CN108085370A - 一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途 - Google Patents

一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108085370A
CN108085370A CN201711026859.XA CN201711026859A CN108085370A CN 108085370 A CN108085370 A CN 108085370A CN 201711026859 A CN201711026859 A CN 201711026859A CN 108085370 A CN108085370 A CN 108085370A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tsdna
lspr
individual particle
agncs
mir
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711026859.XA
Other languages
English (en)
Inventor
汪联辉
张颖
张磊
翁丽星
周浩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Post and Telecommunication University
Nanjing University of Posts and Telecommunications
Original Assignee
Nanjing Post and Telecommunication University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Post and Telecommunication University filed Critical Nanjing Post and Telecommunication University
Priority to CN201711026859.XA priority Critical patent/CN108085370A/zh
Publication of CN108085370A publication Critical patent/CN108085370A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
    • G01N21/554—Attenuated total reflection and using surface plasmons detecting the surface plasmon resonance of nanostructured metals, e.g. localised surface plasmon resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G01N2333/922—Ribonucleases (RNAses); Deoxyribonucleases (DNAses)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途，其包括如下步骤：分别制备金银核壳纳米立方体(Au@AgNCs)溶胶和tsDNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；将所述tsDNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针。所制备的单颗粒探针粒径在50～60nm之间，检测灵敏度达到1aM，LSPR散射光谱峰位于540～560nm。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：1、与银纳米立方体相比，Au@Ag NCs具有相似的等离子体特性且结构更佳稳定；2、与一维结构的单链DNA分子以及二维结构的发夹型DNA分子相比，三维结构的tsDNA具有更好的刚性、结构稳定性以及易于多功能化等优点。

Description

一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种基于tsDNA(四面体结构DNA)的单颗粒LSPR(局域表面等离子体共振)探针的构建方法及其用途，属于生物检测技术领域。
背景技术
MicroRNAs是一类长度在20～24个核苷酸的内源性非蛋白编码的RNAs，通常在早期发育，细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中起着非常重要的作用。MicroRNAs的异常表达发生在癌症前期的恶性肿瘤细胞中，与许多癌症(如：肺、肝细胞、大肠和乳腺癌等)相关。MicroRNA-21(miR-21)存在于上述许多人类的癌症组织中，尤其在肺鳞癌组织中表达水平是正常组织中的2倍之多。因此，microRNAs可以作为生物标志物用于早期癌症的诊断和预后治疗。发展一种高灵敏的分析方法跟踪检测microRNAs用于早期癌症诊断对于生物学和诊断学是至关重要的。
在许多生物***中，单分子水平的研究可以揭示分子间的相互作用、动力学以及构象的细微变化。目前用于单分子水平检测的可行方法通常需要荧光分子作标记，然而荧光探针容易发生光漂白等现象且信噪比较低。近些年来，由于其独特的依赖于尺寸、形貌、组分和微环境的光学性质，等离子体在化学和生物传感领域引起了广泛的研究兴趣。这些传感器基于贵金属纳米颗粒(如：金纳米颗粒和银纳米颗粒)的LSPR特性，通过颗粒的LSPR峰(λmax)的移动作为检测信号。LSPR传感器用于测量金属纳米颗粒表面的分子间相互作用引起了研究者们的关注。许多不同的用于固定生物分子到金属纳米颗粒表面的方法也被广泛的报道。并且，从单个金属纳米颗粒获得的信号可以提供更加详细的信息。因此，我们希望基于单个纳米颗粒水平来检测金属纳米颗粒表面的生物分子间的相互作用。
然而，由于microRNAs含量低，采用基于简单的ssDNA修饰的单个金属纳米颗粒形成的探针分子构建的等离子体纳米生物传感器对miR-21的检测限只能到1fM。
发明内容
技术问题：本发明的目的是针对现有技术中的缺陷，提供一种单颗粒生物探针
的构建方法及其用途，与银纳米立方体相比，Au@Ag NCs具有相似的等离子体特性且结构更佳稳定；与一维结构的单链DNA分子以及二维结构的发夹型DNA分子相比，三维结构的tsDNA具有更好的刚性、结构稳定性以及易于多功能化等优点。
技术方案：本发明的一种单颗粒生物探针的构建方法是基于tsDNA的单颗粒LSPR探针的构建方法，其包括如下步骤：
分别制备Au@AgNCs溶胶和tsDNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；
