CN108018270B - 用以提升核苷酸类似物并入的重组dna聚合酶 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种组合物,其包含重组DNA聚合酶与3’‑酯化核苷酸类似物。所述重组DNA聚合酶的氨基酸序列与9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)有至少90%的同源性,且所述重组DNA聚合酶包含在对应于9°NDNA聚合酶氨基酸残基141与143位置的至少二个突变。本申请还提供一种重组DNA聚合酶。所述重组DNA聚合酶的氨基酸序列与9°N‑IIIDNA聚合酶(SEQ ID NO:3)有至少90%的同源性,且该重组DNA聚合酶包含在对应于9°N‑III DNA聚合酶氨基酸残基480与486位置一个或二个突变。本申请还提供了一种进行聚合反应的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年11月1日提出的美国临时申请第62/415,686号的优先权,在此将其全文引入。
技术领域
本发明涉及用以提升核苷酸类似物并入的重组DNA聚合酶。
背景技术
所有生物体都使用DNA聚合酶以复制并保持其基因组。DNA聚合酶借由检测碱基对间的互补性以及识别碱基对的额外结构特征,以使DNA复制过程能保持高度的保真度。依其氨基酸与大肠杆菌(E.Coli)DNA聚合酶I、II与III之间的同源性,将DNA聚合酶分成三种主要的超级家族。这三大类分别称为A、B及C家族聚合酶。A与B家族聚合酶的核苷酸结合部位有共同的结构核心。
早期针对DNA聚合酶的实验显示,难以并入经修饰的核苷酸,如二脱氧核苷酸(dideoxy-nucleotides,ddNTPs)。因此,已有一些先例是经由修饰DNA聚合酶以提升核苷酸类似物的并入率。相关领域需要开发出一种重组DNA聚合酶,其能够并入3'-酯化核苷酸类似物或其磷酸基接有淬灭剂的3’-酯基-染料,如3'-酯基-染料/5'-Q,其中Q表示淬灭剂。
发明内容
本申请提供一种组合物,其包含:衍生自B家族DNA聚合酶的一种DNA聚合酶,其对于用于DNA链延长的天然核苷酸或其类似物拥有3'编辑活性;以及核苷酸类似物,该核苷酸类似物的3'位置经过修饰。非必要地,所述核苷酸类似物的5'位置上也经过修饰。具体来说,本申请利用9°N与KOD1DNA聚合酶以并入3'-酯化核苷酸类似物。所述的9°N与KOD1DNA聚合酶能够并入3'-酯基-染料核苷酸类似物,且在并入该核苷酸类似物之后,能够移除该染料。因此,可以依次并入多个核苷酸类似物。更有甚者,该9°N与KOD1DNA聚合酶可依次并入其磷酸基接有淬灭剂的3'-酯基-染料,如3'-酯基-染料/5'-Q。
在第一方面中,本申请提供一种组合物,其包含一重组DNA聚合酶与3’-酯化核苷酸类似物,其中该重组DNA聚合酶的一氨基酸序列与9°NDNA聚合酶(SEQ ID NO:1)有至少90%的同源性,且该重组DNA聚合酶包含对应于该9°N DNA聚合酶的氨基酸残基141与143位置的至少二个突变。
在第二方面中,本申请提供一种重组DNA聚合酶,其包含一氨基酸序列,其与9°N-III DNA聚合酶(SEQ ID NO:3)有至少90%的同源性,且该重组DNA聚合酶包含对应于该9°N-III DNA聚合酶的氨基酸残基480与486位置的一个或二个突变。
在第三方面中,本申请提供一种用以进行聚合反应的方法,其包含以下步骤:(a)提供一组合物,其包含一核酸模板、一本发明所述的DNA聚合酶以及选择性的一引物;(b)使该组合物与一3’-酯化核苷酸类似物接触,其中该3’-酯化核苷酸类似物包含通过一酯键而连接到3’端的一连接物;(c)允许该DNA聚合酶以一模板依赖性的方式,将该3’-酯化核苷酸类似物并入一新生链中;以及(d)允许该DNA聚合酶由该新生链移除所并入的3’-酯化核苷酸类似物的该连接物。
附图说明
图1A为MALDI-TOF MS分析图,图中显示利用3’-AL核苷酸进行单一碱基引物延伸的结果。以3’-AL沿着适当引物-模板进行反应可产生具有预期质量(N-dAL为7989m/z)的单一碱基延伸产物。图中标记出引物(N)与延伸产物的波峰。
图1B显示9°N-I和引物(P)-模板(T)DNA与3’-AL在并入后的二元结构。
图1C为9°N-I二元结构的活性位点的卡通图式,图中显示dAL通过该碱基上方的连接物部分而与该引物连接。
图2为MALDI-TOF MS分析图,图中显示利用天然与经修饰核苷酸进行多碱基引物延伸的结果。以所述核苷酸沿着适当引物-模板进行反应,分别可产生具有预期质量的多碱基延伸产物。图中标记出引物(N)与延伸产物的波峰。(A、F、K、P)显示将多个碱基并入各个引物-模板DNA。(B-E)分别以9°N-I、9°N-I Y409A与9°N-III催化所得的延伸产物,其具有dATP和经修饰dATP(3’-AL、3’-Aa与5’Q-3’-Aa)的预期质量。(G-J)分别以9°N-I、9°N-IY409A与9°N-III催化所得的延伸产物,其具有dTTP和经修饰dTTP(3’-TL、3’-Ta与5’Q-3’-Ta)的预期质量。(L-O)分别以9°N-I、9°N-IY409A与9°N-III催化所得的延伸产物,其具有dCTP和经修饰dCTP(3’-CL、3’-Ca与5’Q-3’-Ca)的预期质量。(Q-T)分别以9°N-I、9°N-IY409A与9°N-III催化所得的延伸产物,其具有dGTP和经修饰dGTP(3’-GL、3’-Ga与5’Q-3’-Ga)的预期质量。
图3A为并入后的经修饰核苷酸的荧光偏振(fluorescence polarization,FP)活性。图中分别显示在有Mn2+与Mg2+的情形下,由9°N-IY409A催化的3’-Na的FP活性。
图3B为并入后的经修饰核苷酸的荧光偏振(fluorescence polarization,FP)活性。图中分别显示在有Mn2+与Mg2+的情形下,由9°N-III催化的5’Q-3’-Na的FP活性。
图3C分别显示在有Mn2+与Mg2+的情形下,由9°N-I Y409A催化的3’-Na的FP活性呈现时间相关性的增加。
图3D分别显示在有Mn2+与Mg2+的情形下,由9°N-III催化的5’Q-3’-Na的FP活性呈现时间相关性的增加。
图4A为由8种DNA聚合酶催化dCTP与3’-CL的聚合酶终点(polymerase end-point,PEP)鉴别曲线与结果。
图4B为由Bst-Lg、THN以及Klenow催化dATP与3’-AL的PEP鉴别曲线与结果。
图4C为由Bst-Lg、THN以及Klenow催化dTTP与3’-TL的PEP鉴别曲线与结果。
图4D为由Bst-Lg、THN以及Klenow催化dCTP与3’-CL的PEP鉴别曲线与结果。
图4E为由Bst-Lg、THN以及Klenow催化dGTP与3’-GL的PEP鉴别曲线与结果。
图5A为由9°N-III催化dATP与5’Q-3’-Aa的PEP鉴别曲线与结果。
图5B为由9°N-III催化dTTP与5’Q-3’-Ta的PEP鉴别曲线与结果。
图5C为由9°N-III催化dCTP与5’Q-3’-Ca的PEP鉴别曲线与结果。
图5D为由9°N-III催化dGTP与5’Q-3’-Ga的PEP鉴别曲线与结果。
图6显示dATP和3’-AL与Bst-Lg在含有12T同型聚合序列(homopolymericsequence)的DNA模板上的引物延伸。
图7A显示分别在pH 7.5、8.0与8.8下,由9°N-I催化的3’-NL、3’-Na与5’Q-3’-Na核苷酸的DNA延伸。
图7B显示分别在pH 7.5、8.0与8.8下,由9°N-III催化的3’-NL、3’-Na与5’Q-3’-Na核苷酸的DNA延伸。
图7C显示由9°N-I催化的综合3’-Na-d核苷酸的DNA延伸。
图7D显示由9°N-III催化的综合5’Q-3’-Na,d核苷酸的DNA延伸。
图8A显示由DNA聚合酶Bst-Lg、THN与Klenow催化dNTP与3’-NL的DNA持续合成能力。
图8B显示由DNA聚合酶Bst-Lg、THN与Klenow催化3’-Na的DNA持续合成能力。
图8C显示由9°N-III催化5’Q-3’-Na的DNA持续合成能力。
图9A显示由所选核苷酸结合位点的9°N-III突变株催化5’Q-3’-Ga的延伸产物转换率(conversion rate,C.R.)的摘要整理。
图9B为毛细管电泳分析由核苷酸结合位点的9°N-III突变株的5’Q-3’-Ga的转换率。
图9C显示由9°N-III D480与I486突变株催化的5’Q-3’-Aa与5’Q-3’-Ga核苷酸转换的定量比较。
图9D显示由所选核苷酸结合位点的9°N-III突变株催化5’Q-3’-Na的DNA持续合成能力。
图10A显示由所选DNA结合区域的9°N-III突变株催化5’Q-3’-Ga的延伸产物转换率(conversion rate,C.R.)的摘要整理。
图10B为毛细管电泳分析由DNA结合区域的9°N-III突变株的5’Q-3’-Ga的转换率。
图10C为由所选DNA结合区域的9°N-III突变株催化5’Q-3’-Na的DNA持续合成能力。
图11显示由所选核苷酸结合位点的9°N-III双突变株催化5’Q-3’-Ca的PEP鉴别曲线与结果。
图12显示由所选9°N-III双突变株催化5’Q-3’-Na的DNA持续合成能力。
具体实施方式
除非另有明确说明,本申请与本文所用词汇定义如下。应当理解,上文的一般性说明与下文的实施方式都仅是为了举例与说明,而不应用以限制请求保护的目标。在本申请中,除非另有明确说明,否则所用的单数名词涵盖其复数形式。
在本申请中,“或”一词的用法涵盖“及/或”,除非另有说明。更有甚者,“包括”一词及该词的其他形式,如“包括(includes)”以及“包括(included)”并无限制。
在此处,除非上下文另有明显说明,单数形式的“一(a)、(an)”以及“该”等冠词涵盖其复数型。
