CN108096637B - 一种梯度仿生人工玻璃体的制备方法 - Google Patents
一种梯度仿生人工玻璃体的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明开发了一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,以一种生物大分子网络包裹透明质酸钠纳米微球,并使透明质酸钠浓度呈梯度分布,来模拟人玻璃体的结构和组成变化。其中,透明质酸钠纳米微球为轻度交联,且可与生物大分子形成可逆交联网络,具有一定的自愈合能力,且能有效延长其在体内的维持时间。同时,混合交联凝胶的组分都为生物大分子,拥有良好的生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域,用两种不同的体系混合,制备得到一款含有纳米微球并且浓度呈梯度变化的软凝胶,可用作于人玻璃体替代物,治疗视网膜裂隙、视网膜脱落等症状。
背景技术
玻璃体作为一个凝胶结构填充在晶状体和视网膜之间,是眼部体积最大的组织,在眼的生长以及结构形成中扮演着重要的作用。玻璃体中比重超过95%的比重是水,并且其中15~20%是与粘多糖以结合水的形式存在,具有保证玻璃体稳定结构的作用。玻璃体中的蛋白含量虽然非常小,但其种类多样且复杂。玻璃体中另一种重要物质是粘多糖,其主要的几种组成为透明质酸(HA)、硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。
HA能通过道南(Donnan)效应帮助维持眼内张力。眼球在人清醒的状态下会一直保持着恒定运动。因此,玻璃体需要承受大量的低频机械应力、摩擦和振动。正是由于玻璃体中高含量的HA,才能使其具有粘弹性,就如一个减震器。另外,玻璃体是高度透明的眼部介质,能透过大于90%的可见光与近红外线,其效果类似于水。其次,玻璃体是生物化学物质(大部分大分子)以及细胞的屏障。在一般条件下,玻璃体作为血眼屏障的重要组成,也对增殖、炎症以及新血管形成起到抑制作用。自20世纪60年代后期以来,人们已经认识到,玻璃体可以作为邻近组织的代谢储存。玻璃体能减少晶状体暴露于氧气的程度,因此玻璃体的凝胶状态可以保护晶状体免受氧化损伤,并通过抗坏血酸依赖性机制消耗氧来预防或减少白内障的形成。
HA能与胶原蛋白在玻璃体中形成三维凝胶结构。长胶原纤维在HA分子中分布,是决定玻璃体粘度的重要因素之一。HA与胶原同时决定了玻璃体的粘弹性。虽然玻璃体在宏观上看似均一,但其在微观上各个成分、密度、粘度是有梯度变化的,其中包括HA的浓度的梯度变化。HA浓度从晶状体附近的前房到玻璃体后部近视网膜部逐渐增加,帮助胶原网络一起避免网状结构的崩解。
人的玻璃体在初生时是完全凝胶状态的,但随着年龄的增长,其从中心区域发生液化,并且液化的体积也随年龄增长而增大,从初生时的0mL到80岁时增长约2mL。
玻璃体液化会造成玻璃体脱离,而在玻璃体脱离过程中会对视网膜产生牵引。因此,玻璃体液化是引起视网膜撕裂以及随后的视网膜脱落的重要因素。若是这种牵引发生在黄斑区的话,更会造成玻璃体黄斑牵引。而另外还有诸多因素会造成视网膜脱落,包括高度近视、对眼部外力撞击、糖尿病等。为治疗视网膜脱落,一般会进行玻璃体切除术,再用人工的玻璃体替代物进行填充,顶压视网膜复位。
对于理想的玻璃体替代物来说,应该能在组成与功能上都能模仿天然玻璃体,并且易于手术中操作。玻璃体替代物从功能上来说,需要有理想的粘弹性来维持眼压在生理范围,并支撑眼内组织(包括视网膜)。同时,它还需要允许离子、电解质等物质的传输,保持氧气、乳酸、抗坏血酸的浓度。而从玻璃体替代物的性质上来说,其需要透明、无毒、长期生物相容性好、永久性植入,且注射植入后不能破裂成小颗粒或者被人体代谢。最终,玻璃体替代物要有合理的成本。因此,由于理想的玻璃体替代物要同时满足以上如此多的要求,其研发过程是充满挑战的。
