CN108060119B - 小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管平滑肌细胞的方法 - Google Patents

小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管平滑肌细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管平滑肌细胞的方法。所述小分子组合包括按时序分开使用的第一阶段小分子化合物和第二阶段小分子化合物，所述第一阶段小分子化合物包括DNMT抑制剂和赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂中的至少一种；所述第二阶段小分子化合物包括WNT/β‑catenin激动剂，cAMP激动剂和TG F‑beta受体抑制剂。本发明通过小分子化合物分阶段诱导，能够将分化的细胞转分化为血管平滑肌细胞，各步骤可实现精准质控，便于标准化操作和规模化生产。本发明提供的方法供体来源广泛，患者本人即是理想供体，可在较短时间内获得基础研究、临床治疗或组织工程生产所需的足够数量的血管平滑肌细胞。

Description

小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细 胞制备血管平滑肌细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学，组织工程和再生医学领域，尤其涉及一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管平滑肌细胞的方法。
背景技术
由于创伤、心血管疾病、器官移植、血液透析患者群体数量庞大，且自体血管具有不可替代性，同种异体血管具有来源有限、存在疾病传播风险与免疫排斥反应等原因，临床对血管替代物需求巨大。血管替代物按支架材料可分为高分子聚合物与生物材料2类。血管替代物需具有良好的强度、韧性、顺应性、不渗血、组织相容性，以及正常血管的其它生物学功能。脱细胞基质人工血管替代物已成为当前及今后的主流发展方向。脱细胞基质人工血管替代物需要大量血管平滑肌种子细胞以提供细胞外基质蛋白。传统应用的种子细胞主要来源于异种采集、同种异体捐赠、成体干细胞定向诱导、EC/IPS定向诱导，但存在来源有限、获取过程复杂、细胞纯度低、具有免疫原性或致瘤风险等问题，因而应用受限。
多种分化的细胞如皮肤成纤维细胞具有来源丰富、易于获取并易于在体外长期大量扩增培养的优点。目前利用细胞转分化技术已经可以把分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接诱导为成肌细胞、神经元、肝细胞、成骨细胞等多种不同类型的功能细胞；或先诱导为多能干细胞后，再进一步定向诱导为相应的功能细胞。上述采用细胞转分化技术从某种特定分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接或间接诱导获得的功能细胞已经不再保持源细胞的分子特征与功能，但获得了相应目标细胞的典型分子特征与细胞功能。目前，上述诱导性功能细胞已逐渐应用于疾病模型研究、临床治疗研究与组织工程研究。
传统的细胞转分化需要通过导入特定的外源性基因实现，有时还需要相应的小分子化合物、细胞因子或重组蛋白协同作用。文献已有较多采用特定外源性基因把某一分化的细胞诱导为另一功能性分化的细胞的报道。如文献已有采用BMP-2，BMP-7，LMP3单独或协同作用使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞的报道。但导入外源性基因存在致瘤风险，并可能使目标细胞产生免疫原性，难以推广应用。2013年，邓宏魁报道仅采用小分子化合物或其组合可以实现鼠皮肤成纤维细胞重编程为神经细胞的转分化过程，并证实该细胞转分化技术具有诱导过程短、诱导***稳定、易于质控、成本低、无外源性基因***导致的致瘤风险、获得的目标细胞具有良好的安全性与稳定性且无免疫原性，具有潜在的临床应用价值与产业化前景。此后，申请号为201410075246.5的中国专利申请提供了一种把分化的细胞诱导转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地，该申请涉及采用组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂和转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂的组合，在正常生理低氧环境下诱导成纤维细胞、上皮细胞等分化的细胞转分化为具有良好多能性及传代稳定性的神经干细胞。申请号为201610213644.8的中国专利申请提供了一种诱导成纤维细胞转分化为心肌细胞的诱导培养基、方法及其应用，所述诱导培养基包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为6TCFOW或SCFOV，其中6为E61541、T为苯环丙胺、C为CHIR99021、F为毛喉素、O为Dorsomorphin、W为IWR-1、S为SB431542、V为丙戊酸。该申请诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为心肌细胞。目前，通过采用单纯小分子化合物或其组合诱导人类分化的细胞如皮肤成纤维细胞获得施旺细胞(THOMA EC，et al，2014)、神经细胞(HU W，et al，2015)、胰岛细胞(Sheng Ding，et al，2015)的成果已陆续见诸报道。
由于人类与小鼠存在约25％的基因差异，而将上述在小鼠细胞实验中获得成功的专利申请技术方案应用于人的同类细胞转分化可行性不高；另一方面，由于诱导同类细胞转分化获得不同目标细胞的具体理论基础与技术手段并不相同，申请人采用上述报道的技术方案分别重复试验，既未能把应用于小鼠细胞的转分化技术方案成功应用于人的同类细胞转分化，也未能把人类分化的细胞诱导转分化为血管平滑肌细胞。
发明内容：
本发明提供了一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管平滑肌细胞的方法。本发明通过利用小分子化合物组合按时序分阶段处理分化的细胞快速稳定程序化地获得大量血管平滑肌细胞或其产物。
本发明第一方面，提供一种小分子化合物组合，所述小分子组合包括按时序分开使用的第一阶段小分子化合物和第二阶段小分子化合物，所述第一阶段小分子化合物包括DNMT(DNA甲基转移酶)抑制剂和赖氨酸脱乙酰基酶(Lysine deacetylases inhibitors，KDACIs)抑制剂中的至少一种；所述第二阶段小分子化合物包括WNT/β-catenin激动剂，cAMP激动剂和TGF-beta受体抑制剂。