在此处,“并入(incorporation)”一词是指借由与经修饰核苷酸的5′磷酸基团形成磷酸二酯键连接,将该经修饰核苷酸加入到第二个核苷酸的游赖3′羟基。与该经修饰核苷酸接合的所述第二个核苷酸通常发生在一聚核苷酸链的3′端。
在此处,“经修饰核苷酸(modified nucleotides)”与“核苷酸类似物(nucleotideanalogues)”在本申请的文本中,是指其3′糖羟基经过修饰的核苷酸,而使得取代基大小大于天然存在的3′羟基。“经修饰核苷酸”与“核苷酸类似物”等词可交替使用。
在此处,“持续合成能力(processivity)”是指可对聚合基质作用的酶的特质。持续合成能力的程度是指该酶每次与一模板结合时,可加入的平均核苷酸数目。一般的DNA聚合酶约花费1秒以定位且结合至一引物与模板结合点。一旦结合之后,非持续合成的DNA聚合酶加入核苷酸的速率为每秒一个核苷酸。
在此处,该“突变(mutation)”一词是指一多肽,相较于其天然对应物,有所改变。基于说明的目的,在此处,一突变聚合酶多肽是指源自一天然聚合酶,并在实验室内经过人工突变或人为改变的聚合酶多肽。此处涵盖任何突变,包括置换、***及/或删除一或多个核苷酸/氨基酸残基、非天然排列(如,与外源多肽/胜肽融合)以及上述任何可能性的组合。当涵盖多个突变时,这些突变可以是连续的残基及/或非连续的残基。
在本申请某些实施方式中,所述DNA测序***可以下步骤进行:1)在每一DNA复制步骤中,利用一DNA聚合酶将一荧光核苷酸类似物加入至该新生引物;2)由于3′-端荧光结合物使得DNA复制暂时中止,上述3′-端荧光结合物实例为核苷酸类似物或二核苷酸;3)利用3′-端结合物发出的荧光信号,纪录所加入核苷酸的种类;4)利用DNA聚合酶的外切酶或酯酶活性移除3′-端荧光部分;以及5)恢复3′-端羟基,且最后加入的核苷酸可供用于下一回合的核苷酸加入。
当将此种核苷酸类似物用于一种改良后的DNA测序***时,于底物在一DNA聚合酶的活性位置和模板形成碱基配对之后,荧光信号立刻亮起,且持续到借由该DNA聚合酶的催化性编辑活性将染料部分由DNA聚合酶复合物切除为止。上述3′-染料底物的测序程序涉及至少两阶段酶反应,亦即,聚合与催化编辑(或酯水解)活性,以完成每一次的核苷酸加入的循环,有效延长上述3′-染料产生的荧光信号驻留于信号侦测区的时间,相较于利用5′-端染料标记(5′-染料)基质的定序策略,利用上述3′-端染料-标记(3′-染料)核苷酸基质所产生的信号持续时间较长,因此更为精确。
本申请的重组DNA聚合酶在并入一种经修饰核苷酸类似物或多种不同的经修饰核苷酸类似物时,展现了较佳的效率及/或观测并入率。举例来说,本申请的重组DNA聚合酶能够并入一系列经修饰核苷酸,这些经修饰核苷酸带有相同的3′取代基但其核苷酸分子的某些其他部分可能不同,如其碱基部分或是否带有可检测标记。其他聚合酶能够并入带有不同3′取代基的多种经修饰核苷酸。
在第一方面中,本申请提供一种组合物,其包含一重组DNA聚合酶以及3’-酯化核苷酸类似物,其中该重组DNA聚合酶包含一氨基酸序列,其与9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)有至少90%的同源性,且该重组DNA聚合酶包含在对应于该9°N DNA聚合酶氨基酸残基141与143位置的至少二个突变。
在某些实施例中,本申请的组合物还包含一引物与dNTP。
在本申请某些实施例中,位于该9°N DNA聚合酶氨基酸残基141的突变为D(天冬氨酸)141A(丙氨酸)。在某些实施例中,位于该9°N DNA聚合酶氨基酸残基143的突变为E(谷氨酸)143A。在某些实施例中,该9°N DNA聚合酶包含SEQ ID NO:1所示的一氨基酸序列。
在本申请某些实施例中,该重组DNA聚合酶系选自由以下所组成的群组:9°N-IDNA聚合酶(SEQ ID NO:2)、9°N-III DNA聚合酶(SEQ ID NO:3)、KODexo- DNA聚合酶(SEQ IDNO:5)、9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)及其突变株、KOD1DNA聚合酶(SEQ ID NO:4)及其突变株,及上述的组合。在本申请某些实施例中,本申请是关于一种热稳定酶,此酶为源自Thermococcus sp.9°N-7品系的DNA聚合酶。所述的9°N-7是一种具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶,以SDS-PAGE分析显示其分子量约为90-95kDa。在某些实施例中,于分赖步骤之后,将经过放射活性物质标记的脱氧核苷酸并入活化DNA中,以测定聚合酶活性。
在某些实施例中,一9°N-I DNA聚合酶包含SEQ ID NO:2所示的一氨基酸序列,且该9°N-I DNA聚合酶(SEQ ID NO:2)与该9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)有99%的序列同源性。在某些实施例中,该9°N-I DNA聚合酶包含三个突变位置,分别位于氨基酸残基141、143与485。在某些实施例中,位于氨基酸残基141的突变为D141A。在某些实施例中,位于该氨基酸残基143的突变为E143A。在某些实施例中,位于该氨基酸残基485的突变为A485L。在某些实施例中,可基于氨基酸序列比对及/或分子建模方式,得知所述序列同源性。可利用本领域已知的标准比对工具,如BLAST等来进行序列比对。
在某些实施例中,一9°N-III DNA聚合酶包含SEQ ID NO:3所示的一氨基酸序列,且该9°N-III DNA聚合酶(SEQ ID NO:3)与该9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)有99%的序列同源性。在某些实施例中,该9°N-III DNA聚合酶包含六个突变位置,分别是氨基酸残基141、143、408、409、410与485。在某些实施例中,位于氨基酸残基141的突变为D141A。在某些实施例中,位于该氨基酸残基143的突变为E143A。在某些实施例中,位于氨基酸残基408的突变为L(白氨酸)408S(丝氨酸)。在某些实施例中,位于氨基酸残基409的突变为Y(酪氨酸)409A。在某些实施例中,位于氨基酸残基410的突变为P(脯氨酸)410V(缬氨酸)。在某些实施例中,位于氨基酸残基485的突变为A485L。
在某些实施例中,一KODexo- DNA聚合酶亦包含位于氨基酸残基141与143的突变。在某些实施例中,该KODexo- DNA聚合酶包含SEQ ID NO:5所示的一氨基酸序列,且该KODexo-DNA聚合酶(SEQ ID NO:5)与该9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)有90%的序列同源性。
在本申请某些实施例中,除了位于氨基酸残基141与143的突变之外,本申请的重组DNA聚合酶还包含位于该9°N DNA聚合酶氨基酸残基480或486位置的至少一突变。在某些实施例中,相较于在聚合酶氨基酸残基480或486包含一个突变的重组DNA聚合酶,位于该氨基酸残基480与486的双重突变使得该重组DNA聚合酶具备较高的并入活性。在某些实施例中,位于氨基酸残基480的突变为D480A、D480C(半胱氨酸)、D480F(苯丙氨酸)、D480G(甘氨酸)、D480H(组氨酸)、D480I(异亮氨酸)、D480M(甲硫氨酸)、D480N(天冬酰氨酸)、D480P、D480Q(谷酰氨酸)、D480R(精氨酸)或D480S。在某些实施例中,位于氨基酸残基486的突变为I486A、I486F、I486G、I486H、I486L、I486M、I486P、I486R、I486V、I486W(色氨酸)或I486Y。
在本申请某些实施例中,除了位于氨基酸残基141与143以及可任选的480及/或486的突变之外,本申请的重组DNA聚合酶还包含位于氨基酸残基282、325、408或410的至少一个突变。在某些实施例中,位于氨基酸残基282的突变为V282F或V282G。在某些实施例中,位于氨基酸残基325的突变为E325A、E325M或E325S。在某些实施例中,位于氨基酸残基408的突变为S408F或S408Y。在某些实施例中,位于氨基酸残基410的突变为V410A、V410G、V410I或V410P。
在本申请某些实施例中,除了位于氨基酸残基141与143以及可任选的480、486、282、325、408与410中的一或多个突变之外,本申请的重组DNA聚合酶还包含位于247、268、407、409、477、485、385、589、590、676与742残基的一或多个突变。在某些实施例中,位于残基268的突变为I268G;位于残基407的突变为S407A;位于残基409的突变为A409Y;位于残基477的突变为K(赖氨酸)477F或K477Y;位于残基485的突变为L485F;位于残基385的突变为A385K;位于残基589的突变为V589H;位于残基590的突变为T(苏氨酸)590H;位于残基676的突变为T676K;以及位于残基742的突变为E742H或E742R。
可利用任一种已知的方法,制备本申请所述的重组DNA聚合酶。在本申请某些实施例中,可利用重组DNA技术制备本申请的重组DNA聚合酶。在某些实施例中,重组DNA聚合酶的制造通常包括以下步骤:(1)分离DNA片段,且经分离的DNA片段编码本申请的DNA聚合酶的活性形式;(2)之后,以一限制剪切酶处理该经分赖的DNA片段,所获得的片段的两末端可供连接到原核或真核宿主/载体***;(3)之后,将由该宿主/载体***制得的该经分离DNA片段与一DNA连接酶混合,以产生一重组DNA;(4)将该重组DNA引入一宿主生物体;(5)可由经转化的宿主培养物制得本申请的活性重组DNA聚合酶,并可由宿主细胞中收获该重组DNA聚合酶,或是当宿主细胞通过细胞膜分泌该重组DNA聚合酶时,由培养液中收获该重组DNA聚合酶。