现在通过国家药监局审批的玻璃体替代物产品可分为气体(全氟丙烷)、液体(眼科手术用重水、眼科手术用硅油)两类,仅仅满足理想玻璃体替代物的生物力学方面的要求,能填塞视网膜。但这些替代物普遍维持时间不长或者存在毒性及副作用,不能真正替代玻璃体。
HA作为玻璃体的主要成分,早在20世纪70年代就被认为是玻璃体替代物的理想选择;胶原被用来治疗视网膜脱落;天然甲壳素产品如壳聚糖也被作为一种天然聚合物替代物。这些大分子生物相容性好,6年的临床实验表明不会引起白内障、眼内炎症等疾病,但是降解太快影响应用。而用催化剂交联这些大分子后能在眼内维持较长的时间。本发明以交联后的生物大分子为主要成分,以一种大分子为网络,交联HA为填充并做一定的浓度梯度变化,达到模拟天然玻璃体结构网络的目的。这种以玻璃体原有成分为原料并模拟其结构得到的混合交联凝胶能作为一种新型玻璃体替代物拥有良好的功能性和生物相容性。
发明内容
本发明的目的是制备一款模拟人玻璃体组成与结构网络的混合凝胶,可作为玻璃体替代物顶压视网膜,治疗视网膜裂孔、视网膜脱落等疾病。混合凝胶主要由两种生物大分子凝胶混合而成,特别是HA/胶原的组合是人玻璃体中含量最多的两种物质。因此,这样的材料本身就具有良好的生物相容性。另外,生物大分子使用交联剂进行轻度交联,能有效延长其在体内的降解时间,解决普通生物大分子在眼内容易降解的问题。
本发明的另一个目的是该材料模拟人玻璃体网络包裹内含物的结构,以HA微球为内含物,另一种生物大分子(胶原、多糖、多肽)为网络骨架,形成的混合交联凝胶。同时,HA的含量因重力作用,在网络构架中呈梯度分布,并通过巯基、二硫键之间的交换反应,将浓度梯度固定。最终形成模拟人玻璃体中HA呈浓度梯度分布的凝胶网络结构。
本发明中,HA先采用乳液聚合的方式自交联成微球,使用的交联剂为BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚),为上市的HA交联凝胶产品中广泛应用的交联剂,其交联得到的凝胶性质稳定、安全。再在HA微球表面酰胺化反应,接枝上胱胺,得到表面接枝胱胺的HA微球。另一种生物大分子(胶原、多糖、多肽)通过不同的步骤(可能含有羧基化反应)与半胱氨酸进行酰胺化反应,得到巯基修饰的生物大分子。两种酰胺化反应使用的偶联剂都为DMTMM(4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐),其反应条件温和,对pH不敏感,并且为水相反应剂,适用于生物大分子类的亲水性物质。将这两种修饰后的产物进行混合后,一方面HA微球由于重力作用会在另一种生物大分子中下沉,形成浓度梯度;另一方面HA微球上的二硫键与另一种生物大分子上的巯基会发生交换反应,从而将微球在结构网络中固定。这种交换反应是缓慢进行的,为HA的浓度梯度调整提供了条件。并且,这种巯基/二硫键的可逆反应能使凝胶在破坏后发生自愈合,恢复原有形态。
本发明的制备流程如下:
(1)将HA配置为低浓度的水相溶液,并加入BDDE溶解;
(2)向(1)中加入有机溶剂及乳化剂,进行乳化交联反应;
(3)将(2)得到的微球与胱胺溶液混合,并加入DMTMM,进行酰胺化反应;
(4)另一种生物大分子若含有氨基,先与羧基化试剂在DMTMM下进行羧基化反应;
(5)从(4)中得到的产物于水相进行透析;或者用乙醇对从(4)中得到的产物进行沉降,沉降得到的粉末干燥后再用PBS(磷酸缓冲液)进行复溶;
(6)将半胱氨酸溶于(5)得到的体系,并加入DMTMM,进行酰胺化反应;
(7)从(6)中得到的产物于水相进行透析;或者用乙醇对从(6)中得到的产物进行沉降,沉降得到的粉末干燥后再用水相进行复溶;
(8)将从(3)中得到的表面接枝胱胺的微球与(7)得到的巯基生物大分子溶液进行混合,静置。
上述方法中,选用HA的分子量为100~2000kDa。
上述方法中,水相指水或PBS。
上述方法中,HA在水相中的浓度在0.3~1.5%wt之间。
上述方法中,HA与加入的BDDE质量比在1:0.3~1:1.5之间。
上述方法中,有机相指正已烷或正庚烷或正辛烷或环烷烃。