进一步地，所述第二阶段小分子化合物还包括赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂，RAR激动剂，DNMT抑制剂，HMT(组蛋白甲基转移酶)抑制剂，PKC抑制剂，ascorbate(抗坏血酸)，JNK抑制剂，ROCK抑制剂和组蛋白去甲基化酶抑制剂中的至少一种。
进一步地，所述赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂包括sodium phenylbutyrate，butyrate，sodium butyrate(NaB)，MC1568，CI994(Tacedinaline)，chidamide，CAY10683(SantacruzaMate A)，CUDC-907，M344(Histone Deacetylase Inhibitor III)，LAQ824(NVP-LAQ824，Dacinostat)，Pracinostat(SB939)，VPA，Scriptaid，Apicidin，LBH-589(Panobinostat)，MS-275，SAHA(Vorinostat)，Trichostatin(TSA)，Psammaplin A，PCI-24781(Abexinostat)，Rocilinostat(ACY-1215)，Mocetinostat(MGCD0103)，4-Phenylbutyrate(4PB)，splitomicin，SRT1720，resveratrol，Sirtinol，APHA，CI-994，Depudecin，FK-228，HC-Toxin，ITF-2357(Givinostat)，Chidamide，RGFP 966，PHOB，BG45，Nexturastat A，TMP269，CAY10603，MGCD-0103，Niltubacin，PXD-101(Belinostat)，Pyroxamide，Tubacin，EX-527，BATCP，Cambinol，MOCPAC，PTACH，MC1568，NCH51和TC-H106中的至少一种；
所述TGF-β受体抑制剂包括616452，LY2109761，Pirfenidone，Repsox(E-616452)，SB431542，A77-01，Tranilast，Galunisertib(LY2157299)，A8301，GW788388，ITD-1，SD208，SB525334，LY364947，ASP3029，D4476和SB505124中的至少一种；
所述PKC抑制剂包括Go6983，Ro31-8220Mesylate，Go6976和BisindolylmaleimideI(GF109203X)中的至少一种；
所述WNT/β-catenin激动剂包括MAY-262611，CHIR98014，CHIR99021，LiCl，Li2CO3，TD114-2，AZD2858，AZD1080，BIO，Kenpaullone，TWS119，LY2090314，CBM1078，SB216763和AR-A014418中的至少一种；
所述cAMP激动剂包括EPAC/RAP1激动剂，8-Bromo-cAMP，Dibutyryl-Camp和Sp-8-Br-cAMPs中的至少一种；
所述EPAC/RAP1激动剂包括Forskolin，IBMX，Prostaglandin E2(PGE2)，NKH477，8-pCPT-2′-O-Me-cAMP，GSK256066，Apremilast(CC-10004)，Roflumilast，Cilomilast，Rolip ram和Milrinone中的至少一种；
所述RAR激动剂包括TTNPB，Bexarotene，Ch55，Tamibarotene，Retinol，AM580，ATRA，13-cis RA，Vitamin A及Vitamin A衍生物中的至少一种；
所述ROCK抑制剂包括Y-27632，Y-27632 2HCl，Thiazovivin，Ripasudil(K-115)，Fasu dil，Fasudil(HA-1077)HCl，GSK429286A，RKI-1447和PKI-1313中的至少一种；
所述JNK抑制剂包括SP600125，JNK Inhibitor IX，AS601245，AS602801和JNK-IN-8中的至少一种；
所述DNMT抑制剂包括RG108，Thioguanine，5-Aza-2'-deoxycytidine(Decitabine)，SGI-1027，Zebularine和5-Azacytidine(AZA)中的至少一种；
所述HMT抑制剂包括EPZ004777，EPZ5676，GSK503，BIX 01294和SGC 0946中的至少一种；
所述组蛋白去甲基化酶抑制剂包括parnate(tranylcypromine)，Tranylcypromine(2-PCPA)HCl，SP2509，4SC-202，ORY-1001(RG-6016)，GSKJ1和GSK-LSD1中的至少一种。
所述小分子化合物组合为选自下述第一阶段小分子化合物的任一项和第二阶段小分子化合物的任一项的时序性小分子化合物组合，所述时序性小分子化合物组合所属的小分子化合物必须按一定的时序与相应的细胞或细胞产物接触；
作为优选，所述第一阶段小分子化合物采用下列任一项：
5-aza-2-deoxycytidine；
RG108；
TSA；
NaB；
VPA；
5-Aza-2'-deoxycytidine+NaB；
5-Aza-2'-deoxycytidine+VPA+NaB；
5-Aza-2'-deoxycytidine+TSA；
5-Aza-2'-deoxycytidine+TSA+VPA；
5-Aza-2'-deoxycytidine+VPA；
RG108+5-Aza-2'-deoxycytidine；
RG108+VPA；
RG108+NaB；
RG108+VPA+NaB；
RG108+TSA；
RG108+TSA+VPA；
RG108+5-Aza-2'-deoxycytidine+VPA；
RG108+5-Aza-2'-deoxycytidine+VPA+NaB；
所述第二阶段小分子化合物采用下列组合的任一项：
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin；
VPA+CHIR99021+SB431542+Forskolin；
BIO+SB431542+Forskolin；
CHIR99021+Repsox+Forskolin+Rolipram；
CHIR99021+Repsox+Forskolin+Rolipram+SB431542；
CHIR99021+SB431542+Forskolin+Rolipram；
BIO+SB431542+Forskolin+Rolipram；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+NaB；
CHIR99021+Repsox+Forskolin+NaB；
VPA+BIO+SB431542+Rolipram；
BIO+SB431542+Rolipram+SP600125；