在本申请某些实施例中,由于已从9°N-7基因组DNA中选择出编码此酶的基因,亦可通过重组DNA技术制得本申请的重组DNA聚合酶。在某些实施例中,编码9°N-I DNA聚合酶的序列如SEQ ID NO:6所示。在某些实施例中,编码9°N-III DNA聚合酶的序列如SEQ IDNO:7所示。在某些实施例中,编码KODexo- DNA聚合酶的序列如SEQ ID NO:8所示。
在本申请某些实施例中,本申请的重组DNA聚合酶能够并入3’-酯化核苷酸类似物,其带有通过一酯键而连接到3'位置的一连接物。在本申请某些实施例中,对于包括一嘌呤或嘧啶碱基以及一核糖或脱氧核糖的糖部分且具有一可移除的3'-OH阻断基团与其共价结合的核苷酸,本申请的重组DNA聚合酶能够更有效率地并入此种核苷酸。在某些实施例中,该3’-酯化核苷酸类似物为3’-酯化核苷酸、3’-酯基-染料类似物或其磷酸基接有淬灭剂的3’-酯基-染料类似物(3’-酯基-染料/5’-Q)。在某些实施例中,该3’-酯基-染料/5’-Q有化学式(I)所示结构:
其中m为整数且1≦m≦10,L为该连接物基团;
Rm与Rm+1随m不同而改变,且当m大于1时,Rm为一组范围涵盖R1至Rm的官能团,各Rm可独立地为氢(H)或由一连接物基团Lm与一Fm组成的一官能团,而Rm+1可为氢(H)或由一连接物基团Lm+1与该Fm+1所组成的一官能团;该F、Fm或Fm+1独立地为一荧光染料或一淬灭剂;该连接物基团Lm或Lm+1独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇、酯基、氨基、磺酰基或其组合;
B为一碱基,其选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或5-甲基胞嘧啶;
Z可独立地选自氢、羟基、硫醇基、卤素或氨基;以及
化学式(I)中Y为氧(O)或硫(S)。
在本申请某些实施例中,上述作为荧光染料而连接到核苷酸3’-端的F、Fm或Fm+1,不仅可作为一信号报导物,还可作为聚合反应过程中的中止物。在某些实施例中,使用其磷酸基接有淬灭剂(3’-酯基-染料/5’-Q)以降低由位于核苷酸3’-端的标记所产生的光可检测信号(如由该荧光染料产生的荧光信号),此类荧光信号值为反应液的荧光背景值,降低背景值也具有提升信号正确率的功能。在某些实施例中,该连接物基团的长度为1-50个原子。在本申请某些实施例中,具有化学式(I)结构的3’-酯化核苷酸类似物中的F为一光可检测的标记,如ATTO 488、ATTO 532、ATTO 514、ATTO 520、ATTO 647N、ATTO 633、STAR 488、FAM、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 568、Alexa 647、Alexa 660、Alexa 700、FRET染料、Cy3、Cy5、HEX、TAMRA、ROX、JOE以及TET。在某些实施例中,该3’-酯化核苷酸类似物还包含一第一标记部分,其连接至该连接物;以及选择性的一第二标记部分,其连接至该3’-酯化核苷酸类似物的5’磷酸根。在某些实施例中,相较于利用5′-端染料标记(5′-染料)底物的测序策略,利用上述3′-端染料-标记(3′-染料)核苷酸底物所产生的信号持续时间较长,因此更为精确。
在所述第一方面的一实施例中,本申请的组合物包含重组DNA聚合酶,其氨基酸序列与9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)有至少90%的同源性;举例来说,可以是9°N-I DNA聚合酶(SEQ ID NO:2)、9°N-III DNA聚合酶(SEQ ID NO:3)、KOD1DNA聚合酶(SEQ ID NO:4)或KODexo- DNA聚合酶(SEQ ID NO:5);且所述3’-酯化核苷酸类似物为例如3’-酯基-染料类似物或其磷酸基接有淬灭剂的3’-酯基-染料类似物(3’-酯基-染料/5’-Q)。
在第二方面中,本申请提供一种重组DNA聚合酶,其包含一氨基酸序列,此序列与9°N-III DNA聚合酶(SEQ ID NO:3)有至少90%的同源性,且该重组DNA聚合酶包含对应于该9°N-III DNA聚合酶氨基酸残基480与486位置的一个或二个突变。在某些实施例中,该9°N-III DNA聚合酶包含位于该氨基酸残基141与143的突变。在一实施例中,该9°N-III DNA聚合酶包含SEQ ID NO:3所示的一氨基酸序列。
在某些实施例中,该重组DNA聚合酶包含位于该氨基酸残基480与486的双重突变,且相较于在该氨基酸残基480或486具有单一突变的重组DNA聚合酶,在氨基酸残基480与486带有双重突变的重组DNA聚合酶有较佳的并入活性。在某些实施例中,位于该氨基酸残基480的突变为D480A、D480C、D480F、D480G、D480H、D480I、D480M、D480N、D480P、D480Q、D480R或D480S。在某些实施例中,位于该氨基酸残基486的突变为I486A、I486F、I486G、I486H、I486L、I486M、I486P、I486R、I486V、I486W或I486Y。在本申请某些实施例中,除了位于氨基酸残基480及/或486的突变之外,本申请的重组DNA聚合酶还包含位于氨基酸残基282、325、408或410的至少一突变。在某些实施例中,位于该氨基酸残基282的突变为V282F或V282G。在某些实施例中,位于该氨基酸残基325的突变为E325A、E325M或E325S。在某些实施例中,位于该氨基酸残基408的突变为S408F或S408Y。在某些实施例中,位于该氨基酸残基410的突变为V410A、V410G、V410I或V410P。
在本申请某些实施例中,除了位于氨基酸残基480与486以及可任选的282、325、408与410中的一或多个突变之外,本申请的重组DNA聚合酶还包含位于残基247、268、407、409、477、485、385、589、590、676与742的一或多个突变。在某些实施例中,位于该残基268的突变为I268G;位于该残基407的突变为S407A;位于该残基409的突变为A409Y;位于该残基477的突变为K477F或K477Y;位于该残基485的突变为L485F;位于该残基385的突变为A385K;位于该残基589的突变为V589H;位于该残基590的突变为T590H;位于该残基676的突变为T676K;及位于该残基742的突变为E742H或E742R。
本申请的重组DNA聚合酶能够提升DNA聚合酶的目标活性,且特别是可以提升对于在3’位置带有较大取代基团的核苷酸类似物的并入率。
可利用所述技术领域中具有通常知识者所知的任一种方法来产生一或多个突变,如:定点诱变(site-directed mutagenesis),例如利用Amersham的Sculptor.TM.活体外诱变***,Les Ullis,France);PCR诱变;DNA穿梭(DNA shuffling);以及利用化学合成技术,例如产生一合成核酸分子。根据某些实施例,本申请所欲涵盖的一或多突变包含对一或多个氨基酸残基进行一或多个删除及/或置换,所述氨基酸残基直接或间接地涉及一天然DNA聚合酶所展现的至少一种酶活性。在一实施例中,所述突变可增加酶活性,如该聚合酶活性。在本申请的文本中,相对于该未突变部分中相对应的天然DNA聚合酶,该所制得的突变株聚合酶多肽整体保留了相当高的同一性(如,至少90%)。
在本申请某些实施例中,本申请的重组DNA聚合酶能够并入3’-酯化核苷酸类似物,其带有通过一酯键而连接到3'位置的一连接物。在某些实施例中,该3’-酯化核苷酸类似物为3’-酯化核苷酸或其磷酸基接有淬灭剂的3’-酯基-染料类似物(3’-酯基-染料/5’-Q)。该具有化学式(I)所示结构的3’-酯基-染料/5’-Q以及淬灭剂的实施例如本文所述。
在第三方面中,本申请提供一种用以进行聚合反应的方法,此方法包含以下步骤:(a)提供一组合物,其包含一核酸模板、一本申请所述的DNA聚合酶以及选择性的一引物;(b)使该组合物与一3’-酯化核苷酸类似物接触,其中该3’-酯化核苷酸类似物包含通过一酯键而连接到3’端的一连接物;(c)允许该DNA聚合酶以一模板依赖性的形式,将该3’-酯化核苷酸类似物并入一新生链中;以及(d)允许该DNA聚合酶由该新生链移除所并入的3’-酯化核苷酸类似物的该连接物。
所述DNA聚合酶、具有化学式(I)所示结构的3’-酯基-染料/5’-Q以及淬灭剂的实施例如本文所述。
在某些实施例中,该聚合反应用于聚合酶链反应、qPCR、dPCR、q-RT-PCR、核酸合成、合成测序、焦磷酸测序、质子释放测序、单分子实时测序(single molecule real-timesequencing,SMRT)、核酸上荧光显影、单一核苷酸多型性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)基因分型或核酸上实时荧光淬灭。
在本申请某些实施例中,可利用包含一重组DNA聚合酶与3’-酯化核苷酸类似物的本申请的组合物或本申请的重组DNA,以将经修饰核苷酸类似物并入一聚核苷酸链中。本申请的经修饰核苷酸类似物的3′糖羟基经过修饰,而使得取代基大小大于天然存在的3′羟基。可利用本申请的经修饰核苷酸类似物,以检测一DNA模板的序列。在某些实施例中,可将本申请的重组DNA聚合酶利用于测序相关应用,且可和任何类型的数组式测序技术合并使用,上述数组式测序技术需要利用一DNA聚合酶,以将核苷酸并入一聚核苷酸链中。在某些实施例中,可将包含一重组DNA聚合酶与3’-酯化核苷酸类似物的本申请的组合物或本申请的重组DNA用于在任何类型的数组上进行核酸测序,所述数组是将核酸固定于一固态基质上。
