CN108025047B - 腺相关病毒介导的c1ei递送作为用于血管性水肿的疗法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种载体，其包含可操作地连接到编码人C1酯酶抑制剂或因子XII的核酸序列的启动子。本发明还涉及包含所述载体的组合物，以及使用所述载体以治疗或预防遗传性血管性水肿的方法。

Description

腺相关病毒介导的C1EI递送作为用于血管性水肿的疗法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2015年5月28日提交的美国临时专利申请号62/167,603、于2016年4月18日提交的美国临时专利申请号62/324,183，和于2016年5月27日提交的美国临时专利申请号15/167,729的权益，其通过引用并入本文。

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其全部内容通过引用并入本文的是与本文同时提交并且标识为如下的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：于2016年5月27日创建的名为“724068_ST25.TXT”的一个41,866字节ASCII(文本)文件。

发明背景

遗传性血管性水肿(HAE)是一种罕见且可能危及生命的遗传病症，其特征在于最经常影响上呼吸道和胃肠道的皮肤或粘膜组织的反复发作的肿胀(参见例如Banerji，AnnAllergy Asthma Immunol，111：329-336(2013)和Aygoren-Pursun等人，Orphanet J RareDis.，9：99(2014))。该疾病以常染色体显性遗传模式遗传，并影响1∶10,000至1∶50,000人。HAE(I型和II型)的潜在原因归因于位于11号染色体的C1酯酶抑制剂基因(C1EI基因或SERPING1基因)突变的常染色体显性遗传。HAE病例中有85％是I型，其中产生的C1酯酶抑制剂的量不足(参见例如Gower等人，World Allergy Organ J.，4：S9-S21(2011)；Cungo等人，Trends Mol Med，15：69-78(2009)；Gooptu等人，Annu Rev Biochem，78：147-176(2009)；和Zuraw等人，JAllergy ClinImmunolPract，1：458-467(2013))。其余病例的特征在于表达功能失调的C1酯酶抑制剂。

与HAE相关的发作的频率、持续时间和严重程度各不相同，其中30％患者报告大于一次发作/月的频率，40％报告6-11次发作/年，其余30％不常发生症状。通常，症状持续的时间较短，在12至36小时内发展，并在2至5天内消退；然而，一些发作可能会持续直至一周。尽管HAE发作是自限性的，但不可预见地出现发作会给患者带来相当大的压力，往往严重影响生活质量，并且可以致命。

迄今为止，治疗剂被指定用于长期预防、急性发作的治疗和短期预防(即在牙科手术之前)，并包括诸如以下的药剂：具有高副作用特征的达那唑、C1抑制剂替代蛋白、缓激肽受体拮抗剂、激肽释放酶抑制剂、新鲜冰冻血浆和纯化的C1抑制剂。这些疗法可以缓解症状并最大限度地提高生活质量；然而，疾病复发和长期持续施用的需求仍然是治疗的主要障碍(参见例如Aberer，Ann Med，44：523-529(2012)；Charignon等人，ExpertOpinPharmacother，13：2233-2247(2012)；Papadopoulou-Alataki，CurrOpin AllergyClinImmunol，10：20-25(2010)；Parikh等人，Curr Allergy Asthma Rep，11：300-308(2011)；Tourangeau等人，Curr Allergy Asthma Rep，11：345-351(2011)；Bowen等人，AnnAllergy Asthma Immunol，100：S30-S40(2008)；Frank，Immunol Allergy Clin North Am，26：653-668(2006)；Cicardi等人，J Allergy ClinImmunol，99：194-196(1997)；Kreuz等人，Transfusion 49：1987-1995(2009)；Bork等人，Ann Allergy Asthma Immunol，100：153-161(2008)；和Cicardi等人，JAllergy ClinImmunol，87：768-773(1991))。

因此，需要一种新的长效治疗方法来治疗与C1酯酶抑制剂缺陷相关的血管性水肿。本发明提供了这样的治疗方法以治疗血管性水肿。

发明概述

本发明提供了一种载体，其包含可操作地连接到编码人C1酯酶抑制剂(C1EI)的核酸序列或编码因子XII的核酸序列的启动子。本发明还提供了包含所述载体的组合物和使用所述载体治疗哺乳动物中血浆C1酯酶抑制剂缺陷，或治疗或预防其任何症状的方法。此外，本文提供了一种作为人类遗传性血管性水肿模型的重组小鼠，所述重组小鼠包含SERPING1的突变，与没有所述SERPING1突变的相同类型的小鼠相比，所述突变降低所述小鼠中的C1EI活性。

附图简述

本专利或申请文件含有至少一个彩色印刷的附图。经请求并支付必要的费用，专利局将提供本专利或专利申请具有彩色附图的公开副本。

图1是用于产生用SERPING1 E3靶标突变产生的C1EI缺陷的S63小鼠模型的方法的示意图。野生型和突变S63 DNA序列分别对应于SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

图2A是表明野生型和S63 SERPING1^+/-杂合小鼠中C1EI水平的图表。通过ELISA测量突变S63和野生型C1EI水平。

图2B是表明野生型和S63 SERPING1^+/-杂合小鼠中缓激肽水平的图表。通过ELISA测量突变S63和野生型缓激肽水平。

图3A是AAVrh.10hC1EI、AAV8hC1EI或AAV9hC1EI载体的示意图，其描述了AAV2反向末端重复序列(ITR)、衣壳化信号(ψ)、CMV增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、经优化的人C1EI(hC1EI)cDNA和兔β球蛋白多聚腺苷酸化信号。

图3B是Western印迹图像，其描述了HEV 293T细胞中由AAV-hC1EI质粒编码的hC1E1的表达。

图4A是表明向野生型C57B1/6白化小鼠(n＝5只/组)单次静脉内施用AAVrh.10hC1EI载体后人C1EI的长期表达的实验数据图表。

图4B、4C和4D是实验数据图表，其表明向C57B1/6白化(图4B)、C57B1/6(图4C)小鼠(n＝4-5只小鼠/组)或S63(图4D)小鼠单次静脉内施用10¹⁰gc AAVrh.10hC1EI、10¹¹gcAAVrh.10hC1EI、10¹¹AAVrh.10hα1AT(对照)后，人C1EI的剂量依赖性长期表达。

图5A、5B和5C是实验数据图表，其表明向C57B1/6小鼠(n：5只雄性/组，n＝5只雌性/组，施用PBS作为对照)单次静脉内施用10¹¹gc AAV8hC1EI(图5A)、AAV9hC1EI(图5B)或AAVrh.10hC1EI(图5C)后人C1EI的长期表达。

图5D是来自图5A-5C的合并数据的图表。

图6是实验数据图表，其表明在S63和对照野生型B6(Cg)-Tyr^c-2J/J小鼠(S63小鼠：n＝4只雄性/组，n＝4只雌性/组；B6(Cg)-Tyr^c-2J/J小鼠：n＝4只雄性/组，n＝4只雌性/组)中单次施用AAVrh.10hC1EI两周后人C1EI活性的变化。

图7A和7B描述了用AAVrh.10hC1EI处理S63 SERPING1^+/-小鼠的效果。在向S63SERPING1^+/-小鼠施用AAVrh.10hC1EI两周后，通过尾静脉注射施用伊文思蓝染料，并在30分钟后对小鼠拍照。图7A描述了S63杂合未处理的小鼠和S63杂合AAVrh.10hC1EI处理的小鼠的后爪中的蓝色染料(n＝4只雄性，n＝4只雌性)。图7B描述了S63杂合未处理的小鼠和S63杂合AAVrh.10hC1EI处理的小鼠的鼻中的蓝色染料(n--4只雄性，n＝4只雌性)。

图8A和8B描述了用AAVrh.10hC1EI处理S63 SERPING1^+/-小鼠的效果。在向S63SERPING1^+/-小鼠施用AAVrh.10hC1EI 6周后，通过尾静脉注射施用伊文思蓝染料，并在30分钟后对小鼠拍照。图8A描述了S63杂合未处理的小鼠和S63杂合AAVrh.10hC1EI处理小鼠的后爪中的蓝色染料(n＝4只雄性，n＝4只雌性)。图8B描述了S63杂合未处理的小鼠和S63杂合AAVrh.10hC1EI处理的小鼠的鼻中的蓝色染料(n＝4只雄性，n＝4只雌性)。

图9A-9F是SERPING1^+/-S63 AAVrh.10hC1EI处理的和AAVrh.10hC1EI未处理的小鼠(n＝5只/组)在后爪(图9A)、肾(图9B)、肠(图9C)、肺(图9D)、脾(图9E)和心脏(图9F)中的血管通透性应答的染料定量重量的实验结果图表。

图10是显示对SERPING1^+/-S63未处理的小鼠(n＝4只雌性，n＝4只雄性)和S63SERPING1^+/-AAVrh.10hC1EI处理的小鼠(n＝4只雌性，n＝4只雄性)的血管通透性应答的分光光度法分析的实验结果图。B6(Cg)-Tyr^c-2J/J野生型经处理的和未处理的小鼠作为对照(n＝2只雌性，n＝2只雄性)。

发明详述

本发明至少部分是基于载体能够安全地施用于人体并提供治疗性转基因的持续表达而预测得到的。本发明提供了一种载体，其包含可操作地连接到编码人C1酯酶抑制剂(C1EI)的核酸序列或编码因子XII的核酸序列的启动子、或基本由此组成、或由此组成。当本发明载体基本由可操作地连接到编码人C1EI的核酸序列或编码因子XII的核酸序列的启动子组成时，可以包含不会实质影响所述载体的另外的组分(例如，便于所述载体的体外操作的遗传元件，例如聚(A)序列或限制酶位点)。当本发明载体由可操作地连接到编码人C1EI的核酸序列或编码因子XII的核酸序列的启动子组成时，所述载体不包含任何另外的组分(即对所述载体而言不是内源性的，并且不是影响所述酸序列的表达从而提供所述蛋白所需的组分)。

本发明所述的载体可以包含本领域公知的任何基因转移载体，或基本由此组成、或由此组成。此类载体的实例包括腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和质粒。在一个优选的实施方式中，所述载体是AAV载体。

腺相关病毒是细小病毒科(Parvoviridae)的成员，并且包含少于约5,000个核苷酸的线性单链DNA基因组。为了有效复制，AAV需要与辅助病毒(即腺病毒或疱疹病毒)共同感染，或表达辅助基因。用于施用治疗性核酸的AAV载体通常有约96％的亲本基因组缺失，使得仅保留末端重复(ITR)，其中含有用于DNA复制和包装的识别信号。这消除了病毒基因表达所引起的免疫或毒副作用。另外，如果需要，将特异性AAV蛋白递送至生产细胞使得能够将包含AAV ITR的AAV载体整合至细胞基因组的特定区域中(参见例如美国专利6,342,390和6,821,511)。包含整合的AAV基因组的宿主细胞在细胞生长或形态学上未显示出变化(参见例如美国专利4,797,368)。