VPA+BIO+SB431542+Forskolin；
VPA+CHIR99021+SB431542+Rolipram；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+SP600125；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+8-pCPT-2′-O-Me-cAMP；
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VPA+CHIR99021+SB431542+Forskolin+Tranilast；
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VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+SP600125+Y-27632+ascorbate；
VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin+Go6983+TTNPB+EPZ004777+AM580+Y-27632+ascorbate。
本发明第二方面，提供一种制备血管平滑肌细胞的方法。一种利用所述的小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管平滑肌细胞的方法，所述方法将分化的细胞依次与第一阶段小分子化合物、第二阶段小分子化合物接触诱导，制备得到血管平滑肌细胞。所述分化的细胞来源于哺乳动物如人，所述分化的细胞包括成纤维细胞，上皮细胞或脂肪细胞，优选地所述分化的细胞是成纤维细胞。
所述分化的细胞与第一阶段小分子化合物接触诱导的时间为2～10天，第一阶段接触诱导后的细胞产物与第二阶段小分子化合物接触诱导的时间为5～20天。
本发明的一些实施方案，具体小分子化合物的最低有效浓度如下，以下给出的浓度范围只是参考，可在此基础上做适应性修改，如果其他小分子替代以下小分子，浓度也可以做适应性调整。
Forskolin浓度为2μM～20μM；Repsox浓度为2～15uM；CHIR99021浓度为1μM～10μM；VPA浓度为0.5mM～1.5mM；TTNPB浓度为3μM～8μM；AM580浓度为0.03～0.08μM；EPZ004777浓度为3～8μM；Go6983浓度为1～15μM；Y-27632浓度为3～15μM，L-Ascorbin acid 2-phosphate浓度为0.15～0.25mM；SP600125浓度为1～15μM；5-Aza-2'-deoxycytidine浓度为0.5～15μM。
也可利用本发明方法或者在本发明方法的基础上做适应性调整，诱导分化的细胞制备其它类型细胞如血管内皮细胞。如果利用本发明提供的小分子化合物组合制备除血管平滑肌细胞、血管内皮细胞之外的其他细胞，可以根据实际需要进行调整相应小分子化合物的浓度，以及在组合上作调整。
本发明第三方面，还提供一种包含所述小分子化合物组合的试剂盒或培养液/基。
本发明第四方面，还提供小分子化合物组合，包含所述小分子化合物组合的试剂盒或培养液/基的应用，如用于在体内动员诱导或体外诱导制备的血管平滑肌细胞或以其为源头细胞的再生医学种子细胞、组织工程种子细胞及其产物，可用于基础研究、临床治疗及组织工程产品研发与生产。
本发明第五方面，还提供所述的方法制备得到的血管平滑肌细胞，所述平滑肌细胞具备标准平滑肌细胞的分子特性，且所述的血管平滑肌细胞可以进行上万亿次扩增，而且纯度高，具有良好的产业化前景。
本发明第六方面，还提供所述血管平滑肌细胞及其产物的应用，如用于制备组织工程血管或再生医学种子细胞，还可制备血管平滑肌细胞的小分子化合物组合。
本发明的方法在适合产生诱导性血管平滑肌细胞的条件下进行，所述条件包括例如培养液的成分、浓度，培养温度，培养时间及其他条件。基于现有技术的充分教导并结合本发明的示例性说明，本领域技术人员不需要过度实验即能够容易地确定上述培养条件。关键在于选择所需抑制或激活的细胞信号通路，并确定作用细胞信号通路的顺序。另外，小分子化合物或其组合的浓度及其他条件也可在本发明提供的范围基础上做适应性调整。
本发明利用小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管平滑肌细胞的机理如下：本发明利用赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂和DNMT抑制剂处理细胞，激活进入转分化的内源性启动子的转录；然后利用WNT/β-catenin的激动剂，cAMP的激动剂和TGF-beta抑制剂，赖氨酸脱乙酰基酶的抑制剂，RAR(Retinoic acid)激动剂，DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferas，DNMT)的抑制剂，组蛋白甲基转移酶(Histone Methyltransferase，HMT)的抑制剂，PKC的抑制剂，ascorbate(抗坏血酸)，JNK的抑制剂和ROCK(Rho-associatedprotein kinase)的抑制剂，促进第一阶段所得分化的细胞产物继续转分化；最后采用常规的血管平滑肌细胞培养液或者市售商业化血管平滑肌细胞培养液，对诱导的细胞进行扩增和维持培养。以其中一个方案为例，分别利用5-AZA和TSA的小分子组合，以及Forskolin，CHIR99021，VPA，Repsox的小分子组合，各作用2～10天和5～20天，对成纤维细胞进行定向诱导得到血管平滑肌细胞。
本发明具有以下技术效果：本发明通过利用小分子化合物组合按时序分阶段处理分化的细胞快速稳定程序化地获得大量血管平滑肌细胞或其产物，所需样本量少，便于采集，供体来源广泛，易于标准化操作与精准质控，可规模化或个性化制备血管平滑肌细胞及组织工程血管等相关产品。此外，本发明也可以为心脑血管疾病的研究提供细胞模型或干预手段，广泛应用于基础医学研究、临床研究、临床治疗或血管组织工程，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中人皮肤成纤维细胞转分化为血管平滑肌细胞方法示意图；其中D0、D6、D9和D23表示培养0天、6天、9天和23天。
图2为通过小分子化合物诱导，人源皮肤成纤维细胞向血管平滑肌细胞转分化图，其中A图为皮肤成纤维细胞；B为第一阶段处理后的细胞产物；C为转分化后获得的血管平滑肌细胞(实施例1)，该细胞为转分化后的第1代(P1)；D为实施例6转分化后获得的血管平滑肌细胞，该细胞为转分化后的第1代；E图为血管平滑肌细胞标志性分子Actin alpha的染色鉴定；