上述方法中,HA/BDDE体系与有机相的体积比在1:50~1:120之间。
上述方法中,乳化剂指SDS(十二烷基硫酸钠)或AOT(2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠)或CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)或TritonX(聚乙二醇辛基苯基醚)等。
上述方法中,总反应体系与乳化剂的质量比在1:0.01%~1:0.08%之间。
上述方法中,加入BDDE后的反应时间在3~8小时之间。
上述方法中,加入BDDE后的搅拌转速在500~1500rpm之间。
上述方法中,加入BDDE后的反应温度在20~60℃之间。
上述方法中,HA微球的交联程度在1:20~1:200(以1摩尔双糖单元所接BDDE的摩尔数计)。
上述方法中,HA与加入的胱胺质量比在1:6~1:13之间。
上述方法中,HA与加入的DMTMM的质量比在1:1~1:3之间。
上述方法中,HA与DMTMM的反应时间在4~12小时之间。
上述方法中,表面接枝胱胺的HA微球的胱胺含量在5~18%wt之间。
上述方法中,选用的另一种生物大分子指胶原(明胶)或多糖(HA、几丁糖)或多肽(多聚赖氨酸、聚谷氨酸)。分子量为:HA的分子量为100~2000kDa,几丁糖的分子量为100~500kDa,明胶的强度为≥240bloom g,聚谷氨酸50~2000kDa,多聚赖氨酸2~5kDa。。
上述方法中,羧基化试剂指二元酸或者多元酸,包含柠檬酸、草酸、琥珀酸、己二酸等。生物大分子的氨基与羧基化试剂的羧基的摩尔比在1:2~1:8之间。
上述方法中,羧基化反应的生物大分子与DMTMM的质量比在1:0.5~1:3之间。
上述方法中,生物大分子与羧基化试剂在DMTMM下的反应时间在12~72小时之间。
上述方法中,需沉降体系与乙醇之间的体积比为1:3~1:5。
上述方法中,醇沉后粉末的干燥时间为12~72小时。
上述方法中,需透析体系与透析液之间的体积比为1:10~1:30。
上述方法中,需透析体系的透析时间为3~6天。
上述方法中,羧基化生物大分子的羧基与半胱氨酸的摩尔比在1:1~1:4之间。
上述方法中,羧基化生物大分子与半胱氨酸在DMTMM下的反应时间在12~48小时之间。
上述方法中,巯基化生物大分子的巯基含量在1.5~5.0%wt之间。
上述方法中,表面接枝胱胺的微球与巯基生物大分子溶液进行混合后静置的时间在2~10小时之间。
上述方法中,混合时表面接枝胱胺的微球的HA含量小于等于巯基生物大分子的含量。
本发明的混合凝胶中,HA的浓度为2~10mg/mL,巯基生物大分子的浓度为5~15mg/mL。HA浓度在混合凝胶中呈梯度变化。
本发明的优点在于:
1.本发明选用两种生物大分子组成的混合交联凝胶,能使组分接近人玻璃体,生物相容性好。
2.本发明制备的混合凝胶中HA本身有轻度交联,又在混合后与另一种生物大分子进行了巯基与二硫键的交换,能有效解决生物大分子在体内降解速率过快的问题。
3.本发明制备的混合交联凝胶以一种生物大分子网络包裹HA微球,模拟了人玻璃体网络包裹内含物的结构;并且让HA形成浓度梯度,模拟了人玻璃体中HA浓度呈梯度变化的特征。
4.本发明制备的混合交联凝胶以巯基与二硫键形成交联网络,通过巯基/二硫键的可逆反应,使凝胶具有自愈合的特征,在外力破坏后能回复原有形态。
5.本发明制备的混合交联凝胶相比于现有临床应用的人工玻璃体,具有维持时间长、无需二次手术取出、生物相容性优异等特点。
具体实施方式
下面通过实施例进一步描述本发明,但不限于这些实施例。
实施例1
制备在磷酸缓冲液中的表面接枝胱胺的HA纳米微球