上文说明摘要整理出数个实施例的特征,这使得所属技术领域中具有通常知识者够更加理解本申请的多种方面。所属技术领域中具有通常知识者可轻易地使用本申请作为基础,以设计或修改其他组合物,以便实现与此处申请的实施例相同的目的及/或达到相同的优点。所属技术领域中具有通常知识者亦可理解,这些均等的实例并未悖离本申请的精神与范畴,且其可对本申请进行各种改变、替换与修改,而不会悖离本申请的精神与范畴。
实验例
[缩写对照]
表1下表列出全文中所用的缩写对照。
[化学品与酶]
除非另有说明,此处所用的化学品皆购自Sigma-Aldrich。作为引物或模板的寡核苷酸是商业合成。本申请所使用的核苷酸类似物皆由Personal Genomics Inc.合成。Therminator、Vent(exo-)、Bst-Lg、Bsu、Taq以及Klenow(exo-)片段(Klenow(去除外切酶活性)片段)DNA聚合酶购自New England Biolabs。Tfl与TthDNA聚合酶则是购自Promega。
[蛋白表达与纯化]
将编码9°N-I、9°N-III以及KODexo-的质粒DNA转化至大肠杆菌(E.coli)BL21品系中,并培养于5ml的实时TB培养基中以诱导表现。于14小时后收集细胞,并以玻璃珠破碎细胞。于离心后,取得澄清的裂解物。利用镍-氮基三醋酸(nickel-nitrilotriacetic acid,简称Ni-NTA))树脂分离C端带有6个组氨酸标签的9°N-III突变株与KODexo-突变株。利用洗涤缓冲液洗涤结合的蛋白。将纯化的9°N-III与KODexo-突变株分装后储存于-80℃。
[定位与饱和突变]
利用Phusion高度保真度DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)以及带有9°N-III基因作为模板的重组表达载体pET28b(-)进行定位饱和突变实验。于进行饱和突变时,使用经良好设计的成对互补引物对(比例1:1)。所有引物皆由Mission Biotech(台湾)生产。以20-μL的反应体积在相同条件下进行突变反应。反应物包含1倍HF缓冲液、各种dNTP各200μM、100ng模板、各种混合引物各2μM以及0.06U/μL的Phusion聚合酶。所用的温度设定为:98℃下2分钟,接着是35个循环的98℃30秒、55℃30秒以及72℃5分钟,且最终的培养阶段为72℃下10分钟。在扩增后,将反应混合物以DpnI(Thermo Fisher Scientific)在37℃下消化1小时,以消化掉甲基化的亲代DNA。将5μL经DpnI消化的混合物用于转化E.coliDH5a化学感受态细胞。将细胞在冰上解冻,加入5μL反应物后轻轻混合,接着在冰上培养30分钟。以42℃处理细胞60秒,使其热休克,之后将其再度置于冰上2分钟。接着,加入500μL的SOC培养液,并将经转化的细胞在37℃下振荡培养30分钟。进行离心使经转化的细胞沉淀,再将其重新悬浮于150μL的SOC培养基中。最后,将经转化的细胞接种于含有卡那霉素(Kanamycin)(50μg/mL)的LB琼脂板上,并于37℃下过夜培养。一般来说,隔天培养板上可形成50到100个菌落。将经转化的培养物接种于添加50μg/mL卡那霉素的LB琼脂盘上。由Mission Biotech(台湾)进行序列分析。
[MALDI-TOF MS分析]
使用Bruker AutoFlex III smartbeam TOF/TOF200***进行核苷酸并入(并入)后的DNA质量测量。在将引物和核苷与DNA聚合酶混合之前,先于10倍缓冲液(含100mMTris-HCl、100mM KCl、20mM MnCl2,且pH7.5)中加入10μM引物使其和模板以1:1的比例预先结合。将反应混合物加热至95℃下1分钟、55℃下2分钟,接着冷却至30℃下2分钟。将0.4μM的DNA聚合酶加入引物/模板复合物,并于冰上培育30分钟。于冰上将40μM的特定改性化合物(specific modified compound)加入到聚合酶反应物中,并在60℃下孵育60分钟。以2μL的乙腈使反应终止。在进行质谱分析前,利用Micro Bio-SpinTM 30管柱(RNase-Free,Bio-Rad,7326251)清洁反应产物。
[结晶与结构确认]
结晶前一天,将上述经结合DNA加入至含有9°N-I以及含CaCl2的缓冲液的混合物中,并于冰上培养10分钟。最后,将3’-AL加入至混合物中,并于4℃下培养过夜。混合物的混合比例如下:[Pol]:[DNA]:[dNTP]:[Ca2+]=1:1:10:20。在室温下进行悬滴蒸气扩散(hanging drop vapor diffusion)实验,结晶于数周内出现。收集结晶的条件如下:混合2μL的蛋白-DNA复合物(以10mg/ml的量在pH 7.5下添加于50mM HEPES溶液中,溶液含150mMKCl与2mM DTT)以及1.5μL的储存溶液(含30-37.5%MPD、0-10%甘油、100mM NaCl以及0-10mM CaCl2)。在NSRRC(台湾)进行X光绕射实验,并利用HKL2000处理所收集到的数据,其后再以CCP4进行分子置换。之后利用Coot程序优化所建构的蛋白质模型,再以CCP4进行计算。
[荧光偏振分析(Fluorescence polarization assay)]
根据已建立方法进行荧光偏振(fluorescence polarization;FP)实验与运算(参见,Chen et al.,Genome Research,9:492–498(1999))。在将核苷酸与DNA聚合酶混合之前,先于10倍反应缓冲液(含200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2SO4、100mM KCl、20mM MnCl2,且pH 7.5)中,将10μM引物与该模板以1:1的比例预先结合。将反应混合物加热至95℃下1分钟、55℃下2分钟,接着冷却至30℃下2分钟。将1μM的DNA聚合酶加入引物/模板复合物,并于冰上培养30分钟。于冰上,将0.5μM的特定经修饰化合物加入到聚合酶反应物中,并在60℃下培养60分钟。在进行荧光测量前,以1.4μL的0.5M EDTA猝灭该反应以终止该反应。
[引物延伸]
表2列出用于延伸分析的所有DNA底物,这些DNA底物是由Integrated DNATechnologies所合成。以5’-6-羧基荧光素(5’-6-carboxyfluorescein;FAM)标记用于并入与持续合成能力(processivity)分析的引物以供荧光检测。实验流程概述如下:在将脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)与DNA聚合酶混合之前,先于1倍ThermoPol缓冲液(含20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1%Triton X-100,且pH 7.5)中,将30nM引物与该模板以1:6的比例预先结合。将反应混合物加热至85℃下5分钟,接着以0.1℃/s的速率冷却至25℃。将指定量的DNA聚合酶加入该引物/模板复合物,并于冰上培养30分钟。于冰上将特定经修饰化合物加入到聚合酶反应物中,并在该等适当温度下培养10分钟。以1.25μL的终止溶液(0.5mM EDTA)猝灭该反应。在ABI 3500基因分析仪(Applied Biosystem)上利用POP-7聚合物与36公分长的毛细管柱进行毛细管电泳分析,以测定该延伸产物的荧光与大小。根据已公开的方法制备毛细管胶体电泳与样品(参见,Nucleic Acids Res。2016。44(2):e15)。使用GeneMapper v4.0搭配特定检测参数来分析数据,以产物形成相对于化合物浓度的线性-对数图来呈现分析结果。对于各DNA聚合酶/经修饰核苷酸进行三重复的聚合酶终点(polymerase end point;PEP)分析,以计算平均IC50±SD。
表2寡核苷酸底物
[前稳态动力学分析(pre-steady state kinetic assay)]
于反应中,测定将正确碱基并入至含25/36碱基双链核酸的比例。借由混合含有酶与DNA底物的溶液和含有Mg2+/dNTP的第二种溶液以起始该反应。加入0.25M EDTA(最终浓度)、pH 8.0猝灭该反应。使用快速淬灭仪器(KinTek Instrument Corp.,State College,PA),以将反应时间控制在20毫秒到20秒之间。
[DNA延伸的电泳分析]
将经淬灭的反应混合物样品和等体积的电泳胶上样缓冲液,在85℃下处理5分钟使其变性,而后加载至16%丙烯酰胺-7M尿素凝胶中。根据Werneburg et al。(1996)等人所述的方法,利用α-扫描仪(Betagen)来定量底物与产物条带。
[DNA持续合成能力分析]
持续合成能力分析中,使用M13mp18DNA制备的线性单链DNA片段作为模板。使用正向引物-A与反相引物-B来扩增M13mp18DNA(150bp)的特定区域。为了获得单链DNA,以λ外切酶在37℃下处理PCR片段1小时。由于正向引物-A经磷酸化,以引物A新合成的该链会被消化。
[3’-酯化核苷酸的单一碱基并入]
在本申请中,利用MALDI-TOF质谱分析与X光结晶分析来探讨3’-AL的单一碱基并入,上述3’-AL是一种以3’-酯基-乙二醇连接物修饰的dATP。如图1A所示,当以9°N-I DNA聚合酶和3’-AL在一模板DNA存在下,于60℃下反应60分钟后,可观察到引物DNA的分子质量增加,原本的引物波峰N(7473m/z)位移到延伸产物波峰N-dAL(7989m/z)。再者,可利用如图1B所示的三维结构来分析单一碱基的并入,如图所示,3’-AL并入引物DNA时,其连接物部分仍然连接于dATP的3’-OH而未被切除。