AAV ITR连接在非结构复制(Rep)蛋白和结构衣壳(Cap)蛋白(也称为病毒体蛋白(VP))的独特编码核苷酸序列的两侧。末端145个核苷酸是自身互补的，并且被组织成使得形成T形发夹的能量上稳定的分子内双链体可以形成。通过作为细胞DNA聚合酶复合物的引物，这些发夹结构起到病毒DNA复制起点的作用。Rep基因编码Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68自p5启动子转录，Rep52和Rep40自p19启动子转录。Rep78和Rep68蛋白是多功能DNA结合蛋白，在生产性复制期间执行解旋酶和切口酶的功能，从而为AAV末端解离提供条件(参见例如Im等人，Cell，61：447-57(1990))。这些蛋白质还调节来自内源性AAV启动子和辅助病毒内的启动子的转录(参见例如Pereira等人，J.Virol.，71：1079-1088(1997))。其它Rep蛋白修饰Rep78和Rep68的功能。帽基因编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。帽基因自p40启动子转录。

本发明的AAV载体可以使用本领域公知的任何AAV血清型来产生。已经从腺病毒贮备或者人或非人灵长类动物组织中分离了若干种AAV血清型和超过100种AAV变体(综述于例如Wu等人，Molecular Therapy，14(3)：316-327(2006))。通常，AAV血清型具有在核酸序列和氨基酸序列水平上显著同源的基因组序列，使得不同血清型具有一套相同的遗传功能，产生在物理和功能上基本等同的病毒颗粒，并通过基本完全相同的机制复制和组装。AAV血清型1-6和7-9被定义为“真”血清型，因为它们不与所有其它现有的且已表征的血清型的特异性中和血清有效地交叉反应。相反，AAV血清型6、10(也称为Rh10)和11被认为是“变体”血清型，因为它们不符合“真”血清型的定义。AAV血清型2(AAV2)由于其致病性的缺乏、广泛的感染性和建立长期转基因表达的能力而广泛用于基因治疗应用(参见例如Carter，B.J.，Hum.Gene Ther.，16：541-550(2005)；和Wu等人，同上)。各种AAV血清型的基因组序列及其比较公开于例如GenBank登录号U89790、J01901、AF043303和AF085716；Chiorini等人，J.Virol.，71：6823-33(1997)；Srivastava等人，J.Virol.，45：555-64(1983)；Chiorini等人，J.Virol.，73：1309-1319(1999)；Rutledge等人，J.Virol.，72：309-319(1998)；和Wu等人，J.Virol.，74：8635-47(2000))中。

AAV rep和ITR序列在大多数AAV血清型中特别保守。例如，据报道，AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4和AAV6的Rep78蛋白约89-93％相同(参见Bantel-Schaal等人，J.Virol.，73(2)：939-947(1999))。已报道AAV血清型2、3A、3B和6在基因组水平上具有约82％的总核苷酸序列同一性(Bantel-Schaal等人，同上)。此外，已知许多AAV血清型的rep序列和ITR在哺乳动物细胞中AAV颗粒的产生过程中有效地交叉补充(即功能上取代)来自其它血清型的相应序列。

通常，决定AAV颗粒的细胞嗜性的帽蛋白，以及相关的帽蛋白的编码序列，在不同AAV血清型之间的保守性显著低于Rep基因。鉴于Rep和ITR序列与其它血清型的相应序列交叉补充的能力，所述AAV载体可以包含血清型的混合物，从而成为“嵌合”或“假型”AAV载体。嵌合AAV载体通常包含源自两种或更多种(例如2、3、4种等)不同AAV血清型的AAV衣壳蛋白。相比之下，假型AAV载体包含一种AAV血清型的一个或多个ITR包装至另一种AAV血清型的衣壳之内。嵌合和假型AAV载体进一步记述于例如美国专利6,723,551；Flotte，Mol.Ther.，13(1)：1-2(2006)；Gao等人，J.Virol.，78：6381-6388(2004)；Gao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：11854-11859(2002)；De等人，Mol.Ther.，13：67-76(2006)；和Gao等人，Mol.Ther.，13：77-87(2006)中。

在一个实施方式中，使用感染人的AAV(例如AAV2)产生所述AAV载体。在一个优选的实施方式中，使用感染人的AAV产生的AAV载体是AAV8或AAV9。或者，使用感染非人灵长类，例如大猩猩(例如，黑猩猩)、旧大陆猴(例如，恒河猴)和新大陆猴(例如狨猴)的AAV产生所述AAV载体。优选地，使用用感染人的AAV构建的感染非人灵长类的AAV的假型病毒产生所述AAV载体。此类假型AAV载体的实例公开于例如Cearley等人，Molecular Therapy，13：528-537(2006)中。在一个实施方式中，可以产生包含衣壳蛋白的AAV载体，所述衣壳蛋白来自用AAV2反向末端重复(ITR)构建的感染恒河猴的AAV的假型病毒。在一个特别优选的实施方式中，本发明的AAV载体包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白来自感染恒河猴的AAV10(也称为“AAVrh.10”)用AAV2的ITR构建的假型病毒(参见例如Watanabe等人，Gene Ther.，17(8)：1042-1051(2010)；和Mao等人，Hum.Gene Therapy，22：1525-1535(2011))。

本发明的载体包含可操作地连接到编码人C1EI的核酸序列或编码因子XII的核酸序列的启动子。DNA区域在功能上彼此相关时是“可操作地连接”的。如果启动子控制编码序列的转录，则其“可操作地连接”到该序列。

“启动子”是启动特定基因转录的DNA区域。来自各种不同来源的大量启动子在本领域是众所周知的。启动子的代表性来源包括例如病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌，并且来自这些来源的合适的启动子容易获得，或者可以基于公众可获得的序列(例如来自诸如ATCC的保藏处以及其他商业或个人来源)而合成得到。启动子可以是单向的(即以一个方向启动转录)或双向的(即以3′或5′方向启动转录)。

本发明载体的启动子可以包含本领域公知的任何启动子、或基本由其组成，或由其组成。此类启动子类型的实例包括组成型活性启动子(例如人β-肌动蛋白、鸡β-肌动蛋白、巨细胞病毒(CMV)和SV40)、细胞类型特异性启动子(例如CD19基因启动子、CaMKIIa和UAS)或诱导型启动子(例如Tet***(美国专利5,464,758和5,814,618)、蜕皮激素诱导型***(No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，93：3346-3351(1996))、T-REX^TM***(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、Cre-ERT他莫昔芬诱导型重组酶***(Indra等人，Nuc.Acid.Res.，27：4324-4327(1999)；Nuc.Acid.Res.，28：e99(2000)；美国专利7,112,715；和Kramer&Fussenegger，Methods Mol.Biol.，308：123-144(2005))和LACSWITCH^TM***(Stratagene，加利福尼亚州圣地亚哥))。

在本发明的一个优选实施方式中，启动子是组成型活性启动子、诱导型启动子或细胞类型特异性启动子。在本发明的一个更优选实施方式中，启动子是组成型活性启动子，且优选地，所述组成型活性启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。

“核酸序列”旨在涵盖DNA或RNA的聚合物，即多核苷酸，其可以是单链或双链的，并且可以含有非天然的或改变的核苷酸。本文使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)的核苷酸聚合形式。这些术语是指分子的一级结构，因此包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。该术语包括作为等同物的由核苷酸类似物和经修饰多核苷酸(例如但不限于甲基化和/或封端的多核苷酸)制备的RNA或DNA的类似物。

可操作地连接到本发明载体的启动子的核酸序列可以包含编码治疗性基因的任何核酸序列，所述治疗性基因抑制或减少具有遗传性血管性水肿的哺乳动物中的粘膜下或皮下水肿。所述核酸序列优选编码人C1EI或因子XII。优选地，所述核酸序列编码全长人C1EI蛋白；然而，只要产生的蛋白维持全长蛋白的功能特征(例如对补体***的抑制)，则所述核酸序列也可编码变体(如截短型)。所述核酸序列还可以编码融合蛋白，其包含活性蛋白，例如人C1EI、因子XII，或抑制或减少具有遗传性血管性水肿的哺乳动物中的粘膜下或皮下水肿的任何治疗性基因，并且包含通常是蛋白质的第二部分，其改善活性蛋白的性质(例如功效、溶解性或半衰期)。所述第二部分的实例是本领域公知的，并且包括例如免疫球蛋白的Fc结构域和聚乙二醇(PEG)。

C1EI是以约21-40mg/kg的水平在血浆中循环的一种蛋白酶抑制剂。C1EI的主要功能之一是通过与经典补体途径的C1r和C1s蛋白酶结合并使其失活来抑制补体***以阻止自发活化。人C1EI包含500个氨基酸残基的高度糖基化的单链多肽，并通常由肝细胞、成纤维细胞、单核细胞和内皮细胞所产生。人C1EI由位于11号染色体上的11q11-q13.1处的SERPING1基因编码。染色体11q11-q13.1长约1.5千碱基，包含8个编码外显子。人C1EI的氨基酸序列和核酸序列以及人C1EI的功能变体在本领域中是众所周知的。C1EI蛋白的氨基酸序列和编码C1E1蛋白的核苷酸序列的实例可见于例如GenBank登记号：AAM21515.1(氨基酸)(SEQ ID NO：1)和AF435921.1(核酸)(SEQ ID NO：2)。

因子XII是在血浆中循环并与III型遗传性血管性水肿有关的一种凝血因子。因子XII通过与凝血因子XI相互作用而在凝血级联中起作用，并且还在刺激炎症中发挥作用。因子XII由F12基因编码。因子XII的氨基酸序列和核酸序列以及因子XII的功能变体在本领域中是众所周知的，并且可见于例如GenBank登记号：AAB59490.1(氨基酸)(SEQ ID NO：3)和M11723.1(核酸)(SEQ D NO：4)。

编码人C1EI或因子XII的核酸序列可以使用本领域公知的方法产生。例如，可以使用标准重组DNA方法学重组产生核酸序列、多肽和蛋白质(参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，冷泉巷出版社，纽约冷泉巷，2001；以及Ausube1等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates and John Wiley&Sons，纽约，1994)。此外，编码人C1EI或因子XII的合成产生的核酸序列可从如细菌、昆虫或哺乳动物(例如大鼠、人等)的来源分离和/或纯化。分离和纯化的方法在本领域中是众所周知的。或者，本文所述的核酸序列可以商业合成。在这方面，核酸序列可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。可以进一步优化序列(例如SEQID NO：1-4)以增加mRNA稳定性并减少突变mRNA的反式抑制的可能性。