图3为血管平滑肌细胞分子标志物在转分化的血管平滑肌细胞中的表达，A图为血管平滑肌细胞标志性分子Actin alpha(ACTA2)的表达，其中control代表未经过小分子化合物组合处理的成纤维细胞，iVSMC代表转分化获得的血管平滑肌细胞，两者对比，该基因在转分化获得的血管平滑肌细胞内明显上调；B图为血管平滑肌细胞标志性分子myocardin的表达，其中control代表未经过小分子化合物组合处理的成纤维细胞，iVSMC代表转分化获得的血管平滑肌细胞，两者对比，该基因在转分化获得的血管平滑肌细胞内明显上调；C图为血管平滑肌细胞标志性分子smooth muscle myosin heavy chain(MHC-10)的表达，其中control代表未经过小分子化合物组合处理的成纤维细胞，iVSMC代表转分化获得的血管平滑肌细胞，两者对比，该基因在转分化获得的血管平滑肌细胞内明显上调；
图4为转分化的血管平滑肌细胞iVSMC可以连续传代，大量扩增，从而获得大量高纯的血管平滑肌细胞。A图为血管平滑肌细胞标志性分子MHC-10分别在转分化的血管平滑肌细胞的第1代，第5代和第10代的表达，以成纤维细胞(HuFib)作为对照；B图为血管平滑肌细胞标志性分子ACTA2分别在转分化的血管平滑肌细胞的第1代，第5代和第10代的表达，以成纤维细胞(HuFib)作为对照；C图为经过传代扩增后第5代的iVSMC的细胞形态，与P1代相比，细胞形态未见明显变化，且形态均一；D图为经过传代扩增后第10代的iVSMC的细胞形态，与P1代相比，细胞形态未见明显变化，且形态均一；E图为连续10代内iVSMC的生长曲线，iVSMC仍然可以连续增值，超过上万亿次扩增；F图为从成年人体内分离的皮肤成纤维细胞(HuFib)在含10％血清的高糖培养液培养条件下，连续10代内的生长曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但并不局限于以下实验方案。
实施例1
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1 从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2 细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(Day-1)，接种细胞密度4～6×103/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的活化
2.1 启动转活化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液A，培养细胞2～10天，第一阶段培养液A是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+1μM～20μM 5-Aza-2’-deoxycytidine，该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
2.2 通过2.1步骤处理细胞4～8天后，更换第一阶段培养液B，培养细胞2～5天，第一阶段培养液B是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+50nM～1μM TSA，该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。步骤2.2和步骤2.1可以进行合并，直接使用含有AZA和TSA的培养液培养即可。
3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)
细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(1μM～30μM)+Repsox(2～15μM)+CHIR99021(1μM～15μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)。该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增
随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(Lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+2m ML-glutamine+40mM bicarbonate，其中100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
5、诱导的血管平滑肌细胞的检测，见图1～图4，
通过免疫组化染色和RT-PCR的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smooth muscle myosin heavy chain；actin alpha2；myocardin。
实施例2
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1 从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2 细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(Day-1)，接种细胞密度4～6×103/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的活化
2.1 启动转活化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞2～10天，第一阶段培养液A是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+1μM～20μM 5-Aza-2’-deoxycytidine+50nM～1μM TSA，该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)
细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(1μM～30μM)+Repsox(2～15μM)+CHIR99021(1μM～15μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)。该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增
随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(Lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+2mML-glutamine+40mM bicarbonate，其中100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
5、诱导的血管平滑肌细胞的检测
通过免疫组化染色和RT-PCR的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smooth muscle myosin heavy chain；actin alpha2；myocardin。
