CN108034679B - 一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，包括：浓缩液制备、发酵、酶液制备、配制，选取溢油现场采集筛选出的小球藻经培养后浓缩，将扩大培养后的小球藻进行发酵，以超声破碎仪破壁后提取酶液，将小球藻浓缩液与小球藻酶液混合后添加稳定剂即为生物表面活性剂。有益效果为：制备方法简单易行，成本低廉，安全环保，不添加新的污染物质；从微藻中提取的生物表面活性剂，其表面张力、乳化活力、黏度等乳化指标较为稳定，同时生物表面活性剂具有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底等优点，对石油的降解能力较强，其降解指数可以达到73.68‑91.56%，是一种安全高效的生物表面活性剂。
Description
技术领域
本发明涉及环境工程领域，尤其是涉及一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法。
技术背景
目前市面上多应用于溢油的产品有溢油分散剂、化油剂、消油剂等，其主要成分有：阴离子表面活性剂为主的醚型、非离子的酯型、原料来自农副产品、微毒的浓缩型。较之目前的化学表面活性剂合成产品，生物表面活性剂体现出诸多更益于研究发展的优点。生物表面活性剂作为天然表面活性剂的一种，其分子结构具有严格的亲水和疏水基团。它们不仅具备乳化分散油污及降低表面张力的功能，更有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底、生产工艺简单等优势。
目前主要的生物表面活性剂为糖脂类，具体有：鼠李糖脂，槐糖脂，脂肽、脂蛋白，脂肽，短杆菌肽，多粘菌素，脂肪酸，中性脂肪和磷脂，磷脂质，多聚生物表面活性剂，多糖乳化剂，生物分散剂，甲壳素，聚酯肽链，其来源主要为细菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，提取方法工艺简单，安全环保，生物表面活性剂具有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底的优点。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，包括：浓缩液制备、发酵、酶液制备、配制，具体包括以下步骤：
浓缩液制备：取培养后的小球藻藻液1L，在0-4℃、3500-5000r/min条件下离心10-15分钟，去掉所得上清液，留沉淀；将沉淀用缓冲液重悬浮，再于之前离心条件进行离心，重复3-4次；将藻液离心出的所有藻液进行合并，并用缓冲液稀释，终体积为200-220mL，于0-4℃温度下储存备用；选取溢油现场采集筛选出的小球藻进行培养，经浓缩后其活性、生物降粘、石油烃降解等性能均得到大幅度提高；
发酵：发酵培养基组成及其含量为：葡萄糖38-40g/L、玉米浆粉6-8g/L、蛋白胨4-5g/L、NaCl 12.5-15.0g/L、(NH4)2SO4 1.65-1.70g/L、MgSO4·7H2O 2.2-2.5g/L、KCl 0.5-0.6g/L、KH2PO4 0.5-0.6g/L、CaCl2 0.1-0.12g/L，121-122℃条件下进行高压蒸汽灭菌15-30分钟，按照3.5-5.0%接种经培养后的小球藻，在温度为30-33℃、pH为6.9-7.2、搅拌速度为320-340r/min、通气量0.65-0.85vvm条件下发酵培养时间为72-96小时得发酵液；小球藻在充足的氮源、碳源、微量元素等必须物质条件下，小球藻能够迅速地恢复至活力巅峰的阶段，从而其脱氢酶、氧化酶、过氧化酶、石油降解酶、石化酶等有机降解相关酶加速分泌，为提取酶液、降解石油烃做准备；
酶液制备：将发酵液在0-4℃、3500-5000r/min条件下离心10-15分钟，去掉所得上清液，留沉淀，将沉淀用缓冲液重悬浮后重复离心2-3次，合并沉淀；将沉淀溶于缓冲后用超声破碎仪破碎细胞，超声破碎仪功率为1.0-1.3kW，探头振幅为38-45%，温度为2-4℃，时间为30-48分钟；然后在0-4℃、11500-12000r/min条件下离心15-20分钟，留上清液，沉淀部分用缓冲液进行重悬浮，重复离心操作3-5次，合并上清液，低温浓缩至200-220mL后于0-4℃保存备用；选用超声破碎仪破碎小球藻，其破壁效果较好，不会对活性物质造成影响，不会添加新的污染物质，有利于进一步的离心提取；
配制：将小球藻浓缩液与小球藻酶液，于3-4℃条件下按1:0.5-3.0的体积混合，混合液密封后，置于装有冰水的三角瓶中，在20-22℃、200-220r/min条件下振荡混合10-13分钟，以5-6:1的体积添加稳定剂，即得生物表面活性剂；从微藻中提取的生物表面活性剂，其表面张力、乳化活力、黏度等乳化指标较为稳定，同时生物表面活性剂具有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底等优点，对石油的降解能力较强，其降解指数可以达到73.68-91.56%，而且其制备方法简单易行，成本低廉，可以规模化应用于环境工程之中。