将所述tsDNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下进行孵育2～6h后，用超纯水进行洗涤，并用氮气吹干，得到所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针。
作为优选方案，所述Au@AgNCs溶胶的制备方法包括如下步骤：
合成纳米金种子；
将所述纳米金种子与十六烷基三甲基氯化铵进行反应，得到金胶溶液；
将所述金胶溶液与抗坏血酸在40～80℃下进行反应后，加入硝酸银，反应后得到Au@AgNCs溶胶。
作为优选方案，所述Au@AgNCs在氧化铟锡导电膜玻璃表面的固定方法为：
将氧化铟锡导电膜玻璃的表面清洗干净后，浸入到Au@AgNCs溶胶中，静置1～5min后取出，用超纯水清洗并用氮气吹干，即可。
作为优选方案，所述tsDNA溶液的制备方法包括如下步骤：
将各条单链DNA(ssDNA)溶解，在紫外分光光度计下测定260nm处的吸收，并参考每条ssDNA的摩尔消光系数，确定其浓度；
将四条ssDNA以等比例混合于TM缓冲液中，加入三(2-羧乙基)膦后，转入聚合酶链式反应仪中，在90～98℃下保温10～15min后，迅速降温至0～5℃，得到tsDNA溶液。
一种如前述构建方法制备的基于tsDNA的单颗粒LSPR探针在miR-21的检测以及核酸内切酶(KpnI和StuI)活性检测中的用途。
作为优选方案，所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针在检测miR-21时的具体操作为：
将miR-21溶液滴加到探针分子表面，在室温下反应2～5h后，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，进行LSPR散射光谱的测量。
作为优选方案，所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针在检测核酸内切酶(KpnI和StuI)时的具体操作为：
将2～5μL的核酸内切酶溶液与酶切缓冲液以及超纯水混合得到100～200μL的反应液。
将所述反应液滴加到探针分子表面，在20～50℃反应10～30min后，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，进行LSPR散射光谱的测量。
本发明的基本原理在于：采用tsDNA作为支架，构建“自下而上”的单颗粒LSPR探针，在纳米尺度内控制探针之间的距离、探针取向。在此，基于tsDNA修饰的单颗粒Au@Ag NC探针设计了等离子体纳米生物传感器用于单分子水平miR-21和核酸内切酶(KpnI和StuI)活性检测。对于靶分子miR-21的检测原理如图1所示，当靶分子miR-21与tsDNA分子发生杂交反应，靶分子miR-21会取代Au@Ag NCs表面的水分子，由于RNA分子的折射率(RI)大于水分子的RI导致Au@Ag NCs表面RI的增大，从而引起Au@Ag NC-tsDNA探针分子LSPR散射峰的红移，以此作为信号实现对靶分子miR-21的检测。图2给出了基于Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物的核酸内切酶活性检测的示意图。从图中可以看出，当加入核酸内切酶KpnI或StuI后，tsDNA17的边会被破坏，此时tsDNA17边上DNA分子的位置就会被周围的水分子取代，导致颗粒表面RI的减小，引起探针分子的LSPR散射λmax发生蓝移，实现对核酸内切酶的检测。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、与AgNCs相比，Au@Ag NCs具有相似的等离子体特性且结构更佳稳定；
2、三维结构的tsDNA与一维结构的ssDNA以及二维结构的发夹型DNA相比，具有很强的刚性，可以在颗粒表面呈直立的状态；空间定位能力强，可以提高物质传质速率；并且，能够精确控制探针间的距离，提高靶分子与捕获探针的结合效率以及易于多功能化等优点。用三维结构的tsDNA代替直连DNA，并通过对tsDNA的设计，在其直立的3条边上分别对应与miR-21互补的DNA序列以及与核酸内切酶(KpnI和StuI)对应的切割位点，可以同时实现对miR-21以及核酸内切酶的检测。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的Au@AgNC-tsDNA17探针分子识别靶分子miR-21的原理示意图；
图2为本发明的基于Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物的核酸内切酶活性检测的示意图
图3为本发明中实施例1制备得到的tsDNA的电泳分析图；
图4为本发明中实施例2制备的Au@AgNCs的TEM图片；
图5为本发明中实施例2制备的单个Au@AgNCs的HAADF-STEM图片以及元素扫描图片；
图6为本发明中实施例2制备的Au@Ag NCs的紫外吸收光谱图；
图7为本发明中实施例3设计的tsDNA17的结构示意图；
图8为本发明中实施例3得到的Au@Ag NCs表面修饰tsDNA17前后的(a)暗场照片和(b)典型的LSPR散射光谱图；
图9为本发明中实施例3得到的Au@Ag NC-tsDNA17的(a)暗场照片和(b)统计的LSPR散射光谱图；
图10为利用本发明中实施例3得到的Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别靶分子miR-21前后的(a)暗场照片和(b)典型的LSPR散射光谱图；
图11为图10中Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别靶分子miR-21前后的原位SEM图；
图12为Au@Ag NC-tsDNA7，Au@Ag NC-tsDNA17和Au@Ag NC-tsDNA26三种探针分子在相同条件下识别1pM靶分子miR-21引起颗粒LSPR峰的红移量；
图13为Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别靶分子miR-21不同时间对应的LSPR散射光谱图，其中曲线1到7分别是反应0，30，60，90，120，150，180min时颗粒的LSPR散射光谱；
图14为Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别不同浓度的靶分子miR-21前后对应的LSPR散射光谱图，其中曲线1到11分别对应miR-21的浓度为0，1，101，102，103，104，105，106，107，108和109aM；
图15为Au@Ag NC-tsDNA17探针分子LSPR散射光谱改变量与靶分子miR-21浓度的线性关系图；
图16为(a)Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别不同浓度的靶分子miR-21(1aM到1nM)在不同的时间的LSPR峰的移动曲线；(b)Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别单个靶分子miR-21的LSPR峰的时间动态曲线；