除了可操作地连接到编码人C1EI或因子XII的核酸序列的启动子外，所述载体优选包含另外的表达控制序列，例如增强子、多聚腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等，其为所述核酸序列在宿主细胞中的表达提供基础。示例性的表达控制序列是本领域已知的，并且记述于例如Goedde1，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology，Vol.185，Academic Press，加利福尼亚州圣地亚哥(1990)。

本文使用的术语“增强子”是指增加例如与其可操作地连接的核酸序列的转录的DNA序列。增强子可以位于距核酸序列的编码区数千个碱基处，并且可以介导调节因子的结合、DNA甲基化的模式或DNA结构的变化。来自各种不同来源的大量增强子是本领域所众所周知的，并且可以作为克隆的多核苷酸(例如来自诸如ATCC的保藏处以及其它商业或个体来源)获得或在克隆的多核苷酸内获得。许多包含启动子(如常用的CMV启动子)的多核苷酸也包含增强子序列。增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游。编码人C1EI或因子XII的核酸序列可以可操作地连接到CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(也称为“CAG启动子”)(参见例如Niwa等人，Gene，108：193-199(1991)；Daly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96：2296-2300(1999)；和Sondhi等人，Mol.Ther.，15：481-491(2007))。

本发明提供了包含上述载体和药学上可接受的(例如生理学上可接受的)运载体的组合物、或基本由其组成或由其组成的组合物。当组合物基本由本发明的载体和药学上可接受的运载体组成时，可以包含不会实质上影响所述组合物的另外的组分(例如，佐剂、缓冲剂、稳定剂、抗炎剂、增溶剂、防腐剂等)。当组合物由本发明的载体和药学上可接受的运载体组成时，组合物不包含任何另外的组分。在本发明的背景内可以使用任何合适的运载体，并且此类运载体在本领域中是众所周知的。运载体的选择将部分地由所述组合物可施用于的特定位点和用于施用所述组合物的具体方法来确定。除了本文所述的载体的例外情况，任选地，所述组合物可以是无菌的。可以将所述组合物冷冻或冻干以便储存，并在使用之前在合适的无菌运载体中重构。所述组合物可根据例如Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA(2001)中所述的常规技术来产生。

适用于所述组合物的制剂包括水性和非水性溶液、等渗无菌溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂，以及水性和非水性无菌悬液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以以存在于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中，并且可以贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在即用前加入无菌液体运载体(例如水)。即时溶液和悬液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。优选地，所述运载体是缓冲盐溶液。更优选地，将本发明的载体在组合物中施用，所述组合物经配制以保护本发明的载体在施用之前免受损害。例如，所述组合物可以经配制以减少所述载体在用于制备、存储或施用所述载体的装置(例如玻璃器皿、注射器或针)上的损失。所述组合物可以经配制以降低所述载体的光敏感性和/或温度敏感性。为此，所述组合物优选包含药学上可接受的液体运载体，例如上述的运载体，以及稳定剂，所述稳定剂选自由聚山梨醇酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及其组合组成的组。使用这样的组合物将延长所述载体的保质期、促进所述载体的施用、并增加本发明方法的效率。含有载体的组合物的配制进一步记述于例如Wright等人，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.，6(2)：174-178(2003)和Wright等人，Molecular Therapy，12：171-178(2005)中。

组合物还可以经配制以增强转导效率。此外，本领域普通技术人员将会理解，本发明的载体可以与其它治疗剂或生物活性剂一起存在于组合物中。例如，控制炎症的因子(例如布洛芬或类固醇)可以是组合物的一部分，以减少与体内施用载体相关的肿胀和炎症。可存在抗微生物剂，即杀微生物剂和杀真菌剂，以治疗现有感染和/或降低未来感染的风险，如与转基因程序相关的感染。

本发明提供了抑制或减少具有遗传性血管性水肿的哺乳动物中的粘膜下或皮下水肿的方法，或者预防或治疗哺乳动物中遗传性血管性水肿的方法，其包括向所述哺乳动物施用本发明的载体，由此表达核酸以产生抑制或减少粘膜下或皮下水肿，或者预防或治疗遗传性血管性水肿的蛋白质。在一个优选的实施方式中，所述哺乳动物是人。

预防或治疗遗传性血管性水肿涵盖由遗传性血管性水肿引起的任何生理反应或症状的任何程度的改善。抑制或减少粘膜下或皮下水肿涵盖粘膜下或皮下水肿的任何程度的改善。

可以使用任何施用途径将所述组合物递送至所述哺乳动物。事实上，尽管一种以上的途径可以用于施用所述组合物，但是某种特定的途径可以提供比另一种途径更直接且更有效的反应。优选地，所述组合物经由肌内注射施用。也可以将一剂组合物施用或输入到体腔中、通过皮肤吸收(例如经由透皮贴剂)、吸入、摄入、局部施用于组织、或肠胃外施用，例如经由静脉内、腹膜内、口内、皮内、皮下或动脉内施用。

所述组合物可以在允许受控或持续释放的装置中或在其上施用，如海绵、生物相容性网状物、机械储库或机械植入物。植入物(例如参见美国专利5,443,505)、装置(参见例如美国专利4,863,457)，如可植入装置，例如机械储库或植入物或由聚合组合物组成的装置，尤其有助于AAV载体的施用。所述组合物还可以以持续释放的制剂的形式施用(参见例如美国专利5,378,475)，其包含例如凝胶泡沫、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、聚磷酸酯(如对苯二甲酸双-2-羟乙酯(BHET))，和/或聚乳酸-乙醇酸。

施用于哺乳动物的组合物中的载体剂量将取决于许多因素，包括哺乳动物的大小(质量)、任何副作用的程度、特定的施用途径等。优选地，本发明的方法包括施用“治疗有效量”的本文所述包含本发明载体的组合物。“治疗有效量”是指以必要的剂量且在必要的时间段内有效实现所需的治疗结果的量。治疗有效量可以根据诸如个体的过敏原敏感程度、年龄、性别和体重以及载体在个体中引起所需的反应的能力等因素而变化。

在另一个实施方式中，本发明的方法可以包括施用“预防有效量”的包含本发明载体的组合物。“预防有效量”是指以必要的剂量且在必要的时间段内有效实现所需的预防结果(例如，对免疫应答或过敏反应的预防)的量。需要预防性施用的受试者可以通过本领域公知的常规测试容易地确定。另外，之前曾有过遗传性血管性水肿发作的受试者可以针对以后的发作预防性地治疗。

在本发明的一个优选实施方式中，所述组合物向所述哺乳动物施用一次。据信，单次施用所述组合物将导致人C1EI以最小的副作用在哺乳动物中持续表达。然而，在某些情况下，可能适宜在治疗性或预防性治疗期间多次施用所述物和/或采用多种施用途径(例如肌内和皮下)，以确保细胞充分暴露于所述组合物。例如，所述组合物可以在治疗性或预防性治疗期间向哺乳动物施用两次或更多次(例如2、3、4、5、6、6、8、9或10次，或更多次)。

达到特定的治疗或预防效果(即减少或抑制过敏反应)所需的组合物中，载体的剂量通常以载体基因组拷贝/细胞(gc/细胞)或载体基因组拷贝/每千克体重(gc/kg)的单位施用。基于这些和本领域公知的其他因素，本领域普通技术人员可以容易地确定合适的载体剂量范围以治疗具有特定免疫应答的患者。

以下实施例进一步说明本发明，但是当然不应将其解释为以任意方式限制其范围。

实施例1

本实施例展示了遗传性血管性水肿的C1EI缺陷型小鼠模型的发展和表征。

使用靶向SERPING1的3号外显子(E3)的成簇的规律间隔短回文重复(CRISPR)和CRISPR相关的核酸内切酶9(Cas9)技术来开发C1EI缺陷型小鼠模型。当提供了靶向所需序列的合成单引导RNA(sgRNA)时，引导Cas9核酸内切酶产生位点特异性DNA双链断裂(DSB)。在哺乳动物细胞中，由Cas9剪切产生的DSB通过细胞非同源末端连接(NHEJ)修复途径来修复，其在基因中引入***/缺失突变(InDels)，这继而引起移码，导致无效的等位基因。我们利用这项技术在小鼠SERPING1基因中引入了靶标无效突变。

将来自CBA/J x B6/J小鼠的F1合子与靶向SERPING1的3号外显子的功能性单引导RNA和Cas9 mRNA共注射。在2细胞阶段将胚胎植入***母体，并且通过基于T7核酸内切酶I的PCR分析，针对是否存在SERPING1 3号外显子***/缺失，对所有幼仔进行筛选。选择3号外显子中具有InDel的小鼠用于繁育和进一步的DNA测序。成对(一只雌性与一只雄性)或三只一组(两只雌性与一只雄性)繁育小鼠；采用B6(Cg)-Tyr^c-2J/J小鼠(B6白化小鼠，JacksonLaboratory，缅因州巴尔港)。所有小鼠被安置在微型隔离笼中并依照标准指南维持。

通过T7核酸内切酶I消化，对所有第一代幼仔进行针对3号外显子突变的筛选。简言之，从尾部组织(0.5cm，尾尖)提取小鼠基因组DNA，并使用在突变靶区域两侧的引物(正向引物5’-TTGCACGGCGGTCACTGGACACAGATAACT-3’(SEQ ID NO：7)；反向引物5′-5’-CAAGCGGCTCCGGGCAGAAAGGGTTCA-3’(SEQ ID NO：8))通过PCR扩增3号外显子。然后在高温下将PCR产物变性，重新退火以形成DNA双链体，并使用剪切错配DNA双链体(异源双链体)的T7核酸内切酶I(T7E-I)消化。通过T7EI消化携带异源双链体的突变，得到两个或更多个较小的DNA片段，其可以通过琼脂糖凝胶电泳来解析。

选择在3号外显子中携带突变的创始杂合子小鼠用于基因组DNA测序。从在异氟烷气体下麻醉的SERPING1敲除小鼠获得尾尖组织(0.5cm)，并使用KAPA Express ExtractDNA提取试剂盒(KAPA Biosytems；马萨诸塞州威尔明顿)提取基因组DNA(gDNA)。使用在SERPING1基因的靶标3号外显子区域两侧的特异性引物(正向引物，5’-TTGCACGGCGGTCACTGGACACAGATAACT-3’(SEQ ID NO：7)；反向引物，5’-CAAGCGGCTCCGGGCAGAAAGGGTTCA-3’(SEQ ID NO：8))扩增基因组DNA。用Taq聚合酶和由KAPA2 Fast(HotStart)基因分型混合物(KAPA Biosytems；马萨诸塞州威尔明顿)提供的试剂进行PCR扩增。每次变性(95℃，30秒)、退火(60℃，30秒)和延伸(72℃，30秒)的循环重复35次。使用QIAGEN PCR纯化试剂盒(QIAGEN；加利福尼亚州瓦伦西亚)纯化所得的PCR产物，将DNA在50μl缓冲EB中洗脱，并克隆到TOPO载体(Life Technologies，康涅狄格州诺瓦克)中，用于DNA测序。通过Sanger技术对每个突变体的多个TOPO克隆进行测序，以识别由CRISPR/Cas9引导的NHEJ DNA修复***所引入的突变。