在4℃条件下,将0.01g HA(Mw=1×106)溶于含BDDE(1%wt)的1mL PBS(pH=7.2)中。待溶解完全后,加入含80mL正已烷(含有0.05%wtSDS)的250mL三口烧瓶中。加入速度为0.03mL/min,同时体系以1000rpm的速度进行机械搅拌,反应在30℃下维持4个小时,然后在60℃下维持1个小时。然后对反应体系进行抽滤(0.45μm滤膜),收集得到的HA纳米微球用100mLPBS洗涤3次,每次30分钟。微球保存在PBS中。
称取0.1g HA纳米微球加入含胱胺(10%wt)的10mL PBS溶液中,然后在机械搅拌(300rpm)的情况下加入0.25g DMTMM,反应6个小时后,抽滤,并用50mL PBS清洗3次,每次30分钟,得到表面接有胱胺的HA纳米微球(HA-SS)。微球按1%wt的浓度保存在PBS中。
实施例2
制备在磷酸缓冲液中的带有巯基的明胶体系(醇沉法)
在40℃条件下配置1%wt的100mL明胶/PBS溶液,再加入2.65g柠檬酸,在溶解均匀后加入1.00g DMTMM,机械搅拌200rpm 24小时,再用乙醇沉降,并洗涤三次。醇沉粉末在真空干燥箱中干燥至恒重,最终得到接有柠檬酸的明胶粉末。
上述粉末在40℃条件下配置成1%wt的50mLPBS溶液,加入0.84g(2倍摩尔数)的半胱氨酸,溶解均匀后再加入0.19%wt的DMTMM。搅拌溶解后静置24h。再用乙醇沉降,并洗涤三次。得到的醇沉粉末在真空干燥箱中干燥至恒重,于N2环境下保存。使用时再用PBS溶液进行复溶,得到带有巯基的明胶体系。
实施例3
制备在磷酸缓冲液中的带有巯基的明胶体系(透析法)
在40℃条件下配置1%wt的100mL明胶/PBS溶液,再加入3.20g草酸,在溶解均匀后加入1.00g DMTMM,机械搅拌200rpm 24小时。反应后的体系装入透析袋(截留分子量10,000Da)对PBS进行透析,每天换液,透析4天。最终得到接有柠檬酸的明胶。
取50mL接有柠檬酸的明胶溶液,加入0.84g(2倍摩尔数)的半胱氨酸,溶解均匀后再加入0.19%wt的DMTMM。搅拌溶解后静置16h。反应后的体系装入透析袋(截留分子量10,000Da)于N2环境中用PBS进行透析,每天换液,透析4天。最终得到带有巯基的明胶体系。
实施例4
制备在磷酸缓冲液中的带有巯基的HA体系(醇沉法)
配置1%wt的100mL HA/PBS溶液,再加入0.29g的半胱氨酸,溶解均匀后再加入0.19%wt的DMTMM。搅拌溶解后低温静置24h。反应结束后加入100mL PBS溶液,稀释搅拌均匀,再用乙醇沉降,并洗涤三次。得到的醇沉粉末在真空干燥箱中干燥至恒重,于N2环境下保存。使用时再用PBS溶液进行复溶,即得带有巯基的HA体系。
实施例5
制备在磷酸缓冲液中的带有巯基的HA体系(透析法)
配置1%wt的100mL HA/PBS溶液,再加入0.29g的半胱氨酸,溶解均匀后再加入0.19%wt的DMTMM。搅拌溶解后低温静置16h。反应后的体系装入透析袋(截留分子量10,000Da)于N2环境中用PBS进行透析,每天换液,透析4天。最终得到带有巯基的明胶体系。
实施例6
制备在磷酸缓冲液中的带有巯基的聚赖氨酸体系(透析法)
配置1%wt的100mL聚赖氨酸/PBS溶液,再加入6.00g已二酸,在溶解均匀后加入3.00g DMTMM,机械搅拌200rpm 24小时。反应后的体系装入透析袋(截留分子量10,000Da)对PBS进行透析,每天换液,透析4天。最终得到接有柠檬酸的聚赖氨酸。
取50mL接有柠檬酸的聚赖氨酸,加入0.47g的半胱氨酸,溶解均匀后再加入0.19%wt的DMTMM。搅拌溶解后静置16h。反应后的体系装入透析袋(截留分子量10,000Da)于N2环境中用PBS进行透析,每天换液,透析4天。最终得到带有巯基的聚赖氨酸体系。
实施例7
制备在磷酸缓冲液中的带有巯基的聚赖氨酸体系(醇沉法)
配置1%wt的100mL聚赖氨酸/PBS溶液,再加入3.00g柠檬酸,在溶解均匀后加入3.00g DMTMM,机械搅拌200rpm 24小时,再用乙醇沉降,并洗涤三次。醇沉粉末在真空干燥箱中干燥至恒重,最终得到接有柠檬酸的聚赖氨酸粉末。
