实验结果
图11显示了ADC2(0.5、1、2mg/kg，IV，每周1次，共2次)剂量依赖性地显著抑制人胃癌NCI-N87裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为59％、94％和200％，1mg/kg组有3/6肿瘤部分消退，2mg/kg组有6/6肿瘤完全消退；ADC3(0.5、1、2mg/kg，IV，每周1次，共2次)对NCI-N87的抑瘤率分别为65％、69％和185％，2mg/kg组有1/6肿瘤部分消退和5/6肿瘤完全消退；P-vcMMAE(1mg/kg，IV，每周1次，共2次)对NCI-N87的抑瘤率为94％，有2/6肿瘤部分消退；参比药物Kadcyla(2mg/kg，IV，每周1次，共2次)对NCI-N87的抑瘤率分别为77％。荷瘤小鼠对以上药物均能很好耐受，没有体重减轻等症状发生。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (20)

1.一种取代马来酰胺类连接子片断，结构为式Ia所示：
其中，R为X或ArS-，
X选自下组：卤素；
Ar选自下组：取代或未取代的C6-C10芳基，取代或未取代的5-12元杂芳基；
Ar’选自下组：取代或未取代的C6-C10亚芳基，取代或未取代的5-12元亚杂芳基；
L1为连接于Ar’基团上的-O(CH2CH2O)n-，其中n选自1-20中任一整数。
2.如权利要求1所述的取代马来酰胺类连接子片断，其特征在于，Ar选自下组：苯基、4-甲基苯基、4-甲氧基苯基、2-吡啶基、2-嘧啶基、1-甲基咪唑-2-基、其中W为与羰基连接的胺基R1，R1选自-NH2、
3.如权利要求1所述的取代马来酰胺类连接子片断，其特征在于，所述连接子片段具有选自下组的结构：
4.一种含有如权利要求1所述的取代马来酰胺类连接子-药物缀合物，及其药学上可接受的盐或溶剂物，结构如通式Ib所示：
其中，R、Ar’、L1如权利要求1的定义；
L2为化学键，或AA-PAB结构；其中，AA为二肽或三肽片断，PAB为对-氨基苄基氨甲酰基；
CTD为通过酰胺键键合于L2的细胞毒性类小分子药物和/或治疗自身免疫疾病和抗炎症的药物。
5.如权利要求4所述的取代马来酰胺类连接子-药物缀合物，及其药学上可接受的盐或溶剂物，其特征在于，所述的AA选自下组：Val-Cit、Val-Ala、Phe-Lys。
6.如权利要求4所述的取代马来酰胺类连接子-药物缀合物，及其药学上可接受的盐或溶剂物，其特征在于，所述的CTD选自下组：微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA结合剂。
7.如权利要求6所述的取代马来酰胺类连接子-药物缀合物，及其药学上可接受的盐或溶剂物，其特征在于，所述的微管蛋白抑制剂选自下组：美登素衍生物、Monomethylauristatin E、Monomethylauristatin F、Monomethyl Dolastatin 10、Tubulysin类衍生物、Cryptophycin类衍生物、Taltobulin。
8.如权利要求6所述的取代马来酰胺类连接子-药物缀合物，及其药学上可接受的盐或溶剂物，其特征在于，所述的DNA结合剂选自下组：PBD类衍生物、duocarmycin类衍生物。
9.如权利要求6所述的取代马来酰胺类连接子-药物缀合物，及其药学上可接受的盐或溶剂物，其特征在于，所述的拓扑异构酶抑制剂选自下组：阿霉素代谢产物PNU-159682衍生物、伊立替康代谢产物SN38衍生物。
10.如权利要求6所述的取代马来酰胺类连接子-药物缀合物，及其药学上可接受的盐或溶剂物，其特征在于，所述的CTD具有选自D1-D12的分子结构：
11.如权利要求4所述的取代马来酰胺类连接子药物缀合物，及其药学上可接受的盐或溶剂物，其特征在于，所述的式Ib化合物选自下组：
12.一种抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的偶联物是用如权利要求4所述的式Ib取代马来酰胺类连接子药物缀合物，及其药学上可接受的盐或溶剂物与抗体进行偶联形成的。
13.一种抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的偶联物具有通式Ic和/或Id的结构：
其中，Ar’、L1、L2、CTD如权利要求4所定义；
m＝1.0～5.0；
Ab选自下组：蛋白质、酶、抗体、抗体片段、多肽。
14.如权利要求12或13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的抗体或Ab选自下组：单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段。
15.如权利要求12或13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述抗体是能够与选自下组的肿瘤相关抗原结合的抗体：HER2、HER3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79b、CD138、CD147、CD223、EpCAM、Mucin1、STEAP1、GPNMB、FGF2、FOLR1、EGFR、EGFRvIII、Tissue factor、c-MET、Nectin4、AGS-16、Guanylyl cyclase C、Mesothelin、SLC44A4、PSMA、EphA2、AGS-5、GPC-3、c-KIT、RoR1、PD-L1、CD27L、5T4、Mucin16、NaPi2b、STEAP、SLITRK6、ETBR、BCMA、Trop-2、CEACAM5、SC-16、SLC39A6、Delta-likeprotein3、Claudin 18.2。
16.如权利要求12或13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的抗体选自下组肿瘤相关抗原结合的抗体：HER2抗体、EGFR抗体、EGFR-vIII抗体、Tissue factor抗体、c-Met抗体、DLL3抗体。
17.如权利要求16所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的HER2抗体选自下组：曲妥珠单抗、帕妥珠单抗。
18.一种药物组合物，其特征在于，包括：(a)如权利要求12-17中任一项所述的抗体-药物偶联物；和(b)药学上可接受的稀释剂，载剂或赋形剂。
19.如权利要求12-17中任一项所述的抗体-药物偶联物的用途，其特征在于，用于制备***的药物的用途。
20.如权利要求12-17中任一项所述的抗体-药物偶联物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)用抗体与还原试剂在缓冲液中反应，得到经还原后的抗体；
(2)用连接子-药物缀合物与步骤(1)得到的经还原后的抗体在缓冲液与有机溶剂混合液中进行交联，得到抗体-药物偶联物。
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