使用这种技术，我们已经生成了许多在SERPING1基因的3号外显子中具有不同遗传变异的小鼠(图1)。这些小鼠中的一种(称为“S63”)已被详细表征，并被用作遗传性血管性水肿的模型，用于证明AAVrh.10hC1EI疗法的功效。S63小鼠在出生时表现正常，随后正常发育并繁衍。

根据制造商的说明，通过ELISA(Biomatik，特拉华州威尔明顿)在S63小鼠血清中评估小鼠C1EI(mC1EI)水平。根据制造商的说明，通过ELISA(MyBioSource，加利福尼亚州圣地亚哥)在S63小鼠血清中评估小鼠缓激肽水平。通过显色活性实验，测量蛋白质抑制其天然底物C1酯酶(

C1-INH[CE]，DiaPharma Group，俄亥俄州西切斯特)的能力，以评估人C1EI(hC1EI)活性水平。简言之，该实验基于C1酯酶活性的抑制。底物C1-1(C2H5CO-lys(ε-Cbo)-Gly-Arg-pNA)的C1酯酶剪切释放发色团对硝基苯胺(pNA)。在OD405nm处测量释放的pNA的吸光度，并且与存在于血清或血浆中的C1酯酶抑制剂的浓度(活性)成反比。活性实验按照制造商的方案进行，结果以功能单位(U/mL)表示。所有分析均重复进行。将伊文思蓝染料(在100μl磷酸盐缓冲盐水中，30mg/kg；Sigma Chemical Co.，密苏里州圣路易斯)注射到6-8周龄小鼠的尾静脉中。注射伊文思蓝染料30分钟后拍摄后后爪和鼻的照片。在通过CO2吸入将小鼠安乐死后，移除爪子，吸干并称重。在55℃下用1ml甲酰胺提取伊文思蓝染料(等重量)过夜，并在600nm下用分光光度法测量。

来自这些研究的结果表明，S63小鼠中的C1EI水平显著低于野生型对照中的C1EI水平(图2A)，并且与野生型对照相比，S63小鼠中的缓激肽水平升高(图2B)。这表明S63小鼠模型提供了遗传性血管性水肿的体内动物模型。

实施例2

本实施例展示了包含可操作地连接到编码人C1EI的核酸序列的启动子的AAV载体的设计和体外表征。

表达盒的组成为：AAV2反向末端重复(ITR)、衣壳化信号(ψ)、可操作地连接到人C1EI cDNA序列的巨细胞病毒(CMV)增强子鸡β肌动蛋白启动子(CAG启动子)和兔β球蛋白多聚腺苷酸化信号(图3A)。对hC1EI cDNA序列进行优化以增加mRNA稳定性并降低突变mRNA的反式抑制的可能性。使用人偏向密码子对hC1EI cDNA进行序列优化，并且去除：mRNA不稳定元件；低(＜30％)或富(＞80％)GC区；编码区内的翻译起始序列；和潜在的剪接信号。合成具有最佳Kozak共有序列的经优化的hC1EI cDNA。

合成经优化的全长人C1EI cDNA序列，并将其克隆到CAG启动子控制下的pAAV质粒中。AAV-hC1EI质粒的产生是通过在人胚肾293T细胞中(HEK293T；美国模式培养物保藏所)共转染入pAAV质粒以及一质粒，其携带有：载体复制所需的来源于AAV2的AAV Rep蛋白、AAVrh.10病毒结构(Cap)蛋白VP1、2和3，其定义所产生的AAV载体的血清型；以及E2、E4和VARNA的腺病毒辅助功能。通过碘克沙醇梯度和QHP阴离子交换层析纯化AAV-hC1EI载体(称为“AAVrh.10hC1EI”)。通过定量TaqMan实时PCR分析确定载体基因组滴度。将编码无关蛋白AAV-GFP的载体用作表达研究的对照。

为评估AAVR.10hC1EI引导的人C1EI蛋白的体外表达，用AAV-hC1EI质粒或对照质粒转染HEK 293T细胞，72小时后收获上清液。通过考马斯蓝染色SDS-PAGE和Western分析，采用过氧化物酶缀合的山羊抗人κ轻链抗体和过氧化物酶缀合的抗人C1EI抗体，评估人C1EI在上清液中的表达。如图3B所示，在细胞培养上清液中检测到人C1EI。该实施例的结果显示出来自AAV载体的C1EI表达。

实施例3

本实施例展示了野生型小鼠中AAVrh.10hC1EI的长期体内表达。

为评估用AAVrh.10hC1EI载体处理后的人C1EI的长期体内血清表达，6-8周龄的C57B1/6白化、C57B1/6或SERPING+/-S63雄性和雌性小鼠通过100μl体积静脉注射接受单次施用的10¹⁰或10¹¹基因组拷贝(gc)的AAVrh.10hC1EI载体、对照AAVrh.10hα1AT载体或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在0时和多个时间点评估小鼠中来自尾静脉的血液，直至第20周。使血样在23℃下凝结1小时，然后以13,000RPM离心10分钟以收集血清。在每个样品中分析人C1EI的活性。

为评估用AAV8hC1EI载体、AAV9hC1EI载体或AAVrh.10hC1EI载体处理后的人C1EI的长期体内血清表达，6-8周龄的C57B1/6雄性和雌性野生型小鼠通过100μl体积静脉注射接受10¹¹基因组拷贝(gc)的AAV8hC1EI载体、AAV9hC1EI载体、AAVrh.10hC1EI载体或磷酸盐缓冲盐水(PBS)的单次施用。在0时和多个时间点评估小鼠中来自尾静脉的血液，直至第6周。使血样在23℃下凝结1小时，然后以13,000RPM离心10分钟以收集血清。在每个样品中分析人C1EI的活性。

如图4A中所示，在实验持续期间(20周)证实了人C1EI的表达，并且hC1EI在载体施用后20周时的活性水平大于临床阈值(n＝5只雄性/组；n＝5只雌性/组)。此外，如图4B和4C中所示，在实验持续期时(图4B为12周，图4C为24周)证实了人C1EI的剂量依赖性表达，并且在用10¹¹或10¹⁰gc AAVrh.10hC1EI处理的雄性和用10¹¹gc AAVrh.10hC1EI处理的雌性中，在各自实验持续期间的hC1EI的活性水平大于临床阈值(n＝5只雄性/组；n＝5只雌性/组)。如图4D中所示，在实验持续期间(6周)证实了人C1EI的表达，并且hC1EI在载体施用后6周时的活性水平大于临床阈值(AAVrh.10hC1EI处理组n＝3只小鼠/组；无治疗(PBS对照)组n＝3只雄性和1只雌性)。

如图5A-5C中所示，在实验持续期间(6周)证实了人C1EI的表达，并且hC1EI在AAV8hC1EI、AAV9hC1EI或AAVrh.10hC1EI载体施用后6周时的活性水平大于临床阈值(n＝5只雄性/组；n＝5只雌性/组)。此外，如图5D中所示，对于每种测试载体，人C1EI的活性是相似的。

这些数据证实，AAV8hC1EI、AAV9hC1EI和AAVrh.10hC1EI载体中的每一种都可以由单次施用提供长期的人C1EI表达。

实施例4

本实施例通过在遗传性血管性水肿的小鼠模型中施用AAVrh.10hC1EI证实了遗传性血管性水肿的治疗。

为评估AAVrh.10hC1EI引导的hC1EI蛋白的体内表达，以10¹¹基因组拷贝(gc)向6-8周龄的S63(SERPING1^+/-)小鼠施用一次剂量的AAVrh.10hC1EI。静脉注射100μl体积。载体施用后2周时评估来自尾静脉的血液(100μl)。使血样在23℃下凝结1小时，然后以13,000RPM离心10分钟以收集血清。在n＝4只雄性和n＝4只雌性中在2周时测量hC1EI的活性。载体处理的(AAVrh.10hC1EI，10¹¹gc下)和未处理的野生型B6(Cg)-Tyr^c-2J/J(Jackson Labs)小鼠，n＝4只雄性和n＝4只雌性小鼠作为对照。在载体施用后2周和6周时，通过尾静脉注射给予小鼠伊文思蓝染料(30mg/kg，在100μl磷酸盐缓冲盐水中)。注射伊文思蓝染料30分钟后拍摄鼻和后爪的照片。在通过CO₂吸入将小鼠安乐死后，移除后爪，吸干并称重。在55℃下用1ml甲酰胺自相等重量的后爪、肾、肠、肺、脾和心脏提取伊文思蓝染料过夜，并在600nm下用分光光度法测量。载体处理的(AAVrh.10hC1EI，10¹¹gc下)和未处理的B6(Cg)-Tyrc-2J/J(Jackson Labs)小鼠作为对照。

来自这些研究的结果表明，AAVrh.10hC1EI基因转移后2周的hC1EI活性大于正常临床阈值。在B6(Cg)-Tyr^c-2J/J对照小鼠中观察到相同水平的hC1EI活性。在未处理的小鼠血清中未检测到人C1EI活性(图6)。与野生型小鼠相比，未处理的S63雄性和雌性小鼠具有显著增加的血管通透性。在伊文思蓝染料注射后几分钟内观察到鼻和后爪的蓝色着色，并且在载体施用后2周时，S63小鼠中的着色强度远大于野生型小鼠中的着色强度(图7A和7B)。类似地，在伊文思蓝染料注射后几分钟内观察到鼻和后爪的蓝色着色，并且在载体施用后6周时，S63小鼠中的着色强度远大于野生型小鼠中的着色强度(图8A和8B)。与AAVrh.10hC1EI处理组相比，未处理的S63小鼠在视觉上表现出其后爪和鼻中更大的染料外渗。染料外渗在B6(Cg)-Tyr^c-2J/J野生型经处理的和未处理的小鼠中是相当的。经处理的和未处理的S63 SERPING1杂合小鼠的定量渗漏表型通过测量主要器官中的染料外渗来确定(图9A-9F)。通过自后爪提取的染料的分光光度分析验证观察到的表型(图10)。经处理的小鼠相比其未处理的同窝小鼠具有显著(p＜0.001雄性，p＜0.008雌性)更低的染料外渗水平。这些结果表明用AAVrh.10hC1EI载体治疗遗传性血管性水肿导致了遗传性血管性水肿症状的显著减少。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，在此通过引用并入，其程度如同单独且明确地指出各参考文献通过引用并入，并且其全部内容示于本文。