粉末配置成1%wt的50mL/PBS溶液,加入0.47g(2倍摩尔数)的半胱氨酸,溶解均匀后再加入0.19%wt的DMTMM。搅拌溶解后静置24h。再用乙醇沉降,并洗涤三次。得到的醇沉粉末在真空干燥箱中干燥至恒重,于N2环境下保存。使用时再用PBS溶液进行复溶,最终得到带有巯基的聚赖氨酸体系。
实施例8
制备在磷酸缓冲液中的带有巯基的几丁糖体系(透析法)
配置1%wt的100mL几丁糖/PBS溶液,再加入2.39g琥珀酸,在溶解均匀后加入1.00g DMTMM,机械搅拌200rpm 24小时。反应后的体系装入透析袋(截留分子量10,000Da)对PBS进行透析,每天换液,透析4天。最终得到接有柠檬酸的几丁糖。
取50mL接有柠檬酸的几丁糖,加入0.38g的半胱氨酸,溶解均匀后再加入0.19%wt的DMTMM。搅拌溶解后静置16h。反应后的体系装入透析袋(截留分子量10,000Da)于N2环境中用PBS进行透析,每天换液,透析4天。最终得到带有巯基的几丁糖体系。
实施例9
制备在磷酸缓冲液中的带有巯基的几丁糖体系(醇沉法)
配置1%wt的100mL几丁糖/PBS溶液,再加入2.39g柠檬酸,在溶解均匀后加入1.00g DMTMM,机械搅拌200rpm 24小时,再用乙醇沉降,并洗涤三次。醇沉粉末在真空干燥箱中干燥至恒重,最终得到接有柠檬酸的几丁糖粉末。
粉末配置成1%wt的50mL/PBS溶液,加入0.38g的半胱氨酸,溶解均匀后再加入0.19%wt的DMTMM。搅拌溶解后静置24h。再用乙醇沉降,并洗涤三次。得到的醇沉粉末在真空干燥箱中干燥至恒重,于N2环境下保存。使用时再用PBS溶液进行复溶,最终得到带有巯基的几丁糖体系。
实施例10
制备在磷酸缓冲液中HA纳米微球浓度呈梯度变化的明胶交联网络混合体系
取1%wt的巯基明胶20mL,加入1%wt的胱胺接枝HA纳米微球20mL,机械搅拌200rpm 15min,即得明胶交联网络/HA纳米微球混合体系。
体系装入50mL烧杯中,静置2小时,即可得到HA纳米微球浓度梯度变化的明胶交联网络混合体系。
实施例11
制备在磷酸缓冲液中HA纳米微球浓度呈梯度变化的HA交联网络混合体系
取1%wt的巯基HA20mL,加入1%wt的胱胺接枝HA纳米微球10mL,机械搅拌200rpm30min,即得HA交联网络/HA纳米微球混合体系。
体系装入50mL烧杯中,静置4小时,得到HA纳米微球浓度梯度变化的HA交联网络混合体系。
实施例12
制备在磷酸缓冲液中HA纳米微球浓度呈梯度变化的聚赖氨酸交联网络混合体系
取1%wt的巯基聚赖氨酸20mL,加入1%wt的胱胺接枝HA纳米微球18mL,机械搅拌200rpm 30min,即得聚赖氨酸交联网络/HA纳米微球混合体系。
体系装入50mL烧杯中,静置6小时,得到HA纳米微球浓度梯度变化的聚赖氨酸交联网络混合体系。
实施例13
制备在磷酸缓冲液中HA纳米微球浓度呈梯度变化的几丁糖交联网络混合体系
取1%wt的巯基几丁糖20mL,加入1%wt的胱胺接枝HA纳米微球16mL,机械搅拌200rpm 30min,即得几丁糖交联网络/HA纳米微球混合体系。
体系装入50mL烧杯中,静置4小时,得到HA纳米微球浓度梯度变化的几丁糖交联网络混合体系。
实施例14
检测带有巯基的几丁糖体系的巯基含量
检测巯基凝胶采用DTNB(5,5-二硫二硝基苯甲酸)显色法。巯基凝胶过粘不适合检测时,可以将凝胶稀释再进行检测。标准巯基样品选用半胱氨酸,配制成不同浓度的标准溶液。分别取各浓度的标准溶液与巯基化几丁糖(稀释液)各1mL,加入5mL预先25℃预热的DTNB溶液(用1体积10mM的DTNB标准液加99体积0.25M的Tris缓冲液配置),摇匀后于412nm处测定吸光度。计算可得到凝胶体系中的巯基浓度,再换算得到巯基含量。巯基化几丁糖凝胶的巯基含量测试结果见表1所示。
表1
M<sub>几丁糖</sub>:M<sub>半胱氨酸</sub> | 巯基含量/% |
1:1 | 2.54 |
1:2 | 3.07 |
1:3 | 3.33 |