[3’-酯化核苷酸的多碱基并入]
在本申请中,利用如图2所示的MALDI-TOF质谱分析,来探讨3’-酯化dNTP(3’-NL、3’-Na与5’Q-3’-Na)和天然dNTP的多碱基并入。当以9°N DNA聚合酶和天然与经修饰核苷酸于60℃下反应60分钟后,可观察到引物DNA的分子质量增加。对于dNTP,以9°N-I催化所得各延伸产物的波峰如下:dATP(N-dA4,8728m/z)、dTTP(N-dT4,8692m/z)、dCTP(N-dC2,8053m/z)以及dGTP(N-dG3,8460m/z以及N-dG4,8792m/z)。对于3’-NL,以9°N-I Y409A催化所得各延伸产物的波峰如下:3’-AL(N-dAL,7992m/z以及N-dA-dAL,8305m/z)、3’-TL(N-dTL,7980m/z;N-dT3,8387m/z;N-dT2-dTL,8589m/z;以及N-dT4,8692m/z)、3’-CL(N-dCL,7967m/z以及N-dC-dCL,8256m/z)以及3’-GL(N-dGL,8007m/z以及N-dG-dGL,8337m/z)。对于3’-Na,以9°N-IY409A催化所得各延伸产物的波峰如下:3’-Aa(N-dA3,8414m/z;N-dAa,8620m/z;以及N-dA-dAa,8932m/z)、3’-Ta(N-dT,7778m/z;N-dT2,8083m/z;N-dT3,8388m/z;以及N-dTa,8610m/z)、3’-Ca(N-dC,7761m/z;N-dC3,8340m/z;N-dCa,8596m/z;以及N-dC-dCa,m/z 8885)以及3’-Ga(N-dGa,8636m/z以及N-dG-dGa,8964m/z)。对于5’Q-3’-Na,以9°N-III催化所得各延伸产物的波峰如下:5’Q-3’-Aa(N-dA,7733m/z)、5’Q-3’-Ta(N-dT,7779m/z;N-dT3,8387m/z;以及N-dT4,8692m/z)、5’Q-3’-Ca(N-dCa,8597m/z;N-dC-dCa,8892m/z;以及N-dC2-dCa,9173m/z)以及5’Q-3’-Ga(N-dG,7803m/z以及N-dG2,8130m/z)。
[3’-经修饰核苷酸于并入引物后的荧光偏振(FP)测量]
进行荧光偏振(FP)分析,以探讨核苷酸与9°N DNA聚合酶的暂时结合。如图3A所示,只有在二价离子Mn2+存在下,以9°N-I Y409A催化后,可观察到并入后3’-Na的显著FP信号。然而,如图3B所示,利用9°N-III来并入5’Q-3’-Na时,Mn2+与Mg2+皆可调节FP信号的产生。如图3C与图3D所示,在3’-Na与5’Q-3’-Na中皆可得到FP信号,且其呈现时间相关性(0-6hr),其中FP在6小时达到最大强度。因此,这种随着时间过去而增强的FP信号意味着成功地延伸产物以及带有荧光基团的3’-并入中间产物的累积。
[3’-酯化核苷酸并入的聚合酶终点(PEP)分析]
利用定量PEP分析来测定3’酯化化合物3’-NL与5’Q-3’-Na的并入效率,其可用以高通量地筛选经修饰化合物。因此,计算各核苷酸的终点浓度、IC50值。如图4A所示,利用8种DNA聚合酶(包括Taq、Vent、Tth、Tfl、Bst-Lg、Klenow、Bsu与THN)来估算dCTP与3’-CL,其中针对每一核苷酸进行适当浓度范围的滴定。使用所有欲分析的聚合酶来并入这两种化合物,其IC50值分别介于0.59nM至5.16nM(dCTP)以及276.69nM至2087.36nM(3’-CL)。在这八种DNA聚合酶中,发现THN和Klenow对3’-CL的并入效率较高,约为其他DNA聚合酶的5-6倍(参见表3)。
表3由8种DNA聚合酶测定的dCTP及3’-CL的IC50值
如图4B、4C、4D与4E所示,进一步利用所选DNA聚合酶(Bst-Lg、THN与Klenow)来估算dNTP与3’-NL,并使用每一核苷酸的适当浓度范围。对于3’-NL,THN与Klenow的IC50值优于Bst-Lg,且对这些经修饰核苷酸的并入效率偏好大致上为3’-TL>3’-GL>3’-AL>3’-CL(参见表4)。
表4由Bst-Lg、THN及Klenow测定的dNTP及3’-NL的IC50值
如图5A、5B、5C与5D所示,利用重组9°N-III DNA聚合酶来估算dTP与5’Q-3’-Na的并入效率,其中针对每一核苷酸进行适当浓度范围的滴定。5’Q-3’-Ca(875nM)的并入效率(IC50)大致上优于5’Q-3’-Ga(1689nM)、5’Q-3’-Ta(12420nM)与5’Q-3’-Aa(24140nM),结果显示,相对于其天然核苷酸,这些经修饰核苷酸的并入偏倚范围分别为202.08至1724.28(参见表5)。
表5由9°N-III DNA聚合酶测定dNTP及5’Q-3’-Na的IC50值
[9°N DNA聚合酶的前稳态动力学分析]
为了检测9°N DNA聚合酶对3’-酯化核苷酸的单转换(single-turnover)动力学,在30℃下进行前稳态动力学分析,以测定对dNTP、3’-NL与5’Q-3’-Na的常数kpol与Kd(参见表6)。对于3’-NL,kpol速率常数为10.2s-1(3’-AL)、14.6s-1(3’-TL)、0.094s-1(3’-CL)以及7.7s-1(3’-GL),这些结果相较于其天然核苷酸对应物慢了5到13倍,除了3’-CL之外,其显示比dCTP慢了330倍。对于5’Q-3’-Na,kpol速率常数为0.0209s-1(5’Q-3’-Aa)、0.0359s-1(5’Q-3’-Ta)、0.0185s-1(5’Q-3’-Ca)以及0.1348s-1(5’Q-3’-Ga),这些结果比其3’-NL对应物慢了约5到488倍。对5’Q-3’-Na结合常数(Kd)与其天然核苷酸对应物相似,且比3’-NL者高了3.9到19倍;这些结果显示,在9°N DNA聚合酶活性位置中对于其淬灭剂/荧光基团修饰有较高的结合亲和力。
表6 9°N DNA聚合酶与dNTP、3’NL和5’Q-3’Na核苷酸的前稳态动力学分析
kpol:每秒由9°N DNA聚合酶并入的核苷酸数目
Kd:由9°N DNA聚合酶的核苷酸结合亲和力
[以同型聚合模板进行并入]
为了探讨3’-酯化核苷酸在同型聚合物模板链上的并入表现,以由12个胸腺嘧啶重复(即,TTTTTTTTTTTT)组成的一模板,进行3’-AL的引物延伸,此处使用Bst-Lg DNA聚合酶在不同温度(如,30、45与60℃)下进行反应1分钟,并以其天然核苷酸对应物作为比较(参见图6)。对于3’-AL,延伸产物展现了时间相关性的增加,其dA重复的数目为3至6(亦即,dA3于30℃、dA5于45℃以及dA6于60℃),此一结果短于dATP的反应结果,其在所有反应条件下通常有12个以上dA重复(dA12)。
[3’-经修饰核苷酸的延长活性]
为了探讨3’-酯化核苷酸在随机模板链上的DNA延长表现,以9°NDNA聚合酶在不同pH条件(如,pH 7.5、8.0与8.8)下,进行3’-NL,3’-Na与5’Q-3’-Na的引物延伸(参见图7A与图7B)。此外,亦使用不同荧光基团通过一连接物连接到天然核苷酸的组合(亦即,3’-Na-d,总计有表7所列的24种组合)以及不同荧光基团/淬灭剂(亦即,5’Q-3’-Na,d,总计有表8所列的16种组合)的组合来进行引物延伸(参见图7C与图7D)。
对各别3’-酯化核苷酸的延长活性是核苷酸-相关性(亦即,3’-NL>3’-Na>5’Q-3’-Na)以及pH-相关性(即,pH 8.8>pH8.0>pH 7.5),且在并入3’-NL时,9°N-I展现的效能优于9°N-III(参见图7A);相较之下,在并入5’Q-3’-Na时,9°N-III的效能则优于9°N-I(参见图7B)。
对于3’-Na-d,在24种组合中,至少有三种组合的延长表现较佳,例如组合3B、3C与3E(参见图7C与表7)。
表7用于延伸分析的3’-Na-d核苷酸组合列表
A | T | C | G | |
连接子 | 3’-AL | 3’-TL | 3’-CL | 3’-GL |
1D | 3’-Ad | 3’-Tb | 3’-Ca | 3’-Gc |
1A | 3’-Ad | 3’-Tc | 3’-Cb | 3’-Ga |
1B | 3’-Ad | 3’-Tc | 3’-Ca | 3’-Gb |
1C | 3’-Ad | 3’-Tb | 3’-Cc | 3’-Ga |
1E | 3’-Ad | 3’-Ta | 3’-Cc | 3’-Gb |
1F | 3’-Ad | 3’-Ta | 3’-Cb | 3’-Gc |
2A | 3’-Ac | 3’-Td | 3’-Cb | 3’-Ga |
2B | 3’-Ac | 3’-Td | 3’-Ca | 3’-Gb |
2C | 3’-Ac | 3’-Tb | 3’-Cd | 3’-Ga |
2D | 3’-Ac | 3’-Tb | 3’-Ca | 3’-Gd |
2E | 3’-Ac | 3’-Ta | 3’-Cd | 3’-Gb |
2F | 3’-Ac | 3’-Ta | 3’-Cb | 3’-Gd |
3A | 3’-Ab | 3’-Td | 3’-Cc | 3’-Ga |
3B | 3’-Ab | 3’-Td | 3’-Ca | 3’-Gc |
3C | 3’-Ab | 3’-Tc | 3’-Cd | 3’-Ga |
3D | 3’-Ab | 3’-Tc | 3’-Ca | 3’-Gd |
3E | 3’-Ab | 3’-Ta | 3’-Cd | 3’-Gc |
3F | 3’-Ab | 3’-Ta | 3’-Cc | 3’-Gd |
4A | 3’-Aa | 3’-Td | 3’-Cc | 3’-Gb |
4B | 3’-Aa | 3’-Td | 3’-Cb | 3’-Gc |
4C | 3’-Aa | 3’-Tc | 3’-Cd | 3’-Gb |