在描述本发明的背景下(特别是在以下权利要求的背景下)使用的术语“一”、“一个”、“该”和“至少一个”以及类似的指示词语应被解释为涵盖单数和复数两种情况，除非在本文中另有指示或明显与上下文矛盾。使用在术语“至少一个”后面列出一个或多个项目(例如，“A和B中的至少一个”)应理解为表示选自所列项目中的一个项目(A或B)，或所列项目中的两个或更多个的任意组合(A和B)，除非在本文中另有指示或明显与上下文矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放式术语(即表示“包括但不限于”)，除非另有说明。除非在本文中另有指示，本文中数值范围的记载仅旨在用作单独提及落在该范围内的各独立值的速记方法，并且各独立值并入本说明书中，如同其单独记载于本文中。本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非在本文中另有指示或在其它方面明显与上下文矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的任何语言不应被解释为指示任何未被要求保护的要素对于本发明的实践是必需的。

本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。在阅读了前面的描述之后，那些优选的实施方式的变化对于本领域的普通技术人员而言可以是显而易见的。本发明人预期技术人员适当地采用这种变化，并且本发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括所附权利要求书中记载的主题在适用法律所允许范围内的所有修改和等同物。此外，除非在本文中另有指示或者明显与上下文矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变化中的任何组合。

序列表

<110> 康奈尔大学

<120> 腺相关病毒介导的C1EI递送作为用于血管性水肿的疗法

<130> 724068

<150> 62/324,183

<151> 2016-04-18

<150> 62/167,603

<151> 2015-05-28

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的AAM21515.1 (C1EI AA序列)

<400> 1

Met Ala Ser Arg Leu Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Arg Ala Ser Ser Asn Pro Asn Ala Thr Ser Ser Ser Ser Gln

20 25 30

Asp Pro Glu Ser Leu Gln Asp Arg Gly Glu Gly Lys Val Ala Thr Thr

35 40 45

Val Ile Ser Lys Met Leu Phe Val Glu Pro Ile Leu Glu Val Ser Ser

50 55 60

Leu Pro Thr Thr Asn Ser Thr Thr Asn Ser Ala Thr Lys Ile Thr Ala

65 70 75 80

Asn Thr Thr Asp Glu Pro Thr Thr Gln Pro Thr Thr Glu Pro Thr Thr

85 90 95

Gln Pro Thr Ile Gln Pro Thr Gln Pro Thr Thr Gln Leu Pro Thr Asp

100 105 110

Ser Pro Thr Gln Pro Thr Thr Gly Ser Phe Cys Pro Gly Pro Val Thr

115 120 125

Leu Cys Ser Asp Leu Glu Ser His Ser Thr Glu Ala Val Leu Gly Asp

130 135 140

Ala Leu Val Asp Phe Ser Leu Lys Leu Tyr His Ala Phe Ser Ala Met

145 150 155 160

Lys Lys Val Glu Thr Asn Met Ala Phe Ser Pro Phe Ser Ile Ala Ser

165 170 175

Leu Leu Thr Gln Val Leu Leu Gly Ala Gly Glu Asn Thr Lys Thr Asn

180 185 190

Leu Glu Ser Ile Leu Ser Tyr Pro Lys Asp Phe Thr Cys Val His Gln

195 200 205

Ala Leu Lys Gly Phe Thr Thr Lys Gly Val Thr Ser Val Ser Gln Ile

210 215 220

Phe His Ser Pro Asp Leu Ala Ile Arg Asp Thr Phe Val Asn Ala Ser

225 230 235 240

Arg Thr Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Arg Val Leu Ser Asn Asn Ser Asp

245 250 255

Ala Asn Leu Glu Leu Ile Asn Thr Trp Val Ala Lys Asn Thr Asn Asn

260 265 270

Lys Ile Ser Arg Leu Leu Asp Ser Leu Pro Ser Asp Thr Arg Leu Val

275 280 285

Leu Leu Asn Ala Ile Tyr Leu Ser Ala Lys Trp Lys Thr Thr Phe Asp

290 295 300

Pro Lys Lys Thr Arg Met Glu Pro Phe His Phe Lys Asn Ser Val Ile

305 310 315 320

Lys Val Pro Met Met Asn Ser Lys Lys Tyr Pro Val Ala His Phe Ile

325 330 335

Asp Gln Thr Leu Lys Ala Lys Val Gly Gln Leu Gln Leu Ser His Asn

340 345 350

Leu Ser Leu Val Ile Leu Val Pro Gln Asn Leu Lys His Arg Leu Glu

355 360 365

Asp Met Glu Gln Ala Leu Ser Pro Ser Val Phe Lys Ala Ile Met Glu

370 375 380

Lys Leu Glu Met Ser Lys Phe Gln Pro Thr Leu Leu Thr Leu Pro Arg

385 390 395 400

Ile Lys Val Thr Thr Ser Gln Asp Met Leu Ser Ile Met Glu Lys Leu

405 410 415

Glu Phe Phe Asp Phe Ser Tyr Asp Leu Asn Leu Cys Gly Leu Thr Glu

420 425 430

Asp Pro Asp Leu Gln Val Ser Ala Met Gln His Gln Thr Val Leu Glu

435 440 445

Leu Thr Glu Thr Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ile Ser Val

450 455 460

Ala Arg Thr Leu Leu Val Phe Glu Val Gln Gln Pro Phe Leu Phe Val

465 470 475 480

Leu Trp Asp Gln Gln His Lys Phe Pro Val Phe Met Gly Arg Val Tyr

485 490 495

Asp Pro Arg Ala

500

<210> 2

<211> 22243

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的AF435921.1 (C1EI核苷酸序列)

<400> 2

gcccagatgg cctccaggct gaccctgctg accctcctgc tgctgctgct ggctggggta 60

tgtggtccct tgtgggatgg gggacggggg tggagacggg aggcgggatg gtgcggggtg 120

cgggcggtgg ctgaggatta acccttcagg ctccggggaa tgaggagagc tcctcttggg 180

atcattgagt gtgatccttg cacacgcact cgtagatggt ggaaagagct caggactcag 240

acagatgcaa gttctaatct tggcgggcca tgtaggagct gcgcagcgtg gtcctgagga 300

cgtcactttt ctcagcctac tcctcctgat ttataaaatg ttgaataaac agatcccacc 360

ctgtccacca agcaggcttg gcaggaggat cacatagggc aaggagatgg gaagcatttt 420

gtgatatcaa agcaagagtt tgttgtagaa aagagctgtg gggaggagag gtttggctgc 480

tgtgacacag acggtggtcc caggctaggg cctgtgaaga cagggaagaa tggtagcaaa 540

catacgtggg tctgggtggg ggtcaatagc agtgagaggt cccagtggtc tgggaggtca 600

tggactagaa ataaggctaa gaagtgcagg atcccaggag aaaggtaggt aggggtgtgt 660

gtatgtgcgt gtgtgtgtgt gtgcacgcgc aagttggtat cacatactca gcagatgatg 720

tagttatgag cagggagttt ggaatcagag accttgtttt gacccctagc tgtttctccc 780

atttctgtga gaccctggac tagttaatat gtgtcggtat gagtttctct acctgtgaaa 840

tggagctaat gcgtggtttc tcagtggagg atctgttgac attggggctg gataattcat 900

tgctgagggg ctaccctgcg cattttagga tgttttgcag tatatctcta gcctctacgc 960

actagattcc ggtagcatct tccctgctgt ctccctgtga caaccaaaaa tgtctctgga 1020

cattgccaaa tatcccctgg gagtcaaaat tgtttcagag ccgctggcct atactacttc 1080

tctctccctc ccttcctgcc tcccttcttt cctccttccc tttcttcgtt cccttcctaa 1140

tgtgtactgt ttttccacac ccactaatgg gttgcaaccc acagtttaaa aatttactgt 1200

tctaaatcaa ggagcacaag ttcaaatgtc tgtactagcc aagcaagtga gtcaaacagg 1260

tagatattta caggaaattg caagaacata gataaatgac aacactcagc ttcactgttt 1320

ggaaaacaac ttcctacagg gcagtaattg gtcagagatt acagagtccc tgactatccc 1380

tcatcttctg cagagcacat tcctgtgcac ccccaccctc accctgtatt gccccttctc 1440

tgaggaatta gtggtggtgg ttctaagaca gattgctcat ctgccgcact gtcagaaatt 1500

actctcttgt acaggacatt ttccacatcc acaccttctc ttcctgcttt gagtatttta 1560

gaggactgtg cctcgtagta agaaaaaaat gaaactcagt ttcttgaacc acaggataga 1620

gcctcctcaa atccaaatgc taccagctcc agctcccagg atccagagag tttgcaagac 1680

agaggcgaag ggaaggtcgc aacaacagtt atctccaaga tgctattcgt tgaacccatc 1740

ctggaggttt ccagcttgcc gacaaccaac tcaacaacca attcagccac caaaataaca 1800

gctaatacca ctgatgaacc caccacacaa cccaccacag agcccaccac ccaacccacc 1860

atccaaccca cccaaccaac tacccagctc ccaacagatt ctcctaccca gcccactact 1920

gggtccttct gcccaggacc tgttactctc tgctctgact tggagagtca ttcaacagag 1980

gccgtgttgg gggatgcttt ggtagatttc tccctgaagc tctaccacgc cttctcagca 2040

atgaagaagg tggagaccaa catggccttt tccccattca gcatcgccag cctccttacc 2100

caggtcctgc tcggtaagac cctgcttgaa ttctctccag gtcatttgtt ggacactccc 2160

ataagagtca ccaatccaga cacttacaaa gccatgcctc tgggaagaag ctgtaaaaat 2220

gggctattat atattggggg tggggtagag ggatgtatct tttcattctt gaacattcca 2280

tcatttcaca gtgatgtaat aggcacgatt gcttgtaaaa ctctgtgact atacaagaac 2340

atataaaata aggtcgcagc cactaaccat gtttcatggc aaggagaggt gataagaaag 2400

atgaaattag gcgcagtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccaaggcggg 2460

tggatcacct gaggtcagga gttcaagacc agcctggcca acatggtgaa accctgtctc 2520

tactaaaaat acaaaaatta tcagggagtg gtggtgcatg cctgtaatcc cagctacttg 2580

ggcagctgag gcaggagaat cgcttgaacc caggaggtgg aggttgcagt gagccgagac 2640

cgcaccattg cactacagtc tgggtgacag agcgagactc tgtctcaaaa aaaaaaaaaa 2700

attatcagag atagacctag agtagatgtg gttagtactg ccttctagct ctgtgacctt 2760

gggcagatca ctttaacctc tctgagcctt gagtcctctt gtgtaaaata gtgatgatgc 2820

tatctacctc aaaagattaa gaagcagaaa gccaggccgg gtgcggtggt tcacacctgt 2880

aatcccagca ttttaggagg ccgaggcggg cagatcacga ggtcaggagt tcgagaccag 2940

cctgactaac atggtgaaac cccgtctcta ctaaaaataa aaagaaatta gctaggcatg 3000

gtggtgcaca cctgtaaccc cagctactca ggaggctgag gcaggagaat cacttgaaca 3060

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gagcaagact ctgtctcaaa aaaaaaaaag aagcagccta gtgtctgact tagtgggagg 3180