图17为Au@Ag NC-tsDNA17探针分子的特异性检测能力；
图18为Au@Ag NC-tsDNA17探针分子在复杂体系中的检测能力；
图19为tsDNA17在核酸内切酶KpnI和StuI作用前后的电泳分析图；
图20为Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物在核酸内切酶KpnI和StuI作用前后典型的LSPR散射光谱图及颗粒的DFM图像；
图21为Au@Ag NC-tsDNA17探针分子对核酸内切酶KpnI和StuI的选择性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明中涉及的主要药品如下：
硝酸银(AgNO3，99.9％)，氯金酸(HAuCl4·3H2O，99％)，抗坏血酸(AA，99％)，硼氢化钠(NaBH4，99％)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，98％)，十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)购自Sigma-Aldrich公司。乙二胺四乙酸(EDTA)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，焦炭酸二乙酯(DEPC)购自上海阿拉丁试剂公司，其他试剂均为分析纯购买于国药集团化学试剂有限公司。四面体DNA自组装溶液为TM缓冲液(20mM Tris、50mM MgCl2、pH 8.0)，聚丙烯凝胶电泳缓冲液为1×TBE(89mM Tris、89mM硼酸、2mM EDTA、pH 8.3)。实验中MicroRNA所用溶液都是用DEPC处理的水配制的。
上述药品和试剂如未加其他说明，均未加处理。实验用水为超纯水，由Milli-Q纯水仪(Milliproe有限公司)制备，其电阻率为18MΩ·cm。所用的DNA、MicroRNA和核酸内切酶都由大连宝生物公司合成并纯化，序列如表1所示。
本发明中涉及的主要仪器如下：紫外-可见吸收光谱在岛津(日本)UV-3600分光光度计上进行测试；扫描电镜图片使用S-4800(日本)扫描电子显微镜(SEM)拍摄；透射电镜图片使用JEM 2010(日本)透射电子显微镜(TEM)拍摄；恒温混匀仪是Thermomixer comfort(Eppendorf，Germany)；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(Bio-Rad，USA)；暗场图片和单颗粒散射光谱使用装备了暗场聚光镜(0.8<NA<0.95)的Nikon Ti-U型倒置显微镜(日本)拍摄。激发光光源为100W卤素灯，照片通过Nikon DS-fi真彩数码成像CCD采集，光谱通过装备有PIXIS400BR-excelon的光谱CCD的Acton SP2300i型单色仪采集，其光栅密度为300L/mm，闪耀波长为500nm，均由Princeton Instruments提供。暗场图片和单颗粒散射光谱均通过60倍放大的显微物镜采集(NA＝0.8)，采集时间全部为20秒。
实施例1
本实施例涉及一种tsDNA的制备方法，包括如下步骤：
tsDNA的设计以碱基互补配对，以尽可能少的二级结构和GC含量在50％以上等条件为原则，设计了边长分别为7bp，17bp和26bp三种不同尺寸的tsDNA。tsDNA的合成，制备方法可参考“A DNA nanostructure-based biomolecular probe carrier platform forelectrochemical biosensing，Pei H,Lu N,Wen Y,et al.Advanced Materials,2010,22(42):4754-4758”，具体方法如下：
一、将各条ssDNA溶解，在紫外分光光度计下测定260nm处的吸收，从大连宝生物公司得到每条ssDNA的摩尔消光系数，确定每条ssDNA的实际浓度；
二、将形成tsDNA的四条ssDNA以等比例混合在TM缓冲液中，加入终浓度为1～10mM的三(2-羧乙基)膦，配成终浓度为1～10μM的混合液；
三、将配好的混合液放入聚合酶链式反应仪中90～98℃持续10～15min，然后迅速降温至0～5℃，即可得到tsDNA溶液。
采用聚丙烯凝胶电泳(PAGE)来验证tsDNA的形成。实验方法如下：首先，将形成好的tsDNA和单链、两条链以及三条链形成的对照结构上样到1×TBE缓冲液配制的PAGE里，在60V电压下运行；然后将胶在1％的gel-red水溶液里染色10～30min；最后在G:Box里拍摄，保存。
表1
分别将每一套的tsDNA的组成链(4条)等比例混合、退火，形成tsDNA。用聚丙烯凝胶电泳来验证四面体纳米结构是否形成。图3a、3b和3c分别给出了边长为17bp，7bp和26bp的tsDNA形成的胶图，从图中可以看出，每一种尺寸的tsDNA都能成功的合成，且产率都在85％以上。从同一张胶图中可以看出，tsDNA与其他几种未完全加入四条链的DNA结构相比由于具有三维立体结构，受到更大的阻力，其迁移速率最慢；通过比较不同张的胶图可以看出，tsDNA的尺寸越小，其迁移所在的位置对应于20bp的Marker越靠前面。胶图结果还表明，巯基修饰对DNA四面体结构的形成没有影响，可用于Au@Ag NCs表面的组装。
实施例2
本实施例涉及一种表面固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃基底的制备方法，包括如下步骤：
一、纳米金种子的合成：我们采用一个常见的种子生长法制备直径20～40nm的金种子。为了制备直径1～5nm金纳米颗粒，首先将0.2～0.8mL冰水配制的新鲜的5～15mM硼氢化钠溶液快速搅拌下加入到5～15mL的50～150mM CTAB和0.2～0.5mL的5～10mM氯金酸的混合溶液中，得到棕色溶液在20～30℃水浴中保温2～5h以保证多余的硼氢化钠分解完全后待用。然后，金种子溶液通过以下方法制得，将2～5mL的50～200mM抗坏血酸溶液加入到5～15mL的100～200mM CTAC溶液和5～10mL的0.2～0.5mM的氯金酸混合溶液中得到无色透明溶液，搅拌均匀后加入0.2～0.5mL稀释2～6倍的1～5nm金纳米颗粒溶液，溶液的颜色由无色透明变为亮红色，在20～40℃水浴中保温0.5～2.5h后待用。接着，将2～5mL的50～200mM的抗坏血酸溶液、5～15mL的10～200mM CTAC溶液和5～10mL的0.2～0.5mM氯金酸溶液混合，然后向其中加入1～5mL先前制备的10～15nm金种子溶液，溶液的颜色由无色透明慢慢变为红色，在20～40℃水浴中保温1～3h，用于Au@Ag NCs的生长。所得的溶胶采用日本岛津公司的UV-3600紫外-可见分光光度计进行表征，在520～540nm处会有金溶胶强烈的吸收峰出现。TEM表征后发现其粒径为25～35nm(统计100个粒子)制备的金溶胶即为金种子，存储在棕色瓶中，于冰箱中在0～5℃条件下保存。