M几丁糖:M半胱氨酸是指投料时几丁糖与半胱氨酸的摩尔比。
从所示结果来看,所合成的巯基化几丁糖中,巯基含量随半胱氨酸在投料时的比例的增大而增大。
实施例15
用元素分析法检测表面接枝胱胺的HA纳米微球的胱胺含量
取1%wt表面接枝胱胺的HA纳米微球1g,用大量乙醇沉降进行脱水,并洗涤3次,得到的粉末在105℃干燥至恒重,再用研钵研磨15min,过100目筛。取筛后的粉末用元素分析仪做元素分析,得到S的占比,可通过计算得到胱胺的含量。计算公式如下:
表面接枝胱胺的HA纳米微球的胱胺含量结果见表2所示,可以看到随反应时间的延长,胱胺含量越高,表明接枝率越高。
表2
反应时间/小时 | 胱胺含量/% |
4 | 6.44 |
6 | 11.72 |
8 | 14.20 |
实施例16
用HA酶检测混合凝胶中HA的降解率
取混合凝胶0.32g于试管中,加入8mL 30U HA酶溶液,置于37℃恒温水浴振荡箱中,100rpm。分别于4、24、48小时取样200μL。将样液过0.45μm孔径的微孔滤膜,并稀释5倍备用。
取混合凝胶0.05g于试管中,加10mL 1M稀硫酸,100℃水解10min,再用1M氢氧化钠溶液中和备用。
取3个时间点的酶降处理样液1mL、混合液1mL、不同浓度的糖醛酸标准液各1mL,分别加入浓硫酸5mL,100℃反应10min,加入200μL乙醇咔唑溶液,100℃反应10min。用紫外光-可见光分光光度计检测530nm处吸光度,对比糖醛酸标准曲线,得到降解后的HA含量与混合凝胶的原有HA含量。酶降率的计算公式如下:
酶降率=(降解后的HA含量)/(原有HA含量)*100%
表3
混合凝胶的酶降结果与普通交联HA线性凝胶的酶降结果对比见表3所示。从表中数据可知含有巯基/二硫键交联网络的混合凝胶在4小时、24小时、48小时的HA酶降率要明显小于DVS(二甲基亚砜)交联的普通交联HA凝胶与BDDE交联的普通交联HA凝胶。并且在48小时后依旧保持60%以上未降解。抗降解性能优越。
Claims (27)
1.一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,以一种生物大分子为网络、透明质酸钠纳米微球为内含物、通过透明质酸钠纳米微球上的二硫键与生物大分子上的巯基发生交换反应形成可逆凝胶网络,具有一定自愈合能力,并且透明质酸钠浓度呈梯度变化,模拟人玻璃体的构成与组分。
2.根据权利要求1所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,其中透明质酸钠的特征是:分子量为100~2000kDa。
3.根据权利要求1所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的透明质酸钠纳米微球为表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球,其制备过程为:将透明质酸钠与交联剂的水相在乳化剂作用下搅拌分散于有机相中,交联得到透明质酸钠纳米微球,再用催化剂将纳米微球与胱胺进行酰胺化反应,得到表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球。
4.根据权利要求3所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球的特征是:直径为500~900nm。
5.根据权利要求3所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的透明质酸钠纳米微球的制备过程中的交联剂包含BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)。
6.根据权利要求3所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球的制备过程中的乳化剂包含SDS(十二烷基硫酸钠)、AOT(2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、TritonX(聚乙二醇辛基苯基醚)。