4D | 3’-Aa | 3’-Tc | 3’-Cb | 3’-Gd |
4E | 3’-Aa | 3’-Tb | 3’-Cd | 3’-Gc |
4F | 3’-Aa | 3’-Tb | 3’-Cc | 3’-Gd |
对于5’Q-3’-Na,d,某些组合的效果较佳,例如组合A1、A3、A5与C5(参见图7D与表8),这代表9°N DNA聚合酶活性在天然核苷酸上会受到荧光基团选择偏好影响。
表8用于延伸分析的5’Q-3’-Na,d核苷酸组合列表
A | T | C | G | |
A1 | 5’Q-3’-Aa | 5’Q-3’-Ta | 5’Q-3’-Ca | 5’Q-3’-Ga |
A2 | 5’Q-3’-Ad | 5’Q-3’-Ta | 5’Q-3’-Ca | 5’Q-3’-Ga |
A3 | 5’Q-3’-Aa | 5’Q-3’-Td | 5’Q-3’-Ca | 5’Q-3’-Ga |
A4 | 5’Q-3’-Aa | 5’Q-3’-Ta | 5’Q-3’-Cd | 5’Q-3’-Ga |
A5 | 5’Q-3’-Aa | 5’Q-3’-Ta | 5’Q-3’-Ca | 5’Q-3’-Gd |
B1 | 5’Q-3’-Ad | 5’Q-3’-Td | 5’Q-3’-Cd | 5’Q-3’-Gd |
B2 | 5’Q-3’-Aa | 5’Q-3’-Td | 5’Q-3’-Cd | 5’Q-3’-Gd |
B3 | 5’Q-3’-Ad | 5’Q-3’-Ta | 5’Q-3’-Cd | 5’Q-3’-Gd |
B4 | 5’Q-3’-Ad | 5’Q-3’-Td | 5’Q-3’-Ca | 5’Q-3’-Gd |
B5 | 5’Q-3’-Ad | 5’Q-3’-Td | 5’Q-3’-Cd | 5’Q-3’-Ga |
C1 | 5’Q-3’-Ad | 5’Q-3’-Td | 5’Q-3’-Ca | 5’Q-3’-Ga |
C2 | 5’Q-3’-Ad | 5’Q-3’-Ta | 5’Q-3’-Cd | 5’Q-3’-Ga |
C3 | 5’Q-3’-Ad | 5’Q-3’-Ta | 5’Q-3’-Ca | 5’Q-3’-Gd |
C4 | 5’Q-3’-Aa | 5’Q-3’-Td | 5’Q-3’-Cd | 5’Q-3’-Ga |
C5 | 5’Q-3’-Aa | 5’Q-3’-Td | 5’Q-3’-Ca | 5’Q-3’-Gd |
C6 | 5’Q-3’-Aa | 5’Q-3’-Ta | 5’Q-3’-Cd | 5’Q-3’-Gd |
利用毛细管电泳分析9°N DNA聚合酶在较长DNA模板(M13噬菌体,长度为100个碱基)上对3’-酯化核苷酸的持续合成能力。如图8A所示,使用Bst-Lg DNA聚合酶时,对于天然与3’-NL核苷酸都可观察到FAM-标记引物的时间相关性延长,其中模板位置介于107.15(15分钟内)至144.79(60分钟内)。在THN与Klenow中亦可观察到类似的结果,其模板位置分别位于144.76与118。更有甚者,如图8B所示,以DNA聚合酶Bst-Lg(144.76)、THN(144.76)与Klenow(144.67)催化3’-Na时,可观察到完全延伸的产物。以9°N-III DNA聚合酶催化5’Q-3’-Na时,亦可观察到类似的结果(参见图8C)。
[筛选具有较佳并入活性的9°N-III]
为了提升9°N-III DNA聚合酶在5’Q-3’-Na上的表现,利用毛细管电泳,以所选的9°N-III突变株进行单一碱基并入分析。对9°N-III进行的突变主要发生在两个区域,包括位于核苷酸结合位点的氨基酸位置(如,T267、I268、V282、E325、D404、R406、S407、S408、A409、V410、K477、D480、R484、L485、I486、K487、I488、N491、D540、T541、D542、G543、E580、G581、D598、E599、E600、K602、T604、T605、R606)以及DNA结合区(如,M244、G245、D246、R247、N269、L270、S347、S348、T349、N351、L352、E354、G382、G383、Y384、A385、G386、G387、Y388、V389、E391、P392、S492、Y494、G495、Y496、G498、A500、T514、Y538、V589、T590、K592、Y594、G607、L608、E609、W615、H663、E664、Q665、I666、T667、D672、Y673、K674、A675、T676、G677、H679、V680、V698、G708、R709、I710、G711、Y731、E734、N735、Q736、P739、A740、E742),以上区域分别能够直接和3’-酯化核苷酸以及DNA(结合的模板与引物)相互作用。
对于所选的核苷酸结合位点中的位置,使用传统定位诱变,得到在9°N-III残基的相对应19种氨基酸类型。在所有上述氨基酸中,于初步筛选阶段,至少有12个所选部位于5’Q-3’-Ga上展现比9°N-III较高的并入活性,其转换率(C.R.)>50%;上述位置包括I268、V282、E325、S407、S408、A409、V410、K477、D480、L485、I486与E580(参见图9A)。具体来说,相较于9°N-III(48%)(参见图9B),增加的并入产物(表示为C.R百分比)可见于V282F(66%)、V410G(69%)、V410P(78%)、K477F(82%)、D480A(81%)、D480G(80%)、D480I(82%)、D480M(80%)、D480P(82%)、D480R(83%)、L485F(74%)、I486A(82%)、I486F(81%)、I486G(83%)、I486H(82%)、I486L(81%)、I486M(82%)、I486P(100%)、I486R(87%)、I486V(80%)、I486W(81%)、I486Y(82%)。更有甚者,利用所选的9°N-III的D480与I486突变株来分析对5’Q-3’-Aa的并入,且相较9°N-III的C.R为0%下,大多数的所述突变株展现增加的并入产物(参见图9C)。
对于所选的DNA结合区域中的位置,使用传统定位诱变,得到9°N-III相对应残基的三个氨基酸(赖氨酸、精氨酸与组氨酸)。在所有上述氨基酸中,于初步筛选阶段,有6个所选部位于5’Q-3’-Ga展现比9°N-III较高的并入活性,其转换率(C.R.)>50%,包括R247、A385、V589、T590、T676与E742(参见图10A)。具体来说,相较于9°N-III(48%)(参见图10B),增加的并入产物(表示为C.R百分比)可见于A385K(66%)、V589H(76%)、T590H(63%)以及E742H(63%)。
也利用毛细管电泳分析9°N-III在长度为100个碱基的M13噬菌体模板上,对5’Q-3’-Na的持续合成能力。所选的9°N-III突变株,包括来自核苷酸结合位点(D480P、I486G、I486P与I486W)以及来自DNA结合区域(T590H与E742H)的突变,都可观察到增加的模板位置且其VIC信号大于60(表示为ATTO532并入)(参见图9D与图10C)。
为了进一步探讨能否通过所选突变株的组合而提升并入效率,制备了三种来自9°N-III核苷酸结合位点的双重突变株(D480P/I486G、D480P/I486P以及D480P/I486W),并进行PEP与持续合成能力分析。PEP分析显示,对于5’Q-3’-Ca的IC50值为57.6nM(D480P/I486G)、74nM(D480P/I486P)以及341.2nM(D480P/I486W),对照组为875nM(9°N-III),这代表并入效率提升了2.5至15倍(参见图11与表9)。
表9由所选9°N-III DNA聚合酶双突变株测定5’Q-3’-Ca的IC50值
DNA聚合酶 | 5’Q-3’-Ca(nM) | 并入偏倚 |
9°N-III | 875±25 | - |
D480P/I486G | 57.6±14.2 | 0.066 |
D480P/I486P | 74±3.78 | 0.085 |
D480P/I486W | 341.2±16.5 | 0.39 |
更有甚者,利用毛细管电泳分析9°N-III双重突变株在长度为100个碱基的M13噬菌体模板上,对5’Q-3’-Na的持续合成能力。这三种双重突变株均可观察到增加的模板位置且其VIC信号大于100(表示为ATTO532并入)(参见图12)。可在KODexo-与其D480和I486突变株上观察到相似的结果,其中于筛选后,5’Q-3’-Ga的转换率在D480H(84%)、D480N(83%)、D480W(77%)以及I486G(78%)上高于KODexo-(37%),且通常由毛细管电泳分析该持续合成能力提高至100以上。
总结来说,此处提出一种组合物,其包含A家族与B家族DNA聚合酶,以及3’-酯化核苷酸,以MALDI-TOF质谱分析与X光结晶分析,证实其展现了9°N DNA聚合酶的3’编辑活性。通过荧光偏振与毛细管电泳分析,以依次的方式配合荧光进一步证实3’-酯化核苷酸的延长活性。再者,可通过在核苷酸结合位点与DNA结合区域中的所选突变株,提升9°N DNA聚合酶对3’-酯化核苷酸的活性。这些结果显示,上述组合物可在有荧光检测或不需要荧光检测的情形下,用于DNA合成与测序。
序列表
<110> PGI股份有限公司
<120> 用以提升核苷酸类似物并入的重组DNA聚合酶
<150> 美国临时申请第62/415,686号
<151> 2016-11-01
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 775
<212> PRT
<213> 嗜热球菌属9°N-7(Thermococcus sp. 9°N-7)