二、Au@Ag NCs的合成：合成直径在40～60nm的Au@Ag NCs的方法主要经过以下几个步骤。将2～5mL先前制备的20～40nm的金种子溶液和5～10mL的100～200mM CTAC在20mL反应瓶中配成5～20mL金胶溶液，向其中加入2～5mL的50～200mM抗坏血酸溶液搅拌1～5min后50～70℃保温，接着，将0.5～2.0mL的5～20mM的硝酸银溶液以0.5～2.0mL/15min的速率通过加液泵滴加到恒温50～70℃反应瓶中，溶液的颜色由红色变成橙色后变成黄色。所得的Au@Ag NCs溶液经过4000～7000rpm 5min洗涤2～3次后分散至1～3mL超纯水中，采用日本岛津公司的UV-3600紫外-可见分光光度计进行表征，在450～500nm处会有Au@AgNCs强烈的吸收峰出现。TEM表征后发现其直径约为55nm(统计100个粒子)，制备的溶胶即为Au@Ag NCs，存储在棕色瓶中，于冰箱中在0～5℃条件下保存，通常在一个月内用完。
三、玻璃基底的清洗：实验中使用的氧化铟锡导电膜玻璃在使用前分别用洗洁精溶液、去离子水、丙酮、无水乙醇、超纯水超声清洗，并用氮气吹干。最后，将氧化铟锡导电膜玻璃放置于紫外臭氧清洗器中照射10～30min使氧化铟锡导电膜玻璃表面活化，产生大量的硅氧基以利于进行下一步Au@Ag NCs的固定实验。
四、Au@Ag NCs的固定和分析：我们采用物理吸附的方法将Au@Ag NCs固定到清洗干净的氧化铟锡导电膜玻璃表面，具体修饰方法如下：将清洗干净的氧化铟锡导电膜玻璃浸入到稀释40～60倍的先前制备的直径约为55nm的Au@Ag NCs溶胶中，1～5min后将氧化铟锡导电膜玻璃取出用超纯水冲洗其表面除去多余的Au@Ag NCs溶液，并用氮气吹干，即可制得Au@Ag NCs均匀分布的检测界面。将氧化铟锡导电膜玻璃固定在暗场倒置显微镜平台上，可见光源通过暗场聚光镜汇集在纳米粒子上即可观察单颗粒的散射光谱。
本实施例中制备的Au@Ag NCs溶胶的TEM照片如图4所示，从图中可以看出，合成的Au@Ag NCs形貌、尺寸均一，直径约55nm。进一步地，图5a证实了Au@Ag NCs的核壳结构和元素分布。图5b～5d给出了单个Au@Ag NC元素面扫描图，从图中可以看出，Ag覆盖在Au核的外表面，两者的元素分布不重叠，证实了Au@Ag NCs的壳核结构。其紫外-可见光谱数据如图6所示，吸收峰出现位于478nm，表明在此波长下，Au@Ag NCs表面最易发生等离子共振现象。
实施例3
本实施例涉及一种tsDNA对Au@Ag NCs的修饰方法，包括如下步骤：
取100～200μL的1pM实施例1合成好的tsDNA溶液滴加到实施例2固定好Au@Ag NCs的氧化铟锡导电膜玻璃的表面，在室温下孵育2～6h。然后用超纯水将多余的tsDNA溶液除去，并用氮气吹干，即可制得基于tsDNA的单个Au@Ag NC LSPR探针。
依据四面体边长的大小命名，三种不同7bp，17bp和26bp边长的四面体分别为tsDNA7，tsDNA17和tsDNA26。由于银和硫之间具有很强的共价作用，以17bp边长的tsDNA17为例，如图7所示，在tsDNA17的三个顶点上修饰巯基，其中一条边(l1)空出一段ssDNA分子用于捕获miR-21分子，在另外的两条边(l2和l3)上分别设计核酸内切酶KpnI和StuI的识别位点。
为了验证巯基修饰的tsDNA可以组装在Au@Ag NCs表面，以tsDNA17为例，用暗场光谱显微镜平台来观察其在Au@Ag NCs表面的组装。图8a和8b分别给出了Au@Ag NCs表面修饰tsDNA17前后的暗场照片和典型的LSPR散射光谱图。从图中可以看出，在未加入tsDNA17之前，Au@Ag NCs的LSPR散射峰位置(λmax)于505nm处，颗粒的LSPR散射光呈蓝色；在加入1pM的tsDNA17后，Au@Ag NCs的LSPR散射λmax发生明显的红移，对100个经过tsDNA17修饰后的Au@AgNCs的LSPR散射λmax进行统计，发现颗粒的λmax至556nm左右(如图9a和9b所示)，并且颗粒LSPR散射光变为绿色，表明tsDNA17可以在Au@Ag NCs的表面固定，用于miR-21的检测以及核酸内切酶(KpnI和StuI)活性检测的研究。
实施例4
本实施例涉及一种基于tsDNA的单颗粒LSPR探针对miR-21的检测，包括如下步骤：
将100～200μL不同浓度的miR-21滴加到上述制备的基于tsDNA的单个Au@Ag NCLSPR探针，在室温下反应2～5h。然后用超纯水冲洗，并用氮气吹干，用于LSPR散射光谱的测量。实验中对miRNA检测所用的试剂均用DEPC处理过的Milli-Q水配制，并且实验操作都在超净台里进行。
实验结果由以下三部分组成：
一、检测miR-21的LSPR行为
选取LSPR散射初始峰位于556nm处的Au@Ag NC-tsDNA17探针分子为研究对象，考察了在加入靶分子miR-21前后颗粒的LSPR散射光颜色和散射λmax的变化。图10给出了典型的Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别靶分子miR-21前后的暗场照片和LSPR散射λmax光谱图。从图中可以看出，在没有靶分子miR-21存在时，Au@Ag NCs的LSPR散射光谱和散射光颜色基本保持不变；在1pM的靶分子miR-21存在时，Au@Ag NCs的LSPR散射光颜色由绿色变到黄绿色，其LSPR散射λmax由原来的556nm红移至587nm，发生了31nm的红移。同时，对图10a中选取的Au@Ag NC-tsDNA17探针分子进行了原位SEM的分析(如图11所示)，在Au@Ag NC-tsDNA17探针分子与靶分子miR-21杂交过程中，Au@Ag NCs的形貌并未发生变化。通过上述实验结果可以推断出，Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别靶分子miR-21后，杂交形成DNA双螺旋结构，DNA分子间隙中的部分水分子被排出，导致Au@Ag NCs表面折射率的增大，引起颗粒LSPR散射光颜色的变化及其LSPR散射λmax的红移，从而实现对靶分子miR-21的检测。
根据文献中的报道，DNA探针分子的密度对于其识别靶分子的过程具有严重的影响。为了获得最佳的检测性能，申请人研究了不同尺寸的tsDNA对miRNA的检测效果。机理如图1所示，我们分别选用tsDNA7，tsDNA17和tsDNA26修饰到单个Au@Ag NC表面构建了Au@AgNC-tsDNA7，Au@Ag NC-tsDNA17和Au@Ag NC-tsDNA26三种单颗粒LSPR探针分子，考察了三种探针分子与靶分子miR-21的杂交。其结果如图12所示，在相同条件下，上述三种探针分子在单个Au@Ag NC表面与1pM靶分子miR-21杂交，对应的引起了颗粒的LSPR散射光谱红移量(Δλmax-red)分别为15nm，31nm和25nm，其中Au@Ag NC-tsDNA17与靶分子miR-21杂交引起颗粒的LSPR散射Δλmax-red最大，检测效果最明显，为单粒子miRNA纳米传感器探针分子的选择提供了依据。