作为优选，所用小球藻为从溢油现场采集筛选得出，经过驯化、传代，在石油的生物降粘、提高原油采收率、重油污染土壤的生物修复等均有显著成效。
作为优选，缓冲液为pH为7.8-7.9的Tris-HCl缓冲溶液；Tris-HCl缓冲溶液不会使酶变性，同时有可以提纯酶，增大酶液中酶的含量。
作为优选，稳定剂含量分别为，18-23%甘油、1.0-1.5mMEDTA与0.1-0.13mMDTT，其pH为7.5-7.7；稳定剂具有乳化的作用，增强生物表面活性剂的稳定性与均匀性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）其制备方法简单易行，成本低廉，安全环保，选用超声破碎仪破碎小球藻，其破壁效果较好，不会对活性物质造成影响，不会添加新的污染物质，有利于提高提取效率；2）从微藻中提取的生物表面活性剂，其表面张力、乳化活力、黏度等乳化指标较为稳定，同时生物表面活性剂具有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底等优点，对石油的降解能力较强，其降解指数可以达到73.68-91.56%，是一种安全高效的生物表面活性剂。
附图说明
图1是本发明一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，包括：浓缩液制备、发酵、酶液制备、配制，具体包括以下步骤：
浓缩液制备：取培养后的小球藻藻液1L，在4℃、5000r/min条件下离心15分钟，去掉所得上清液，留沉淀；将沉淀用缓冲液重悬浮，再于之前离心条件进行离心，重复4次；将藻液离心出的所有藻液进行合并，并用缓冲液稀释，终体积为220mL，于4℃温度下储存备用；选取溢油现场采集筛选出的小球藻进行培养，经浓缩后其活性、生物降粘、石油烃降解等性能均得到大幅度提高；
发酵：发酵培养基组成及其含量为：葡萄糖40g/L、玉米浆粉8g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 15.0g/L、(NH4)2SO4 1.70g/L、MgSO4·7H2O 2.5g/L、KCl 0.6g/L、KH2PO4 0.6g/L、CaCl20.12g/L，122℃条件下进行高压蒸汽灭菌30分钟，按照5.0%接种经培养后的小球藻，在温度为33℃、pH为7.2、搅拌速度为340r/min、通气量0.85vvm条件下发酵培养时间为96小时得发酵液；小球藻在充足的氮源、碳源、微量元素等必须物质条件下，小球藻能够迅速地恢复至活力巅峰的阶段，从而其脱氢酶、氧化酶、过氧化酶、石油降解酶、石化酶等有机降解相关酶加速分泌，为提取酶液、降解石油烃做准备；
酶液制备：将发酵液在4℃、5000r/min条件下离心15分钟，去掉所得上清液，留沉淀，将沉淀用缓冲液重悬浮后重复离心3次，合并沉淀；将沉淀溶于缓冲后用超声破碎仪破碎细胞，超声破碎仪功率为1.3kW，探头振幅为45%，温度为4℃，时间为48分钟；然后在4℃、12000r/min条件下离心20分钟，留上清液，沉淀部分用缓冲液进行重悬浮，重复离心操作5次，合并上清液，低温浓缩至220mL后于4℃保存备用；选用超声破碎仪破碎小球藻，其破壁效果较好，不会对活性物质造成影响，不会添加新的污染物质，有利于进一步的离心提取；
配制：将小球藻浓缩液与小球藻酶液，于4℃条件下按1:3.0的体积混合，混合液密封后，置于装有冰水的三角瓶中，在22℃、220r/min条件下振荡混合13分钟，以6:1的体积添加稳定剂，即得生物表面活性剂；从微藻中提取的生物表面活性剂，其表面张力、乳化活力、黏度等乳化指标较为稳定，同时生物表面活性剂具有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底等优点，对石油的降解能力较强，其降解指数可以达到73.68-91.56%，而且其制备方法简单易行，成本低廉，可以规模化应用于环境工程之中。
缓冲液为pH为7.8的Tris-HCl缓冲溶液。
稳定剂含量分别为，20%甘油、1.0mMEDTA与0.1mMDTT，其pH为7.7。
实施例2：
一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，包括以下步骤：
1）浓缩液制备：取培养后的小球藻藻液1L，在0℃、3500r/min条件下离心10分钟，去掉所得上清液，留沉淀；将沉淀用缓冲液重悬浮，缓冲液为pH为7.8的Tris-HCl缓冲溶液，再于之前离心条件进行离心，重复3次；将藻液离心出的所有藻液进行合并，并用缓冲液稀释，终体积为200mL，于0℃温度下储存备用；选取溢油现场采集筛选出的小球藻进行培养，经浓缩后其活性、生物降粘、石油烃降解等性能均得到大幅度提高；