<220>
<223> 9°N DNA聚合酶
<400> 1
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Glu Asp Val Lys Lys Val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr Val Val Lys
50 55 60
Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile
65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
85 90 95
Arg Asp Arg Ile Arg Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Gln Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gly Gly Tyr
370 375 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile
385 390 395 400
Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His
405 410 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Ala Pro Glu Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe
435 440 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
450 455 460
Arg Lys Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp
465 470 475 480
Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr
485 490 495
Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser
500 505 510
Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Val Ile Arg Glu Leu
515 520 525
Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Leu
530 535 540
His Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala
545 550 555 560
Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu
565 570 575
Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Val Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
580 585 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
595 600 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala
610 615 620
Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val
625 630 635 640
Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
645 650 655
Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Arg Asp
660 665 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala
675 680 685
Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
690 695 700
Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Ala Asp Glu Phe
705 710 715 720
Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln
725 730 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Lys
740 745 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
755 760 765
Leu Lys Val Lys Gly Lys Lys
770 775
<210> 2
<211> 775
<212> PRT
<213> 嗜热球菌属9°N-7(Thermococcus sp. 9°N-7)
<220>
<223> 9°N-I DNA聚合酶
<400> 2
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Glu Asp Val Lys Lys Val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr Val Val Lys
50 55 60
Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile
65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
85 90 95
Arg Asp Arg Ile Arg Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Met Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Gln Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gly Gly Tyr
370 375 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile
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Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His
405 410 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp
420 425 430
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435 440 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
450 455 460
Arg Lys Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp
465 470 475 480
Tyr Arg Gln Arg Leu Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr
485 490 495
Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser
500 505 510
Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Val Ile Arg Glu Leu
515 520 525
Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Leu
530 535 540
His Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala
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Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu
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Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Val Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
580 585 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
595 600 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala
610 615 620
Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val
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Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
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Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Arg Asp