7.根据权利要求3所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球的制备过程中的有机相包含正已烷、正庚烷、正辛烷、环烷烃。
8.根据权利要求3所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球的制备过程中的水相溶液包含水、磷酸缓盐冲液(PBS)。
9.根据权利要求3所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球的制备过程中的催化剂包含DMTMM(4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐)。
10.根据权利要求3所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球的制备过程中:
(1)透明质酸钠在水相中的浓度在0.3~1.5%wt之间,
(2)透明质酸钠与加入的交联剂质量比在1:0.3~1:1.5之间,
(3)水相与有机相的体积比在1:50~1:120之间,
(4)总反应体系与乳化剂的质量比在1:0.0001~1:0.0008之间,
(5)加入交联剂后的反应时间在3~8小时之间,
(6)加入交联剂后的搅拌转速在500~1500rpm之间,
(7)加入交联剂后的反应温度在20~60℃之间,
(8)透明质酸钠与加入的胱胺质量比在1:6~1:13之间,
(9)透明质酸钠与加入的催化剂的质量比在1:1~1:3之间,
(10)透明质酸钠与催化剂的反应时间在4~12小时之间。
11.根据权利要求3所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球的特征是:交联程度以1摩尔双糖单元所接交联剂的摩尔数计在1:20~1:200之间。
12.根据权利要求3所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球的特征是:胱胺含量在5~18%wt之间。
13.根据权利要求1所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,其中一种生物大分子的特征是:生物相容性好,包含透明质酸钠、几丁糖、明胶、多聚赖氨酸、聚谷氨酸。
14.根据权利要求13所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的生物大分子中,透明质酸钠的分子量为100~2000kDa,几丁糖的分子量为100~500kDa,明胶的强度为≥240bloom g,聚谷氨酸50~2000kDa,多聚赖氨酸2~5kDa。
15.根据权利要求1所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,其中生物大分子网络为巯基化生物大分子,其制备过程为:若生物大分子本身带有氨基,则先与羧基化试剂在催化剂催化下反应,得到羧基化生物大分子,再与半胱氨酸在催化剂催化下反应,得到巯基化生物大分子;
若生物大分子本身不带有氨基且带有羧基,则直接与半胱氨酸在催化剂催化下反应,得到巯基化生物大分子。
16.根据权利要求15所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的巯基化生物大分子的制备过程中的催化剂包含DMTMM(4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐)。
17.根据权利要求15所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的巯基化生物大分子的制备过程中的羧基化试剂指二元酸或者多元酸,包含柠檬酸、草酸、琥珀酸、己二酸。