基于前面的研究结果，我们选择使用边长为17bp的tsDNA17修饰的单个Au@Ag NC作为识别靶分子miR-21的探针。为了研究Au@Ag NC-tsDNA17探针分子与靶分子miR-21在单个Au@Ag NC表面杂交的动力学过程，我们实时的记录了颗粒LSPR散射光谱λmax的变化。图13给出了Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别靶分子miR-21不同时间段对应的LSPR散射光谱图。从图中可以看出，在没有miR-21存在时，Au@Ag NC的LSPR散射光谱λmax基本保持不变；当具有1pM靶分子miR-21存在时，Au@Ag NC的LSPR散射光谱λmax会随着时间的增加发生明显的红移，并且Δλmax-red在初始阶段快速增加，当反应时间达到2h后，其反应速率趋于平缓，反应3h后Δλmax-red达到定值31nm，可以认为反应基本结束。
二、定量检测miR-21
通过考察金属纳米颗粒LSPR散射光谱λmax及散射光颜色的变化，可以很灵敏的对靶分子进行检测，所以采用这种方法对一系列不同浓度的靶分子miR-21进行测定。图14给出了Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别不同浓度的靶分子miR-21对应的LSPR散射光谱图。从中可以看出，颗粒的LSPR散射Δλmax-red随着靶分子miR-21浓度的增大而增加，检测动态范围从1aM到1nM，横跨10个数量级，当检测低至1aM时，颗粒的LSPR散射Δλmax-red为4nm，信噪比在5.0以上(图15)。基于单个Au@Ag NC-tsDNA17探针分子构建的等离子体纳米生物传感器的检测灵敏度要优于以前报道的很多单颗粒水平的生物传感器。
选取初始LSPR散射λmax在556nm处的Au@Ag NC-tsDNA17探针分子作为研究对象，利用LSPR光谱仪对Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别不同浓度的靶分子miR-21的过程进行了实时光谱追踪。如图16(a)所示，在加入不同浓度的靶分子miR-21(1aM到1nM)后，Au@Ag NC-tsDNA17探针分子的LSPR散射λmax发生不同程度的红移，随着靶分子miR-21浓度的增大而增加，其最大值达到40nm之多。如前所述，Δλmax-red在初始阶段快速增加，当反应时间达到2h后，其反应速率趋于平缓，Δλmax-red达到最大值的95％以上，可以认为反应基本结束。图16(b)给出了Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别1pM的靶分子miR-21在110min到120min的LSPR散射λmax的时间动态曲线。从图中可以看出，由于靶分子miR-21与Au@Ag NC-tsDNA17探针分子界面的碰撞作用，导致颗粒的LSPR散射λmax在一定范围内(小于0.2nm)跳动；当Au@Ag NC-tsDNA17探针分子与单个靶分子miR-21发生杂交反应时，在113min和117min处分别引起了颗粒的LSPR散射λmax的一个约0.4nm的红移。
三、单个Au@Ag NC-tsDNA17探针分子的特异性检测能力和复杂体系中的检测能力
对靶分子检测的特异性和选择性是衡量一个探针分子的重要指标。图17和图18分别给出了Au@Ag NC-tsDNA17探针分子对靶分子miR-21的特异性检测能力和在复杂体系中的检测能力。从图17中可以看出，当Au@Ag NC-tsDNA17探针分子与相同浓度(1pM)的靶分子miR-21、单个碱基错配的miRNA以及随机miRNA发生作用时，随机miRNA对颗粒LSPR散射λmax的影响几乎可以忽略不计；Au@Ag NC-tsDNA17探针分子识别靶分子miR-21引起颗粒LSPR散射Δλmax-red是单个碱基错配的miRNA引起的Δλmax-red的2倍之多。结果表明，Au@Ag NC-tsDNA17探针分子对靶分子miR-21具有特异性检测能力。另外，tsDNA具有很好的抗蛋白吸附和在血清中抗降解的能力，可以用于复杂体系靶分子的检测。如图18所示，当这种Au@AgNC-tsDNA17探针分子检测胎牛血清(FBS)和人血清(HS)里的靶分子miR-21时，既不会增加背景信号，也不会丢失信号分子。比较结果发现，在50％胎牛血清内和50％的人血清内与纯溶液中测得的1pM靶分子miR-21的信号相比，颗粒的LSPR散射Δλmax-red波动在10％以内。表明Au@Ag NC-tsDNA17探针分子可以选择性识别复杂体系里的靶分子，对应用于临床样本的检测带来了希望。
实施例5
本实施例涉及一种基于tsDNA的单颗粒LSPR探针对核酸内切酶(KpnI和StuI)活性的检测，包括如下步骤：
将2～5μL的酶溶液与酶切缓冲液以及超纯水混合得到100～200μL的反应液，然后将其滴加到上述tsDNA修饰的Au@Ag NCs的探针表面，在25～40℃反应10～30min后，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，进行LSPR散射光谱的测量。
为了实现以单个Au@Ag NC-tsDNA17作为探针分子的等离子体纳米生物传感器的多功能性，我们将其应用于核酸内切酶KpnI和StuI活性的检测。用聚丙烯凝胶电泳来验证核酸内切酶KpnI和StuI是否对tsDNA17有剪切作用。图19给出了tsDNA17在核酸内切酶KpnI和StuI作用前后的电泳分析图。从图中可以看出，经过核酸内切酶KpnI或StuI作用后的tsDNA17的迁移速率比作用前的快，并且经过核酸内切酶KpnI和StuI同时作用后的tsDNA17，被切割成2条片段，成功的说明了核酸内切酶KpnI和StuI对tsDNA17都具有明显的剪切作用。我们利用LSPR光谱仪和暗场倒置显微镜(DFM)以初始LSPR散射λmax位于587nm的Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物为研究对象，如图20所示，在没有核酸内切酶KpnI或StuI存在时，Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物的LSPR散射λmax基本保持不变(I)；在核酸内切酶KpnI或StuI存在时，Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物的LSPR散射λmax发生了一定的蓝移(Δλmax-blue)，分别为8nm(II，Δλmax-blue-miR-21@KpnI＝8nm)和10nm(III，Δλmax-blue-miR-21@StuI＝10nm)，其LSPR散射光颜色由橘色变到黄绿色；当核酸内切酶KpnI和StuI同时存在时，Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物的LSPR散射光颜色由橘色变到绿色，其LSPR散射λmax由原来的587nm蓝移至569nm，发生了18nm的蓝移(IV，Δλmax-blue-miR-21@KpnI@StuI＝18nm)。说明当分别加入核酸内切酶KpnI或StuI时，tsDNA17的边(l2或l3)会分别被破坏；当同时加入核酸内切酶KpnI和StuI时，tsDNA17的两条边(l2和l3)会同时被破坏，此时tsDNA17边(l2或l3)上DNA分子的位置就会被周围的水分子取代，导致颗粒附近的RI的减小，从而使探针分子的LSPR散射λmax发生蓝移。