tcaaaaaaat gtaaatcctc tgccatcttg agggattact gtcaagtccc atttggtaat 3240

taccctagga atggcacaaa caaattacta caagcagtgg ggacagagct attactcccc 3300

agagagaatt ctaaaaaggc tacagaatct ttcttggctg ggcacggtga ctcacaccta 3360

taatcctggc actttgggag gccaaggcag gagttcaaga ccagcctggc caacatgttg 3420

aaaccccatc tctactaaaa atgcaaaaat tagccaggca tagtgatgca tgcttattgt 3480

cccagctact tgggaggcag aggtgggagg attgcttgaa cctggagatt caagtgagct 3540

gagattgcac cactgcattc cagcctgggc aacaaagcaa gactctgtct caaaaaaaaa 3600

aaaaaaaaaa aaaaaagaga gattgagaga acacttccag ctcagatgat ctgtgatccc 3660

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caggccctga agggcttcac gaccaaaggt gtcacctcag tctctcagat cttccacagc 3900

ccaggtgagt gcccaggaat gggcagtgtc tgcagaggag ggtcctgaga ggactctgaa 3960

gggggaccca gcgctgggga aagaaaggac agagggaatg ttggagctac agtatcaggg 4020

atggactgca gagcaggtga agaccttggc aggagcatta ggtcactcca ggaactagac 4080

tgttcttcta atgagacctt agacaagtct ctggcattca tcaactgctt tagaataaaa 4140

ataaccgggc aggtacagta aaatagtgat gatgctatct acctcaaaag attaagaagc 4200

agaaagccag gctgggcgtg gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag 4260

gcaggtggat cacgaggtca ggggttcgag accagcctga ccaacatggt gaaaccctgt 4320

ctctactaaa aatacaaaaa ttagctgggc atggtggcgg gcacctgtaa tcccagctat 4380

tcaggaggct gaggcaggag aattgcttga acctgggagg cggaggttgc agtgagccga 4440

gatgacgcca ctgcactcca gcctgggcga cagagcaaga ctccgtctca aaaaaaaaaa 4500

caaaaacaaa acaaaaacaa aaaaaaaaac aaagaaggag aaagccgggc cgggcatggt 4560

ggctctcatc tgtaagttca aggagttgaa ggtatgctag gactttggga ggccaaggcc 4620

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ggtacggctg ggcatggtgg ctcacacctg taatcccagc actttgggag gctgaggtgg 4740

gtggaacacc tgaggtcagg agttcaagac cagcctggcc aacatggcaa aaccctgtct 4800

ctattaaaaa cacaaaaatt agcctggcat ggtggcaggc gcctataatc ccaactactc 4860

aggaggctga ggcaggagaa tcgcttgaac ccaagagagt gaaggttgca gtgagctgag 4920

atcatgccac ttcactccag cctgagtgaa acagcaaaac tctgtctcaa aaaaaaaaaa 4980

aggaagaaag aaaaaaggcc aggcgcggtg actcacgcct gtaatcgcaa cactttggca 5040

ggccgaggca ggcgattcac aaggtcagga gttcgagacc agtctggcta actaacatag 5100

tgaaactccg tctctactga aaatacaaga aattaccctg gcatggtggt gtgcacctgt 5160

aatcccagct actcaggagg ctgaggcagg agaatcgctt gaacctggga ggcagaggct 5220

gcagtgagcc gagatcgcgc cactgcactc cagcctggat gacagagcaa gactctgtct 5280

caaaaaaaaa aggccgggcg cggtggctca tgcctgtaat cccagcactt tgggaggctg 5340

aggcgggcgg accacgaggt cagaagatca agaccatcct ggctaacaag atgaaaccct 5400

gtctctgcca aaaaaataca aaacttagcc gggcatggtg gcaggcgcct gtggtcccaa 5460

ctacttggga ggctgaggca ggagaatggc atgaacccgg gaggcggagc ttgcagtgag 5520

ccgagattgc gccactgcac tccagcctgg gcaacagagc gagacaccat ctcaaaaaaa 5580

aaaaaaaaaa atggggcggg cgggccaggc gcggtgtctc acacctgtaa tcccagcact 5640

ttgggaggct gaggtgggcg gatcacttga ggtcaggagt tcaagaccag cctggccaac 5700

accaggaaac cctgtctctg ttaaaaatac aaaaattagc caggtgtggt ggcacgcgcc 5760

tgtagtccca gcaggagaat aacttcaacc tgggagacag aggttgcagt cagctgagat 5820

cgcaccactg cattccagcc tgggtgacag accgagactc tgtctcaaaa aaaaaaaaaa 5880

aagaagaata cccatatgca ttcattaata tatagggcta gagggctaga gagctataga 5940

cataaaatag acaaaaaatt tttttgctca tttttgggtc aaaggagtct tgggactcta 6000

attcttttaa tttttgtgtt atgtgaattt gttatcattt acatgtatta tgttattaag 6060

taggtaataa tgataatact aataataaac ttacaaaacg atccaatgta gttgttttca 6120

gactttgttc ctcggagccc taggactttg caaagctgtt tctggagtca tggtgggagt 6180

ggggtgtggg gagcctgagc agtggggaag ggttcaccac ttcctgtgag agggaaacgg 6240

accagctggg ctctgagctc cccacccagc ctcagccagg gtccatttta tattgtgggc 6300

ttcagacatg cctttgtttg aaagcagttc tgctgcttta aaatgtttga taaccattga 6360

actaatctac ccacctccct ttttaaaaaa aaaaggaaaa ctttttttta agctgttttt 6420

tttgtttttt gttttttttt aaactgtaaa aacaatactt aggtctggct cagtgtgcct 6480

gtaattccaa cactgagagg ctgaggtagg aggattgctt gaggctagaa tttcgagact 6540

agcctctggg caacatagac agacctcatc tctacaaaaa attttaaaaa ttatccgggt 6600

gtggtacgtg tctgtagttc cagctatgaa ggactgagac gggaggattg cttgagccaa 6660

ggaattcgaa gttagagtga gctatgttta tgcctctgta ctctaggttg ggtaacagag 6720

taggaccctg tctctaaaaa aaaaaaaatt taatttaaat tttaaaaact cacctatcac 6780

cccatcatct gaaaaacacc ctctttcaga tgtgggaaaa acatggctca gaggtgttca 6840

agaaatgttg catttattta ttacttacaa agctgtaagt cagctttatc cgctgtcttg 6900

ctaggttggt gaaaaatacg taacagcatt caatattagg gcttctatcc ccatctagct 6960

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tttttttttt tcagtggact gaaggctttt gcagagcaaa agccaggaag ttttgtcaca 7380

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gggaaaatct aggcaaatgg aatttaatat ctcaaaaaga ttatcttgcc gagccatagt 7500

cacatagcaa gctgaggcag cggaggcttg gggctacttc tcttgttctt ggttctgggt 7560

ttaccttctt tgggccttat ttgccacatc tgtaagagga gtgggctgga ccgcgctcca 7620

ccatgccgta ttcactaagt gagcagatag aaccatagaa agcatgctca ctctcaaatc 7680

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aacaccaaca acaagatcag ccggctgcta gacagtctgc cctccgatac ccgccttgtc 7920

ctcctcaatg ctatctacct gagtggtaag ggtgccctta gccagttagt cttcccattc 7980

tgggtccttc ttcccctcct ggcttcaaag cccacttaac cccaagttct acaatcggat 8040

ctcaatgtcc ctgcactact ctttgctaac aaggctttta gctcctcttc atccttttcc 8100

tacctgcatt agagcaaccc tcccacctct tccctctagc caagtggaag acaacatttg 8160

atcccaagaa aaccagaatg gaaccctttc acttcaaaaa ctcagttata aaagtgccca 8220

tgatgaatag caagaagtac cctgtggccc atttcattga ccaaactttg aaagccaagg 8280

taagttctta acctttcctt ctcctgtttg aaacctactt gagtctcctg actttttttc 8340

tgctgtagtc ccatcatttt ggggtacatg cttacaaatt catcacttct actccttcca 8400

tctgtatttc caccctatct tttctccttc tcctttctct agccttggcc aaggcagaca 8460

ttgtatattt taggctggaa acaggattct caagtttctt catgcatctc tactatattg 8520

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atcagaagac tctggtggct tagcaagtcc tgtgtgtatg tgggtacctg tgtacagcat 8640

acatatacat gtgtagacgt gtataagtat atccttgtat atgcatatat gtggtaagtg 8700

catgtgtgca catgagttaa atggcttaag tgcattagca gaaattgaac aatttagttt 8760

gatgagtagg gagggagaga agacagaata tggagcccag aggatcccaa ctggcaagct 8820

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agacagaaaa cagtaagaga caatgtctca atacctggct gagaaacaaa ggctctgttc 8940

ttggaacatg ctaggcttgg ttccacattg ggagctttcc ttagcttttg tttctgcctg 9000

tatccctctt cactcagatc ctcacatagc ttgttccttc ttgtcatttg ggtgtcagct 9060

cagaggtcac cttggtggag aagtcttctc cccattaaag cagcctcctc ctcaccctgt 9120

aatatcactc ctgttttatt atattcatta cactcatcac catctgaaat tatgtcattt 9180

atttgcttat ttgcctagga cattgtctgt ctccctaaga tactgtctct ctacttgaat 9240

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aggtgctcat tcagtgtttg ctgaataaat gaatgaatga aatagagggt gccaaagaga 9360

gctactcagt aaaagtggct ggaagacttc atagaggagg gttttttttc gagacagggt 9420

ctcactctgt cactcaagct gcagtgcatt gacatgatct cagctcactg caatctctgc 9480

ctcccgagtt caagcagttc tcctgcctca gcctcccaag tagctgggac tacaggagcc 9540

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caagctggtc tcgaactcct gacctcaagt gatccacacc ctcagcctcc caaagggctg 9660

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cagttattta tccactcatg gacttatcca cccatctatc catccctatc taatgtattt 9780

gaccattcat gactcattta gcagaaccag gacagcctgt ataaggcaca gaagagtgaa 9840

tatatgtgac aggtccagag cattgttcaa attcaagata cgttggggga ggtataaata 9900

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aaagtaggaa ttaagaactt aacaagttag gtttaaatgt aactattcga attataagaa 10020