2）发酵：按照3.5%接种经培养后的小球藻，在温度为30℃、pH为6.9、搅拌速度为320r/min、通气量0.65vvm条件下发酵培养时间为72小时得发酵液；小球藻在充足的氮源、碳源、微量元素等必须物质条件下，小球藻能够迅速地恢复至活力巅峰的阶段，从而其脱氢酶、氧化酶、过氧化酶、石油降解酶、石化酶等有机降解相关酶加速分泌，为提取酶液、降解石油烃做准备；
3）酶液制备：将发酵液在0℃、3500r/min条件下离心10分钟，去掉所得上清液，留沉淀，将沉淀用缓冲液重悬浮后重复离心2次，合并沉淀；将沉淀溶于缓冲后用超声破碎仪破碎细胞，超声破碎仪功率为1.0kW，探头振幅为38%，温度为2℃，时间为30分钟；然后在0℃、11500r/min条件下离心15分钟，留上清液，沉淀部分用缓冲液进行重悬浮，重复离心操作3次，合并上清液，低温浓缩至200mL后于0℃保存备用；选用超声破碎仪破碎小球藻，其破壁效果较好，不会对活性物质造成影响，不会添加新的污染物质，有利于进一步的离心提取；
4）配制：将小球藻浓缩液与小球藻酶液，于3℃条件下按1:0.5的体积混合，混合液密封后，置于装有冰水的三角瓶中，在20℃、200r/min条件下振荡混合10分钟，以5:1的体积添加稳定剂，即得生物表面活性剂，稳定剂含量分别为18%甘油、1.0mMEDTA、0.1mMDTT、0.5μM（1S，2S，5S）-2-羟基蒎烷-3-酮，pH为7.5；（1S，2S，5S）-2-羟基蒎烷-3-酮能够与二硫苏糖醇（DTT）之间发生氢键结合，从而可以在不影响DTT乳化稳定作用的条件下降低DTT的强还原性，维持生物表面活性剂混合物的稳定性质，延长其降解时效，提高降解效率，降低成本；从微藻中提取的生物表面活性剂，其表面张力、乳化活力、黏度等乳化指标较为稳定，同时生物表面活性剂具有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底等优点，对石油的降解能力较强，其降解指数可以达到73.68-91.56%，而且其制备方法简单易行，成本低廉，可以规模化应用于环境工程之中。
实施例1、实施例2中生物表面活性剂的表面张力、乳化活力指数、黏度以及油去除率测试结果如表1所示。
表1.实施例1、2中生物表面活性剂的理化指标
由表1可知，实施例2中的生物表面活性剂的表面张力、黏度更低，其乳化活力指数、油去除率更高，其油去除率可达91.56%，具有较高的石油降解特性。
实施例3：
实施例3与实施例1的区别仅在于，实施例3中小球藻浓缩液的Tris-HCl缓冲液pH值为7.0。
实施例4：
实施例4与实施例1的区别仅在于，实施例4中利用细胞破碎仪破碎细胞的时间为15分钟。
实施例5：
实施例5与实施例1的区别仅在于，实施例5中利用细胞破碎仪破碎细胞的时间为1h。
实施例6：
实施例6与实施例1的区别仅在于，实施例6中小球藻浓缩液与小球藻酶液的体积比为0.5∶1。
实施例7：
实施例7与实施例1的区别仅在于，实施例7中小球藻浓缩液与小球藻酶液的体积比为2∶1。
实施例8：
实施例8与实施例1的区别仅在于，实施例8中表面活性剂与稳定剂体积比为5:2。
实施例9：
实施例9与实施例1的区别仅在于，实施例9中中表面活性剂与稳定剂体积比为10:1。
实施例3-9中生物表面活性剂的表面张力、乳化活力指数、黏度以及油去除率测试结果如表2所示。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，包括以下步骤：
浓缩液制备：取培养后的小球藻藻液1L，离心10-15分钟，去掉所得上清液，留沉淀；将沉淀用缓冲液重悬浮，重复离心3-4次；将离心出的所有藻液进行合并，并用缓冲液稀释，终体积为200-220mL，于0-4℃温度下储存备用；所述缓冲液为pH为7.8-7.9的Tris-HCl缓冲溶液；
发酵：按照3.5-5.0%接种经培养后的小球藻，发酵72-96小时得发酵液；所述发酵过程中发酵温度为30-33℃、pH为6.9-7.2、搅拌速度为320-340r/min、通气量0.65-0.85vvm；
酶液制备：将发酵液在0-4℃、3500-5000r/min条件下离心10-15分钟，将沉淀用缓冲液重悬浮后重复离心2-3次，合并沉淀；将沉淀溶于缓冲液后用超声破碎仪破碎细胞，离心后留上清液，沉淀部分用缓冲液进行重悬浮，重复离心3-5次合并上清液，低温浓缩至200-220mL后于0-4℃保存备用；
配制：于3-4℃条件下，将小球藻浓缩液与小球藻酶液按1:0.5-3.0的体积混合，混合液密封后，置于装有冰水的三角瓶中，在20-22℃、200-220r/min条件下振荡混合10-13分钟，以5-6:1的体积添加稳定剂，即得生物表面活性剂；