18.根据权利要求15所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的巯基化生物大分子的制备过程中:
(1)生物大分子的起始反应浓度在0.3~1.5%wt之间,
(2)生物大分子的氨基与羧基化试剂的羧基的摩尔比在1:2~1:8之间,
(3)生物大分子与催化剂的质量比在1:0.5~1:3之间,
(4)生物大分子与催化剂的在催化剂下的反应时间在12~72小时之间,
(5)羧基化生物大分子的起始反应浓度在0.3~1.5%wt之间,
(6)羧基化生物大分子的羧基与半胱氨酸的摩尔比在1:1~1:4之间,
(7)羧基化生物大分子与催化剂的质量比在1:0.5~1:3之间,
(8)羧基化生物大分子与半胱氨酸在催化剂下的反应时间在12~48小时之间。
19.根据权利要求15所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的巯基化生物大分子的特征是:巯基含量在1.5~5.0%wt之间。
20.根据权利要求15所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的巯基化生物大分子的制备过程中,羧基化生物大分子或巯基化生物大分子的制备包含后处理过程,为:对水相进行透析;或者用乙醇对其进行沉降,沉降得到的粉末干燥后再用水相进行复溶。
21.根据权利要求20所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,其中巯基化生物大分子的制备过程中的羧基化生物大分子或巯基化生物大分子的后处理过程,所述的水相包含水、PBS。
22.根据权利要求20所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的巯基化生物大分子的制备过程中的羧基化生物大分子或巯基化生物大分子的后处理过程中:
(1)需沉降体系与乙醇之间的体积比为1:3~1:5,
(2)醇沉后粉末的干燥时间为12~72小时,
(3)需透析体系与水相之间的体积比为1:10~1:30,
(4)需透析体系的透析时间为3~6天。
23.根据权利要求1所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的通过透明质酸钠纳米微球上的二硫键与生物大分子上的巯基发生交换反应形成可逆凝胶网络,其制备过程为:表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球与巯基化生物大分子溶液混合,静置。
24.根据权利要求23所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的可逆凝胶网络的制备过程中:
(1)混合前交联透明质酸钠微球的浓度在0.3~1.5%wt之间,
(2)混合时透明质酸钠含量小于等于巯基生物大分子的含量,
(3)混合后静置的时间在2~10小时之间。
25.根据权利要求23所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球的特征是:透明质酸钠的浓度为1.5~10mg/mL,所述的巯基生物大分子的特征是:浓度为5~15mg/mL。
26.根据权利要求1所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的具有一定自愈合能力的特征为:在外力破外下能回复原有形态及性质。
27.根据权利要求1所述的一种用于玻璃体替代的混合交联凝胶,所述的透明质酸钠浓度呈梯度变化的特征为:表面接枝胱胺的交联透明质酸钠纳米微球与巯基化生物大分子溶液混合后,随着巯基/二硫键的交换反应,透明质酸钠微球缓慢下沉并交联固定,最终形成的透明质酸钠浓度梯度分布模拟人玻璃体中透明质酸钠浓度梯度分布的趋势。
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