实施例3
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1 从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2 细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(Day-1)，接种细胞密度4～6×103/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的活化
2.1 启动转活化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞2～10天，第一阶段培养液A是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+1μM～20μM 5-Aza-2’-deoxycytidine+VPA(0.5mM～1.5mM)，该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)
细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(1μM～30μM)+Repsox(2～15μM)+CHIR99021(1μM～15μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)。该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增
随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(Lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+2m ML-glutamine+40mM bicarbonate，其中100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
5、诱导的血管平滑肌细胞的检测
通过免疫组化染色和RT-PCR的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smooth muscle myosin heavy chain；actin alpha2；myocardin。
实施例3
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1 从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2 细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(Day-1)，接种细胞密度4～6×103/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的活化
2.1 启动转活化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞2～10天，第一阶段培养液A是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+1μM～20μM 5-Aza-2’-deoxycytidine+VPA(0.5mM～1.5mM)，该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)
细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(1μM～30μM)+Repsox(2～15μM)+CHIR99021(1μM～15μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)。该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增
随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(Lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+2mML-glutamine+40mM bicarbonate，其中100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
5、诱导的血管平滑肌细胞的检测
通过免疫组化染色和RT-PCR的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smooth muscle myosin heavy chain；actin alpha2；myocardin。
实施例4
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1 从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2 细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(Day-1)，接种细胞密度4～6×103/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的活化
2.1 启动转活化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞2～10天，第一阶段培养液A是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+1μM～20μM 5-Aza-2’-deoxycytidine，该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)
细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(1μM～30μM)+Repsox(2～15μM)+CHIR99021(1μM～15μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)。该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20放％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增
随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(Lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+2mML-glutamine+40mM bicarbonate，其中100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