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Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala
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Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
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Leu Lys Val Lys Gly Lys Lys
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<210> 3
<211> 775
<212> PRT
<213> 嗜热球菌属9°N-7(Thermococcus sp. 9°N-7)
<220>
<223> 9°N-III DNA聚合酶
<400> 3
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Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
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130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
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Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
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<212> DNA
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ggcaagataa caacgcgcgg acttgagatt gtgaggcgtg actggagcga gatagcgaaa 1860
gagacgcagg cgagggttct tgaagctttg ctaaaggacg gtgacgtcga gaaggccgtg 1920
aggatagtca aagaagttac cgaaaagctg agcaagtacg aggttccgcc ggagaagctg 1980
gtgatccacg agcagataac gagggattta aaggactaca aggcaaccgg tccccacgtt 2040
gccgttgcca agaggttggc cgcgagagga gtcaaaatac gccctggaac ggtgataagc 2100
tacatcgtgc tcaagggctc tgggaggata ggcgacaggg cgataccgtt cgacgagttc 2160
gacccgacga agcacaagta cgacgccgag tactacattg agaaccaggt tctcccagcc 2220
gttgagagaa ttctgagagc cttcggttac cgcaaggaag acctgcgcta ccagaagacg 2280
agacaggttg gtttgagtgc ttggctgaag ccgaagggaa cttga 2325
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物_FAM_50nt寡核苷酸引物
<400> 9
agtgaattcg agctcggtac ccggggatcc tctagagtcg acctgcaggc 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M13-Fam-50寡核苷酸引物
<400> 10
cgagcacgta taacgtgctt tcctcgttgg aatcagagcg ggagctaaac 50
<210> 11
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Temp_(A)67nt寡核苷酸模板
<400> 11
ttgctcgttt gctgggagcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgggta ccgagctcga 60
attcact 67
<210> 12
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Temp(G)_67nt寡核苷酸模板
<400> 12
ttgctcgttt gctaaaggcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgggta ccgagctcga 60
attcact 67
<210> 13
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Temp(T)_67nt寡核苷酸模板
<400> 13
ttgctcgttt gctgggtgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgggta ccgagctcga 60
attcact 67
<210> 14
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Temp(C)_67nt寡核苷酸模板
<400> 14
ttgctcgttt gctgggcgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgggta ccgagctcga 60
attcact 67
<210> 15
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M13-100nt寡核苷酸模板
<400> 15
atggacagac tcttttactc ggtggcctca ctgattataa aaacacttct caagattctg 60
gcgtaccgtt cctgtctaaa atccctttaa tcggcctcct gtttagtccc gctctgattc 120
caacgaggaa agcacgttat acgtgctcg 149
Claims (7)
1.一种重组DNA聚合酶,其包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列,且在SEQ ID NO:3的氨基酸残基480与486位置包含一个或二个突变。
2.如权利要求1所述的重组DNA聚合酶,其中在SEQ ID NO:3的氨基酸残基480位置的突变为D480A、D480C、D480F、D480G、D480H、D480I、D480M、D480N、D480P、D480Q、D480R或D480S。
3.如权利要求1所述的重组DNA聚合酶,其中在SEQ ID NO:3的氨基酸残基486位置的突变为I486A、I486F、I486G、I486H、I486L、I486M、I486P、I486R、I486V、I486W或I486Y。
4.如权利要求1所述的重组DNA聚合酶,其中该重组DNA聚合酶以模板依赖性的方式,将3’-酯化核苷酸类似物并入新生链,其中该3’-酯化核苷酸类似物为3’-酯化核苷酸、3’-酯基-染料类似物或其磷酸基接有淬灭剂的3’-酯基-染料/5’-Q。
5.如权利要求4所述的重组DNA聚合酶,其中该3’-酯基-染料/5’-Q有化学式(I)所示结构:
其中m为整数且1≦m≦10,L为该连接物基团;
Rm与Rm+1随m不同而改变,且当m大于1时,Rm为一组范围涵盖R1至Rm的官能团,各Rm可独立地为氢(H)或由一个连接物基团Lm与一个Fm组成的一个官能团,而Rm+1可为氢(H)或由一个连接物基团Lm+1与该Fm+1所组成的一个官能团;该F、Fm或Fm+1可独立地为一个荧光染料或一个淬灭剂;该连接物基团Lm或Lm+1独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇、酯基、氨基、磺酰基或其组合;
B为一个碱基,其选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或5-甲基胞嘧啶;
Z可独立地选自氢、羟基、硫醇基、卤素或氨基;以及
化学式(I)中Y为氧(O)或硫(S)。
6.一种用以进行聚合反应的方法,包含以下步骤:
(a)提供一种组合物,其包含一种核酸模板以及如权利要求1所述的一种重组DNA聚合酶;
(b)使该组合物与一种3’-酯化核苷酸类似物接触,其中该3’-酯化核苷酸类似物包含通过一个酯键而连接到3’位置的一个连接物;
(c)允许该重组DNA聚合酶以一种模板依赖性的形式,将该3’-酯化核苷酸类似物并入一条新生链中;以及
(d)允许该重组DNA聚合酶由该新生链移除所并入的3’-酯化核苷酸类似物的该连接物。
7.如权利要求6所述的方法,其中该聚合反应系用于聚合酶链反应、qPCR、dPCR、q-RT-PCR、核酸合成、合成测序、焦磷酸测序、质子释放测序、单分子实时测序(single moleculereal-time sequencing,SMRT)、核酸荧光显影、单一核苷酸多型性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)基因分型或核酸实时荧光淬灭。
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