为了进一步验证以单个Au@Ag NC-tsDNA17作为探针分子的等离子体纳米生物传感器可以特异性的检测核酸内切酶KpnI和StuI的活性，我们另外选择了两种核酸内切酶HindIII和SalI作为对照。图21给出了Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物识别不同核酸内切酶KpnI、StuI、HindIII和SalI前后LSPR散射λmax的变化。从图中可以看出，在相同反应条件下，与Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物本身的LSPR散射λmax相比，识别核酸内切酶KpnI或StuI后，Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物的LSPR散射λmax分别发生了一定的蓝移，而识别核酸内切酶HindIII或SalI后，Au@Ag NC-tsDNA17-miR-21纳米复合物的LSPR散射λmax并没有发生明显的变化。这些结果表明，构建的等离子体纳米生物传感器对测核酸内切酶KpnI和StuI具有良好的选择性。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1).分别制备Au@AgNCs溶胶和四面体结构DNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；
2).将所述四面体结构DNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育2～6h后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针。
2.如权利要求1所述单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，所述Au@AgNCs溶胶的制备方法包括如下步骤：
1.1).合成纳米金种子；
1.2).将所述纳米金种子与十六烷基三甲基氯化铵进行反应，得到金溶胶；
1.3).将所述金溶胶与抗坏血酸在40～80℃下进行反应后，加入硝酸银，反应后得到Au@AgNCs溶胶。
3.如权利要求1所述单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，所述Au@AgNCs固定于表面氧化铟锡导电膜玻璃的方法为：
将氧化铟锡导电膜玻璃的表面清洗干净后，浸入到Au@AgNCs溶胶中，静置1～5min后取出，用超纯水清洗并用氮气吹干，即可。
4.如权利要求1所述单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，所述四面体结构DNA溶液的制备方法包括如下步骤：
将各条单链DNA溶解，在紫外分光光度计下测定260nm处的吸收，并参考每条单链DNA的摩尔消光系数，确定其浓度；
将四条单链DNA以等比例混合于TM缓冲液中，加入三(2-羧乙基)膦后，转入聚合酶链式反应仪中，在90～98℃下持续10～15min后，迅速降温至～5℃，得到tsDNA溶液。
5.一种如权利要求1中所述构建方法制备的单颗粒生物探针在MicroRNA-21的检测以及核酸内切酶活性检测中的用途，其特征在于，所述核酸内切酶包括KpnI和StuI。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述单颗粒生物探针在MicroRNA-21在检测miR-21时的具体操作为：
将miR-21溶液滴加到探针分子的表面，在室温下反应2～5h后，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，进行LSPR散射光谱的测量。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述单颗粒生物探针在核酸内切酶时的具体操作为：
将2～5μL的核酸内切酶溶液与酶切缓冲液以及超纯水混合得到100～200μL的反应液，
将所述反应液滴加到探针分子表面，在20～50℃反应10～30min后，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，进行LSPR散射光谱的测量。
CN201711026859.XA 2017-10-27 2017-10-27 一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途 Pending CN108085370A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711026859.XA CN108085370A (zh) 2017-10-27 2017-10-27 一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711026859.XA CN108085370A (zh) 2017-10-27 2017-10-27 一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108085370A true CN108085370A (zh) 2018-05-29

Family

ID=62170634

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711026859.XA Pending CN108085370A (zh) 2017-10-27 2017-10-27 一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108085370A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110055245A (zh) * 2019-04-26 2019-07-26 南京邮电大学 一种dna四面体结构、制备方法及其应用
CN110066851A (zh) * 2019-04-26 2019-07-30 南京邮电大学 四面体dna介导组装荧光纳米生物探针、制备方法及应用
CN111812064A (zh) * 2020-06-02 2020-10-23 南京邮电大学 一种生物传感器及制备方法和应用
CN112961906A (zh) * 2021-02-05 2021-06-15 南京邮电大学 金纳米棒检测探针、制备方法、检测方法及其应用