5、诱导的血管平滑肌细胞的检测
通过免疫组化染色和RT-PCR的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smooth muscle myosin heavy chain；actin alpha2；myocardin。
实施例5
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1 从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2 细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(Day-1)，接种细胞密度4～6×103/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的活化
2.1 启动转活化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞2～10天，第一阶段培养液A是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+1μM～20μM 5-Aza-2’-deoxycytidine，该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)
细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+TTNPB(3μM～8μM)+AM580(0.03～0.08μM)+EPZ004777(3～8μM)+Go6983(1～15μM)+Y-27632(3～15μM)+L-Ascorbin acid 2-phosphate(0.15～0.25m)+SP600125(8～12μM)。该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增
随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(Lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+2mML-glutamine+40mM bicarbonate，其中100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
5、诱导的血管平滑肌细胞的检测
通过免疫组化染色和RT-PCR的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smooth muscle myosin heavy chain；actin alpha2；myocardin。
实施例6
1、皮肤成纤维细胞的分离围)
1.1 从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2 细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(Day-1)，接种细胞密度4～6×103/cm2培养于37℃，5％C O2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的活化
2.1 启动转活化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞2～10天，第一阶段培养液A是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/m l链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+1μM～20μM 5-Aza-2’-deoxycytidine，该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)
细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+TTNPB(3μM～8μM)+AM580(0.03～0.08μM)+EPZ004777(3～8μM)。该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增
随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(Lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+2mML-glutamine+40mM bicarbonate，其中100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
5、诱导的血管平滑肌细胞的检测
通过免疫组化染色和RT-PCR的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smooth muscle myosin heavy chain；actin alpha2；myocardin。
实施例7
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1 从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2 细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(Day-1)，接种细胞密度4～6×103/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的活化
2.1 启动转活化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞2～10天，第一阶段培养液A是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+1μM～20μM 5-Aza-2’-deoxycytidine，该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)
细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+TTNPB(3μM～8μM)+AM580(0.03～0.08μM)+EPZ004777(3～8μM)+Go6983(1～15μM)+Y-27632(3～15μM)+L-Ascorbin acid 2-phosphate(0.15～0.25m)。该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增
随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(Lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+2mML-glutamine+40mM bicarbonate，其中100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