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gtgagcattc tggacatata atatcaataa taaatattca aatacaaagc aggtataata 10200

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tccaagggat ctagtagctc tgtgtcagga actgggatcg gagaccaaat attagatggt 15660

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cagacagtgc tggaactgac agagactggg gtggaggcgg ctgcagcctc cgccatctct 16200

gtggcccgca ccctgctggt ctttgaagtg cagcagccct tcctcttcgt gctctgggac 16260

cagcagcaca agttccctgt cttcatgggg cgagtatatg accccagggc ctgagacctg 16320

caggatcagg ttagggcgag cgctacctct ccagcctcag ctctcagttg cagccctgct 16380

gctgcctgcc tggacttggc ccctgccacc tcctgcctca ggtgtccgct atccaccaaa 16440

agggctccct gagggtctgg gcaagggacc tgcttctatt agcccttctc catggccctg 16500

ccatgctctc caaaccactt tttgcagctt tctctagttc aagttcacca gactctataa 16560

ataaaacctg acagaccatg actttctctg ctttgccttt gtttttttat tttttatttt 16620

ttattttttt taggcagggt ctcaatctgt cacccaggct agagtacagt ggtgagatca 16680

tggttcactg cagccttaac ctcctgagct caaacaatcc tcccatctca gcctcctatg 16740

taggtgggac cacatgggct tgccaccatg cccagctaat ttttaaattt tttgtaaaga 16800

cagggtctta ctatgttgcc taggctggtc tccaactcct gggctcaagc aatcatccta 16860

acacagcctc ccgaagtgct gggattgtag gcacaccata cctctccttt gcctttgaat 16920

atcagctgct tcaatactaa aggacaagag cgcccatggt tcctgtatca gccagctatt 16980

gctgtatagt aagtcacgtt aaacttagtg gcttcaaaca gcaacccttt gttattttat 17040

gtaagtttca gagttgacta ggtgttttgc tgatctgggc tgaacctggc tgatcttccc 17100

tgggctcatt catacatctg taaggtatag ttgttgggtt ggttagggga tgactggtct 17160

tctgtggcct cagccatgac accaggacaa cttggctctt ctacatgtct tgtatgtcct 17220

tccaacaggc tagtctgtaa tggaaaagag tcaaacagcc agtctctttt tgtttaccat 17280

tgtcctgcag ccaaagcaaa tcacaggacc aaacctagag ttagactgga aaagcactac 17340

aaagtgacag ggcaaagaga cgttaattgg ggactattca tgcagtccat ttctcacagc 17400

ccctatcttg cttatttgtc tgcaacaact ctgacaacaa taatgacagt agctaacgtt 17460

gggaacatag gcagtctgct aagagttttg caggcattta atcttcacaa taaatttata 17520

tggtaaattc agagaggcta agtcttgttc aaagtcctgt agttaggaaa tgatgaaact 17580

gagatttaat agcacctctt atgactcttt tttttttgag acaaagtttc tcttttgttg 17640

ccaaggcttg agtataatag cacaatctcg gctcactgta acctctgcct cctgggttca 17700

agtgattctc ctgcctcagc ctcccaagta gctgggatta caagcatgca ctaccacacc 17760

tggctaattt tgtattttta gtagagacag gttttctttt tttttttttt tccgagatgg 17820

agtcttgctt tgtcggccag gctggagtgc agtggtgcaa tcttggctta ctcaacctcc 17880

acctcccggg ttcaagtagt tctgcctcag cctcccaagt agctgggatt acaggcgtgc 17940

accaccaagc ccagctaact tttgtatttt tagtagagac ggggtttcac catgtggacc 18000

aggctggtct caaactcctg actccaagtg atcttcccac ctcagcctcc caaagtgctg 18060

gcattacagg tgtgagccac tgtgcccggc ctagtgaaaa caatcttctt tactcagtct 18120

accagctcaa ataccagtct cttcaggaaa caacctcaca gacacaccca gaaatgatat 18180

cttaccagtt gtctgggcat cccttagccc agtaaaattg acacataaat ttaaccaccc 18240

cacaccttcc cttctcagtt tcccaaagtc aatctctcag gctgctggga agaccccaaa 18300

ttcctgtctg ggtgggtccc gctttgattc ttatgtgagg aactgttgaa agcaaaggca 18360

ccccccaaat tcaggaagat tcccctctcc ttggggagat cctgacatga tgaaggtggt 18420

gctcagcacc aacctgaatt gtgaaccaac aaagtcagga ggtggaaggt gattctgacc 18480

cctgtggggg tcaaatctct ttgacccttc caatcatgct gagcccggta atgttcccgt 18540

ttgtgaaatg atgaagccaa aactcagaga ggttaagtaa ctatccaaag gtcagactgc 18600

tgcaaatcga tcccacatta tccaaattca agtgtagtag ataacttatt tgggcaggct 18660

tatttccttt ctgcccaaac ttgactgtaa cttaaatctg tgtcttctta ctccctgcac 18720

catgtgaccc tacagagctt atcaaagtgt cttgcactta aaaaaaaaaa aactatggag 18780

gctgggcata gtggctcatg cctataatgc cagcactttg ggagacggag gcaggcagat 18840

cacttgaggc cagggttttg agaccagcct gggcaacatg gcgaaaccct gtctctatta 18900

aaaaatacaa aaatgagcca ggtgttgtgg tgcatgcctg taatcccagc tactcgggag 18960

gctgaggcat gagaatcact ttaacctgga aggcagaggt tgcagtgaat ccagattgta 19020

ccactccact ccagcctggg tgacagagtg agagactgtc taaaaaaaaa aactatgaaa 19080

tgaatgatta aatgaatgag ttatcacatc caggtagagg gaaagaggag atacctaccc 19140

atctggaaag catagaaaaa tctggaaatg aagagaattt atttatttat tttatttttt 19200

gagacagagt cttgctctat cacccaggct ggagtgcagc ggcttgaaca tggttcactg 19260

cagccttgac ctcctgggct caggtgatcc ttccacttca gcctcctgag tagcagggac 19320

cacaggtgtg caccaccaca cctggctaca ttttttgttt tttataaaga cagggtctca 19380

gctgggcacg gtggctcatg cctgtaatgc cagcactttg ggaggccaag gcaggctgat 19440

cacctgagct caggagttcg agaccagcct ggcccacatg gtgaaacctc gtctctatta 19500

aaaatacaaa aattaacaag gcgtggcagc aggcacatgt aatcccagct acttgcgggc 19560

tgaggcagga gaatcacttg aacccaagag gtggaggttg cagtgagccg agatcatgcc 19620

actgcactcc tccagtctgg gggatggagc aagacttcgc cttggagaaa aaaaaaaaaa 19680

gtctcactgt gttgcccaag ctggtctgga actcctgggc tcaagagatc ctctagcctt 19740

ggcctcccaa aatgttggga ttactggtgt gagccaccac acccaagata atttaaatat 19800

tttctcttct gaagcttttc ttataagagg gcatgtgtca cttttttcgt ttgtttaaaa 19860

caatgaacat ttattttgct ttgttttggt tttttgtttt tgtttttgtt ttgagacgga 19920

gtcttgctct gtcttgccca ggctggagta cagtgacaca atctcggctc actgcagcct 19980

ccgcctcctg ggttcaaaca attctcctgt ctcagcctcc cgagtagctg ggactacagg 20040

cttgtgccac catgcctagc taatttttgt atctttagta gaaacgaggt ttcactatgt 20100

tggccaggct ggtctcgaac tcctgacctc aggtgacctg ccctccttgg ccccccaaag 20160

tgccgggatt acaggtataa gccactgcac ccagcctgaa catttatttt gctaatgagt 20220

cattgaccca gtgtgggctt ggcaaatcta gggtagcctc agttatgtac ctgctacagt 20280

cagctggggg ttagctgaag gtttgttgag gtttgatttc actgagcttg cataggctct 20340

ttcacatgtt ttagactttg gctgggatca accagatgac caattctgat ccaagtgatc 20400

tctggtcttc caggaagcta gtctggctta ttcatacgaa gtttgcaaaa gtccaagaaa 20460

gcaagcagag gcatgcatgc aaggcctctt gaatccgaag ctaggaacta ctagaacatc 20520

acttctgcct cattctagca gccaaagcaa gtcaccagac cagtttagat tcaaggtaag 20580

gaaagaatct ctacctgtta aagaaaagac ctgcaaagtc attctgctaa gggcattaat 20640

ataacgaaat gtgaataatt ctggccactt ttccagtata ccatatgtgg tcttacatag 20700

ttgcaaacaa ctattagcaa ctttccccag caacctgcca ctctgttttt ccctaaagaa 20760

tcaagggctt ttgtcgagat cataataata ttagaaacac tttgttacat gaagtttcaa 20820

gtcgtttgca tataaattga atcttctgtt gctatctctg tggcatattt aacaatctct 20880

ggctcttcca gctgcctgtg ttgtagaata aattattata aatacagagc tgcctgagta 20940

tttataataa taaataaata aattatcttc atttccattt cccttgagaa agatggacag 21000

agggctatgc actcatagac acacacacac acacacacac acacaccctt acaaccccca 21060

cctttctgcc ctgccttgca attctactct ggggtagaca aaggcctgta tgtccacaga 21120

tccattttca gtgatctgtt tcctgtcccc aactgtagac ccctccacac gtggatttgt 21180

ctggggaaga accttaaggt gagattaggg ttccattgca atgagtcttt gctgccactt 21240

ggtgtcattg ttgaaggctt gtcctgcata gccccatgga cacttgcctt ttcagggaga 21300

tgtttttgct gttccagatt cttttttttt tttttttttg agacagaatc tctctctgtt 21360

gcccagactg gagtgcaatg gtgcgatctt ggctcactgc aacctctgtt tcccaggttg 21420

aagggattct cctgcctcag cttcctgagt agcaggaatt ataggcaccc accatgtgtc 21480

cagctaattt ttgtattttt agtagagatg gggttttacc atgttggcca ggctggtctc 21540

aaactcctga cctcaagtga tccacccatc ttggcctccc aaagtgttag aattacaggt 21600

gtgagtcact gtgcctggcc ggttccagat tcttaaacag ctgatgtggg gacttaaact 21660

ttgattccaa agtttacact ttacacttgt tcagccactg tttctcaaag atcaatacct 21720

ttagttctct ctggatagca gaaggcttcc aacatgagcc ataggctatg tcagaatcag 21780

cctcatccct atgaaccctt aggacattgt cttgactcat ggttgataac cacattagcc 21840

atgtatctac ctaacatgca ttaaccattt gccatgctgt caggcactgt gttaagaatt 21900

ttacatggat tatgttattt catttaagag agatcatgac ttaagaaaag gatatgttac 21960

tgaatatatt agataattca aaatttagat aatttgatac taagttttcc agaataataa 22020

ctgtaaaagg tagggagaga atcttcaacc attgtagaat ttcttgtctt caaactattg 22080

tttattttct aaatacaaaa atctctaata tttctcagag taggcactct taaattaact 22140

gcttggcata tcaggacagc tatttgggct ttttcatagt gtcttatcat atctaacttt 22200

cattacaaag ttattgattt tggagggtgt ttttagcact agt 22243

<210> 3

<211> 615

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的AAB59490.1 (因子XII - AA)