所述酶液制备步骤中的超声破碎仪功率为1.0-1.3kW，探头振幅为38-45%，温度为2-4℃，时间为30-48分钟；
所述配置步骤中的稳定剂为18-23%甘油、1.0-1.5mM EDTA、0.1-0.13mM DTT以及0.5μM(1S,2S,5S)-2-羟基蒎烷-3-酮，其pH为7.5-7.7。
2.根据权利要求1所述的一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，其特征在于：所述浓缩液制备步骤中的离心温度为0-4℃，转速为3500-5000r/min。
3.根据权利要求1所述的一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，其特征在于：所述发酵步骤中的发酵培养基组成及其含量为：葡萄糖38-40g/L、玉米浆粉6-8g/L、蛋白胨4-5g/L、NaCl 12.5-15.0g/L、(NH4)2SO4 1.65-1.70g/L、MgSO4·7H2O 2.2-2.5g/L、KCl 0.5-0.6g/L、KH2PO4 0.5-0.6g/L、CaCl2 0.1-0.12g/L，121-122℃条件下进行高压蒸汽灭菌15-30分钟。
4.根据权利要求1所述的一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，其特征在于：所述酶液制备步骤中的离心温度为0-4℃，转速为11500-12000r/min，离心时间为15-20分钟。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008031092A3 (en) * | 2006-09-08 | 2008-06-05 | Univ Mississippi | Immunostimulatory composition comprising lipoprotein in microalgae extract |
| CN102942991A (zh) * | 2012-12-04 | 2013-02-27 | 深圳国能环保节能科技有限公司 | 一种微藻油脂提取方法 |
| CN103328620A (zh) * | 2010-11-08 | 2013-09-25 | 耐思特石油公司 | 一种从生物质中提取脂质的方法 |
| CN103468399A (zh) * | 2013-09-24 | 2013-12-25 | 北京化工大学 | 一种提取微生物油脂的方法 |
| CN104312720A (zh) * | 2014-11-11 | 2015-01-28 | 甘肃德福生物科技有限公司 | 一种提取小球藻中油脂的方法 |
| WO2016100681A1 (en) * | 2014-12-17 | 2016-06-23 | Solazyme, Inc. | Microalgal derived cleaners and surfactants |
-
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008031092A3 (en) * | 2006-09-08 | 2008-06-05 | Univ Mississippi | Immunostimulatory composition comprising lipoprotein in microalgae extract |
| CN103328620A (zh) * | 2010-11-08 | 2013-09-25 | 耐思特石油公司 | 一种从生物质中提取脂质的方法 |
| CN102942991A (zh) * | 2012-12-04 | 2013-02-27 | 深圳国能环保节能科技有限公司 | 一种微藻油脂提取方法 |
| CN103468399A (zh) * | 2013-09-24 | 2013-12-25 | 北京化工大学 | 一种提取微生物油脂的方法 |
| CN104312720A (zh) * | 2014-11-11 | 2015-01-28 | 甘肃德福生物科技有限公司 | 一种提取小球藻中油脂的方法 |
| WO2016100681A1 (en) * | 2014-12-17 | 2016-06-23 | Solazyme, Inc. | Microalgal derived cleaners and surfactants |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 三种海洋微藻对石油烃的降解技术研究;张玉荣等;《浙江海洋学院学报》;20170531;第36卷(第3期);第256页2.4节 * |
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