5、诱导的血管平滑肌细胞的检测
通过免疫组化染色和RT-PCR的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smooth muscle myosin heavy chain；actin alpha2；myocardin。
实施例8
1、皮肤成纤维细胞的分离
1.1 从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM。
1.2 细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(Day-1)，接种细胞密度4～6×103/cm2培养于37℃，5％CO2的培养箱中。
2、皮肤成纤维细胞的活化
2.1 启动转活化时(Day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞2～10天，第一阶段培养液A是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+1μM～20μM 5-Aza-2’-deoxycytidine，该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。在37℃，5％CO2环境下培养细胞。
3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)
细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+forskolin(2μM～20μM)+Repsox(2～15uM)+CHIR99021(1μM～10μM)+VPA(0.5mM～1.5mM)+Y-27632(3～15μM)。该培养***中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增
随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(Lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+高糖DMDM培养基(Gibco)+2mML-glutamine+40mM bicarbonate，其中100U/ml青霉素(Sigma)和100μg/ml链霉素(Sigma)可以不使用。
5、诱导的血管平滑肌细胞的检测
通过免疫组化染色和RT-PCR的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smooth muscle myosin heavy chain；actin alpha2；myocardin。
以上实施例制备得到的血管平滑肌细胞以及检测见图1～图4，实施例中的皮肤成纤维细胞可采用其他分化的细胞替代，如血液细胞、脂肪细胞等。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征在和下文(如实施例)中具体描述的各种技术特征之间可以互相结合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

Claims (2)

1.一种利用小分子化合物组合诱导成纤维细胞制备血管平滑肌细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将成纤维细胞依次与第一阶段小分子化合物接触诱导2-10天、再与第二阶段小分子化合物接触10-15天，随后更换为常规的血管平滑肌培养液或市售商业化血管平滑肌培养液，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增；
所述第一阶段小分子化合物可选自下列任一项：
1）、5-Aza-2′-deoxycytidine+TSA；
2）、5-Aza-2′-deoxycytidine+VPA；
3）、5-Aza-2′-deoxycytidine；
所述第二阶段小分子化合物可选自下列任一项：
1）、Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA；
2）、Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777+Go6983+Y-27632+L-Ascorbin acid 2-phosphate+SP600125；
3）、Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777；
4）、Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777+Go6983+Y-27632+L-Ascorbin acid 2-phosphate;
5）、Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+Y-27632。
2.一种利用小分子化合物诱导成纤维细胞制备血管平滑肌细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将成纤维细胞依次利用第一阶段培养液A培养4-8天和利用第一阶段培养液B培养细胞2-5天，再与第二阶段小分子化合物接触10-15天，随后更换为常规的血管平滑肌培养液或市售商业化血管平滑肌培养液，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增；
所述第一阶段培养液A的小分子化合物为5-Aza-2′-deoxycytidine；
所述第一阶段培养液B的小分子化合物为TSA；
所述第二阶段小分子化合物可选自下列任一项：
1）、Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA；
2）、Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777+Go6983+Y-27632+L-Ascorbin acid 2-phosphate+SP600125；
3）、Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777；
4）、Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+TTNPB+AM580+EPZ004777+Go6983+Y-27632+L-Ascorbin acid 2-phosphate;
5）、Forskolin+Repsox+CHIR99021+VPA+Y-27632。
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