CN115121803A (zh) * 2021-03-11 2022-09-30 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种基于dna框架结构的多聚纳米团簇的合成方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007122405A1 (en) * 2006-04-20 2007-11-01 Isis Innovation Limited Polyhedral nanostructures formed from nucleic acids
CN102899418A (zh) * 2012-11-09 2013-01-30 中国科学院上海应用物理研究所 一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法
WO2012125987A9 (en) * 2011-03-17 2013-06-13 Massachusetts Institute Of Technology Delivery system
CN103308462A (zh) * 2013-06-26 2013-09-18 南京邮电大学 银金核-卫星结构表面等离子体共振探针及其制备方法
CN103344616A (zh) * 2013-06-26 2013-10-09 南京邮电大学 单颗粒银纳米立方体表面等离子体共振探针及其制备方法
CN103698375A (zh) * 2013-12-27 2014-04-02 上海市计量测试技术研究院 一种检测miRNA的方法
CN104032006A (zh) * 2014-06-12 2014-09-10 南京邮电大学 单个金纳米颗粒表面等离子共振探针及其制备方法
CN104263725A (zh) * 2014-09-19 2015-01-07 上海市计量测试技术研究院 塔尖四面体dna纳米结构探针及端粒酶电化学检测
CN104555913A (zh) * 2015-01-28 2015-04-29 江南大学 一种银包金纳米棒的制备方法及应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007122405A1 (en) * 2006-04-20 2007-11-01 Isis Innovation Limited Polyhedral nanostructures formed from nucleic acids
WO2012125987A9 (en) * 2011-03-17 2013-06-13 Massachusetts Institute Of Technology Delivery system
CN102899418A (zh) * 2012-11-09 2013-01-30 中国科学院上海应用物理研究所 一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法
CN103308462A (zh) * 2013-06-26 2013-09-18 南京邮电大学 银金核-卫星结构表面等离子体共振探针及其制备方法
CN103344616A (zh) * 2013-06-26 2013-10-09 南京邮电大学 单颗粒银纳米立方体表面等离子体共振探针及其制备方法
CN103698375A (zh) * 2013-12-27 2014-04-02 上海市计量测试技术研究院 一种检测miRNA的方法
CN104032006A (zh) * 2014-06-12 2014-09-10 南京邮电大学 单个金纳米颗粒表面等离子共振探针及其制备方法
CN104263725A (zh) * 2014-09-19 2015-01-07 上海市计量测试技术研究院 塔尖四面体dna纳米结构探针及端粒酶电化学检测
CN104555913A (zh) * 2015-01-28 2015-04-29 江南大学 一种银包金纳米棒的制备方法及应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MA Y, LI W, CHO EC等: "Au@Ag core-shell nanocubes with finely tuned and well-controlled sizes, shell thicknesses, and optical properties", 《ACS NANO》 *
MIAO P，WANG B，CHEN X等: "Tetrahedral DNA Nanostructure-Based MicroRNA Biosensor Coupled with Catalytic Recycling of the Analyte", 《ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES》 *
PARK KH, KIM S, YANG SM等: "Detection of DNA immobilization and hybridization on gold/silver nanostructures using localized surface plasmon resonance.", 《JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY》 *
SCHNEIDER, T., JAHR, N., JATSCHKA, J等: "Localized surface plasmon resonance (LSPR) study of DNA hybridization at single nanoparticle transducers", 《JOURNAL OF NANOPARTICLE RESEARCH》 *
T. GHODSELAHI, S. ARSALANI, T. NEISHABOORYNEJAD: "Synthesis and biosensor application of Ag@Au bimetallic nanoparticles based on localized surface plasmon resonance", 《APPLIED SURFACE SCIENCE》 *
TIAN Y, ZHANG L, SHEN J等: "An Individual Nanocube-Based Plasmonic Biosensor for Real-Time Monitoring the Structural Switch of the Telomeric G-Quadruplex", 《SMALL》 *
XU F, DONG H, CAO Y等: "Ultrasensitive and Multiple Disease-Related MicroRNA Detection Based on Tetrahedral DNA Nanostructures and Duplex-Specific Nuclease-Assisted Signal Amplification", 《ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110055245A (zh) * 2019-04-26 2019-07-26 南京邮电大学 一种dna四面体结构、制备方法及其应用