<400> 3

Met Arg Ala Leu Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Val Ser Leu Glu Ser

1 5 10 15

Thr Leu Ser Ile Pro Pro Trp Glu Ala Pro Lys Glu His Lys Tyr Lys

20 25 30

Ala Glu Glu His Thr Val Val Leu Thr Val Thr Gly Glu Pro Cys His

35 40 45

Phe Pro Phe Gln Tyr His Arg Gln Leu Tyr His Lys Cys Thr His Lys

50 55 60

Gly Arg Pro Gly Pro Gln Pro Trp Cys Ala Thr Thr Pro Asn Phe Asp

65 70 75 80

Gln Asp Gln Arg Trp Gly Tyr Cys Leu Glu Pro Lys Lys Val Lys Asp

85 90 95

His Cys Ser Lys His Ser Pro Cys Gln Lys Gly Gly Thr Cys Val Asn

100 105 110

Met Pro Ser Gly Pro His Cys Leu Cys Pro Gln His Leu Thr Gly Asn

115 120 125

His Cys Gln Lys Glu Lys Cys Phe Glu Pro Gln Leu Leu Arg Phe Phe

130 135 140

His Lys Asn Glu Ile Trp Tyr Arg Thr Glu Gln Ala Ala Val Ala Arg

145 150 155 160

Cys Gln Cys Lys Gly Pro Asp Ala His Cys Gln Arg Leu Ala Ser Gln

165 170 175

Ala Cys Arg Thr Asn Pro Cys Leu His Gly Gly Arg Cys Leu Glu Val

180 185 190

Glu Gly His Arg Leu Cys His Cys Pro Val Gly Tyr Thr Gly Pro Phe

195 200 205

Cys Asp Val Asp Thr Lys Ala Ser Cys Tyr Asp Gly Arg Gly Leu Ser

210 215 220

Tyr Arg Gly Leu Ala Arg Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro Cys Gln Pro

225 230 235 240

Trp Ala Ser Glu Ala Thr Tyr Arg Asn Val Thr Ala Glu Gln Ala Arg

245 250 255

Asn Trp Gly Leu Gly Gly His Ala Phe Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp

260 265 270

Ile Arg Pro Trp Cys Phe Val Leu Asn Arg Asp Arg Leu Ser Trp Glu

275 280 285

Tyr Cys Asp Leu Ala Gln Cys Gln Thr Pro Thr Gln Ala Ala Pro Pro

290 295 300

Thr Pro Val Ser Pro Arg Leu His Val Pro Leu Met Pro Ala Gln Pro

305 310 315 320

Ala Pro Pro Lys Pro Gln Pro Thr Thr Arg Thr Pro Pro Gln Ser Gln

325 330 335

Thr Pro Gly Ala Leu Pro Ala Lys Arg Glu Gln Pro Pro Ser Leu Thr

340 345 350

Arg Asn Gly Pro Leu Ser Cys Gly Gln Arg Leu Arg Lys Ser Leu Ser

355 360 365

Ser Met Thr Arg Val Val Gly Gly Leu Val Ala Leu Arg Gly Ala His

370 375 380

Pro Tyr Ile Ala Ala Leu Tyr Trp Gly His Ser Phe Cys Ala Gly Ser

385 390 395 400

Leu Ile Ala Pro Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Gln Asp

405 410 415

Arg Pro Ala Pro Glu Asp Leu Thr Val Val Leu Gly Gln Glu Arg Arg

420 425 430

Asn His Ser Cys Glu Pro Cys Gln Thr Leu Ala Val Arg Ser Tyr Arg

435 440 445

Leu His Glu Ala Phe Ser Pro Val Ser Tyr Gln His Asp Leu Ala Leu

450 455 460

Leu Arg Leu Gln Glu Asp Ala Asp Gly Ser Cys Ala Leu Leu Ser Pro

465 470 475 480

Tyr Val Gln Pro Val Cys Leu Pro Ser Gly Ala Ala Arg Pro Ser Glu

485 490 495

Thr Thr Leu Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly His Gln Phe Glu Gly Ala

500 505 510

Glu Glu Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Glu Ala Gln Val Pro Phe Leu Ser

515 520 525

Leu Glu Arg Cys Ser Ala Pro Asp Val His Gly Ser Ser Ile Leu Pro

530 535 540

Gly Met Leu Cys Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Thr Asp Ala Cys Gln

545 550 555 560

Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Asp Gln Ala Ala Glu Arg

565 570 575

Arg Leu Thr Leu Gln Gly Ile Ile Ser Trp Gly Ser Gly Cys Gly Asp

580 585 590

Arg Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Asp Val Ala Tyr Tyr Leu Ala Trp

595 600 605

Ile Arg Glu His Thr Val Ser

610 615

<210> 4

<211> 1959

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的M11723.1 (因子XII - 核苷酸)

<400> 4

ttggagtcaa cactttcgat tccaccttgg gaagccccca aggagcataa gtacaaagct 60

gaagagcaca cagtcgttct cactgtcacc ggggagccct gccacttccc cttccagtac 120

caccggcagc tgtaccacaa atgtacccac aagggccggc caggccctca gccctggtgt 180

gctaccaccc ccaactttga tcaggaccag cgatggggat actgtttgga gcccaagaaa 240

gtgaaagacc actgcagcaa acacagcccc tgccagaaag gagggacctg tgtgaacatg 300

ccaagcggcc cccactgtct ctgtccacaa cacctcactg gaaaccactg ccagaaagag 360

aagtgctttg agcctcagct tctccggttt ttccacaaga atgagatatg gtatagaact 420

gagcaagcag ctgtggccag atgccagtgc aagggtcctg atgcccactg ccagcggctg 480

gccagccagg cctgccgcac caacccgtgc ctccatgggg gtcgctgcct agaggtggag 540

ggccaccgcc tgtgccactg cccggtgggc tacaccggac ccttctgcga cgtggacacc 600

aaggcaagct gctatgatgg ccgcgggctc agctaccgcg gcctggccag gaccacgctc 660

tcgggtgcgc cctgtcagcc gtgggcctcg gaggccacct accggaacgt gactgccgag 720

caagcgcgga actggggact gggcggccac gccttctgcc ggaacccgga caacgacatc 780

cgcccgtggt gcttcgtgct gaaccgcgac cggctgagct gggagtactg cgacctggca 840

cagtgccaga ccccaaccca ggcggcgcct ccgaccccgg tgtcccctag gcttcatgtc 900

ccactcatgc ccgcgcagcc ggcaccgccg aagcctcagc ccacgacccg gaccccgtct 960

cagtcccaga ccccgggagc cttgccggcg aagcgggagc agccgccttc cctgaccagg 1020

aacggcccac tgagctgcgg gcagcggctc cgcaagagtc tgtcttcgat gacccgcgtc 1080

gttggcgggc tggtggcgct acgcggggcg cacccctaca tcgccgcgct gtactggggc 1140

cacagtttct gcgccggcag cctcatcgcc ccctgctggg tgctgacggc cgctcactgc 1200

ctgcaggacc ggcccgcacc cgaggatctg acggtggtgc tcggccagga acgccgtaac 1260

cacagctgtg agccgtgcca gacgttggcc gtgcgctcct accgcttgca cgaggccttc 1320

tcgcccgtca gctaccagca cgacctggct ctgttgcgcc ttcaggagga tgcggacggc 1380

agctgcgcgc tcctgtcgcc ttacgttcag ccggtgtgcc tgccaagcgg cgccgcgcga 1440

ccctccgaga ccacgctctg ccaggtggcc ggctggggcc accagttcga gggggcggag 1500

gaatatgcca gcttcctgca ggaggcgcag gtaccgttcc tctccctgga gcgctgctca 1560

gccccggacg tgcacggatc ctccatcctc cccggcatgc tctgcgcagg gttcctcgag 1620

ggcggcaccg atgcgtgcca gggtgattcc ggaggcccgc tggtgtgtga ggaccaagct 1680

gcagagcgcc ggctcaccct gcaaggcatc atcagctggg gatcgggctg tggtgaccgc 1740

aacaagccag gcgtctacac cgatgtggcc tactacctgg cctggatccg ggagcacacc 1800

gtttcctgat tgctcaggga ctcatctttc cctccttggt gattccgcag tgagagagtg 1860

gctggggcat ggaaggcaag attgtgtccc attcccccag tgcggccagc tccgcgccag 1920

gatggcgcag gaactcaata aagtgctttg aaaatgctg 1959

<210> 5

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

aaaagcagag agagcttccc tgaaagagat gactcctgga gtcccccaga gcctacagta 60

ct 62

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

aaaagcagag agagcttccc tgaaagagat gactcctgga gcctacagta ct 52

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

ttgcacggcg gtcactggac acagataact 30

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

caagcggctc cgggcagaaa gggttca 27

Claims (16)

1.腺相关病毒(AAV)载体在制备用于治疗哺乳动物中功能性血浆C1酯酶抑制剂缺陷、或治疗或预防其任何症状的药物中的用途，其中所述AAV载体包含可操作地连接到编码人C1酯酶抑制剂(C1EI)的核酸序列的启动子，其中由此表达所述核酸以生产蛋白质。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物具有遗传性血管性水肿。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物中的粘膜下或皮下水肿被抑制或减少。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述AAV载体适于在水肿发作之前和/或之后向所述哺乳动物施用一次。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述AAV载体适于在水肿发作之前和/或之后向所述哺乳动物施用两次或更多次。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述AAV载体适于预防性地施用于所述哺乳动物。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物是人。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述AAV载体适于通过选自下组的给药途径施用于所述哺乳动物：口内、肌内、透皮、静脉内、动脉内、皮下、皮内和腹膜内。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述AAV载体是非人腺相关病毒。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述非人腺相关病毒是恒河猴腺相关病毒。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述恒河猴腺相关病毒是腺相关病毒血清型rh.10。

12.根据权利要求1所述的用途，其中所述AAV载体是AAV8或AAV9载体。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述启动子是组成型活性启动子、细胞类型特异性启动子或诱导型启动子。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述AAV载体进一步包含巨细胞病毒(CMV)增强子序列。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的用途，其中所述AAV载体包含编码C1EI的核酸序列，所述C1EI包含SEQ ID NO：1。

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