CN110066851A (zh) * 2019-04-26 2019-07-30 南京邮电大学 四面体dna介导组装荧光纳米生物探针、制备方法及应用
CN111812064A (zh) * 2020-06-02 2020-10-23 南京邮电大学 一种生物传感器及制备方法和应用
CN111812064B (zh) * 2020-06-02 2022-06-28 南京邮电大学 一种生物传感器及制备方法和应用
CN112961906A (zh) * 2021-02-05 2021-06-15 南京邮电大学 金纳米棒检测探针、制备方法、检测方法及其应用
CN112961906B (zh) * 2021-02-05 2024-01-23 南京邮电大学 金纳米棒检测探针、制备方法、检测方法及其应用
CN115121803A (zh) * 2021-03-11 2022-09-30 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种基于dna框架结构的多聚纳米团簇的合成方法
CN115121803B (zh) * 2021-03-11 2024-04-30 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种基于dna框架结构的多聚纳米团簇的合成方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108085370A (zh) 一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途
EP1977242B1 (en) Lateral flow immunoassay with encapsulated detection modality
CN106018373B (zh) 三维金属增强荧光/比色双模纸芯片的制备及atp检测
CN108152250A (zh) 生物识别探针的构建方法及其逻辑运算方法
Malicka et al. Fluorescence spectral properties of cyanine dye-labeled DNA oligomers on surfaces coated with silver particles
Fang et al. Tuning surface states to achieve the modulated fluorescence of carbon dots for probing the activity of alkaline phosphatase and immunoassay of α-fetoprotein
Liu et al. Ultrasensitive and facile detection of multiple trace antibiotics with magnetic nanoparticles and core-shell nanostar SERS nanotags
CN107478641A (zh) 液相表面增强拉曼光谱传感器、其制备方法及其用于核酸检测的用途
CN106052872B (zh) 一种基于纳米材料自组装的土霉素sers检测方法
CN108287134A (zh) 单颗粒生物探针及其等离子体生物存储器的构建方法
CN104741604A (zh) 一种海参状纳米复合材料及其制备方法和应用
JP2007524347A (ja) マイクロアレイ形式のアッセイにおける、万能ナノ粒子プローブを用いた標識不要の遺伝子発現プロファイリング
Yan et al. DNA-functionalized photonic crystal microspheres for multiplex detection of toxic metal ions
Fang et al. Review of FRET biosensing and its application in biomolecular detection
Mao et al. Ultra-sensitive and high efficiency detection of multiple non-small cell lung cancer-related miRNAs on a single test line in catalytic hairpin assembly-based SERS-LFA strip
CN101182578A (zh) 基于纳米金探针的基因芯片的dna检测方法
Zhou et al. Color resolution improvement of the dark-field microscopy imaging of single light scattering plasmonic nanoprobes for microRNA visual detection
Han et al. Sensitive and reliable identification of fentanyl citrate in urine and serum using chloride ion-treated paper-based SERS substrate
Li et al. DNAzyme-catalyzed etching process of Au/Ag nanocages visualized via dark-field imaging with time elapse for ultrasensitive detection of microRNA
Liu et al. A novel SERS biosensor for ultrasensitive detection of mercury (II) in complex biological samples
CN110296961A (zh) 基于双嵌段dna的可调控纳米金探针的构建及应用
Luo et al. Catalytic hairpin assembly-mediated SERS biosensor for double detection of MiRNAs using gold nanoclusters-doped COF substrate
Lo et al. Monitoring of DNA–protein interaction with single gold nanoparticles by localized scattering plasmon resonance spectroscopy
CN109946285A (zh) 用于检测肺癌标志物miR-196a的金银纳米线SERS传感器的制备方法及传感器
CN106970032B (zh) 一种可视化金纳米粒子探针的制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180529