CN108004307A - 一种糖皮质激素疗效预测snp位点检测的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的方法及试剂盒,本发明涉及分子生物学和医学领域,本试剂盒针对人类基因组DNA中糖皮质激素疗效及毒副作用风险的3个SNP位点设计特异性引物和野生型/突变型探针,与特异报告基因的MagPlex‑TAG磁珠进行杂交反应,通过显色反应在luminex 200仪器上进行检测。通过对信号值的读取判读各个SNP位点的碱基型别进行判定。本发明针对服用糖皮质激素患者疗效及毒副作用风险相关的3个基因SNP位点设计特异引物和探针和报告探针,可分型检测3个SNP位点的型别。本发明提供的检测试剂盒可以灵敏、快速低检测人全血样本中3个SNP型别,可为甲氨蝶呤用药疗效及毒副作用风险预测提供可靠的实验证据,指导临床治疗选择。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域,更具体的,本发明涉及一组检测糖皮质激素治疗疗效及毒副作用风险SNP位点基因型的试剂盒,通过同时检测糖皮质激素疗效性及毒副作用风险密切相关的MIF(-173G>C),PAI-1(4G/5G),ABCB1(3435T>C)的单核苷酸多态性位点(SNP)基因型来评估使用糖皮质激素治疗的有效性及毒副作用风险。
背景技术
糖皮质激素属于类固醇激素,因其强大的抗炎作用,被广泛应用于抑制免疫***的过度活动,治疗过敏、哮喘、自身免疫疾病及败血症等疾病,其除了具有多种治疗效应外,还包括潜在的多种有害的副作用。
目前研究表明糖皮质激素的使用是非创伤性股骨头坏死(ONFH)的重要病因之一。类固醇诱导的非创伤性股骨头坏死是一种医源性疾病,在类固醇给药期间的非常早期即可发病。该疾病患者关节软骨和股骨头的坏死,导致很难保留股骨头,患者最终往往需要接受全髋关节置换术。腺苷三磷酸结合盒B1(ABCB1)基因位于7号染色体q21上,该基因编码的P-糖蛋白(P-gp)活性的增加可降低类固醇诱导ONFH的风险。其中,3435位的SNP多态性(C3435T,rs1045642)显得尤为重要,与ABCB1基因的表达和功能相关。rs1045642SNP与P-gp表达的降低有关。ABCB1基因中的rs1045642SNP可能是糖皮质激素诱导的骨坏死的危险因素。
类固醇的使用可增加PAI-1在mRNA和蛋白水平的表达,抑制PAI-1分泌对类固醇诱导的ONFH的预防作用。PAI-1基因4G/5G多态性与ONFH的风险增加相关。PAI-1基因4G基因型(rs1799889)与ONFH风险相关。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是一种多效性细胞因子,具有促炎、化学趋化、促进细胞存活及增殖等多种作用,与多种炎症性疾病及肿瘤性疾病相关。MIF作为糖皮质激素抗炎作用的内源性负反调节因子,在细胞因子的释放和促炎方面起着非常重要的作用。一项针对幼年特发性关节炎的研究发现,MIF基因-173G/C SNP与患者体内MIF水平,以及对关节内糖皮质激素注射的反应持续时间显著相关。MIF-173C等位基因的携带者在3个月内复发的可能性较非携带者高4倍。MIF-173C等位基因可作为代表关节内糖皮质激素治疗反应不良的预测因子。另一项发现与GC基因型和GG基因型相比,CC基因型的克罗恩病患者的糖皮质激素累计使用剂量更高。MIF(-173G>C)是糖皮质激素治疗耐受的预测指标。
发明内容
本试剂盒针对人类基因组DNA中糖皮质激素疗效及毒副作用风险的3个SNP位点,包括MIF(-173G>C),PAI-1(4G/5G)和ABCB1(3435T>C)。设计特异性引物和野生型/突变型探针,与特异报告基因的MagPlex-TAG磁珠进行杂交反应,通过显色反应在luminex 200仪器上进行检测。通过对信号值的读取判读各个SNP位点的碱基型别进行判定。
试剂盒中涉及的特异引物序列如下:
试剂盒中涉及的特异探针序列如下:
试剂盒中涉及的报告探针序列如下:
本发明提供一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的方法,所述的方法包括如下的步骤:首先进行PCR反应,实现扩增;再进行多重OLA反应,标记和连接;然后进行杂交反应,最后进行基因型的分析。
进一步的,PCR反应体系如下:2x qiagen Hotstar MM 5ul,primer mix 1ul,DNA样本2ul,灭菌水2ul;PCR反应条件为95℃、15min,进行30个循环的94℃,30秒,60℃,30秒,72℃,30秒;72℃、7分钟,4℃维持。
进一步的,多重OLA反应如下:配制2xOLA master mix,将OLA master mix与PCR反应产物混合,混匀后进行连接反应。
进一步的,配制2xOLA master mix包括有:10x Taq Ligase buffer 2ul,40000U/ml的Taq DNA Ligase 0.25ul,野生型探针mix 1ul,突变型探针mix2ul,去离子水4.75ul。
进一步的,连接反应条件如下:96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min;4℃维持。
进一步的,杂交反应的过程如下:选择相应的报告探针的磁珠,重悬,然后将每种磁珠混合,稀释最多至100u颗/ul,用2X Tm hybridization buffer,混合后加入磁珠混合物至每孔中,添加1-5ul OLA reaction和25ul dH2O至每个孔,进行PCR反应:96℃90s,37℃30min,吸走上清,用1x Tm hybridization buffer重悬磁珠,吸磁30-60s,再次吸走上清,重复用1x Tm hybridization buffer重悬磁珠,吸磁30-60s,第三次吸走上清,用1x Tmhybridization buffer重悬磁珠,在37℃温育15min,加入50ul反应产物至LUMINEX中分析。
或者,
杂交反应的过程如下:1、选择磁珠,并重悬;2、将每种磁珠混合,并稀释至100u颗/ul,用2X Tm hybridization buffer,振荡混合;3、加入磁珠混合物至每孔中;4、添加样品至每孔中;5、进行PCR反应:96℃90s,37℃30min;6、准备6ug/ml SAPE在1x hybridizationbuffer;7、添加100ul SAPE mix,混匀;8、37℃温育15min;9、加入100ul至37℃的luminex中分析。
本发明针对服用糖皮质激素患者疗效及毒副作用风险相关的3个基因SNP位点设计特异引物和探针和报告探针,可分型检测3个SNP位点的型别。本发明提供的检测试剂盒可以灵敏、快速低检测人全血样本中3个SNP型别,可为甲氨蝶呤用药疗效及毒副作用风险预测提供可靠的实验证据,指导临床治疗选择。
具体实施方式
实施例1
本发明提供一种试剂盒,所述的试剂盒包括有如下序列的引物:
所述的试剂盒还包括特异探针,所述的特异探针序列如下:
所述的试剂盒还包括报告探针,所述的报告探针序列如下:
实施例2
3个SNP位点在同一管进行PCR反应,反应的体系为总体积10μl,包含2xqiagenHotstar MM 5ul,primer mix 1ul,DNA样本2ul,灭菌水2ul。
在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应,反应条件为95℃、15min,进行30个循环的94℃,30秒,60℃,30秒,72℃,30秒;72℃、7分钟,4℃维持。
多重OLA反应:配制2xOLA master mix:10x Taq Ligase buffer 2ul,Taq DNALigase(40,000U/ml)0.25ul,野生型探针mix(100nM each)1ul,突变型探针mix(2.5uMeach)2ul,去离子水4.75ul。将OLA master mix与反应产物混合:2xOLA master mix 10ul,扩增的PCR产物5ul,灭菌去离子水5ul。上下吹打混匀,盖上反应管,进行在ABI9700型PCR扩增仪上连接反应。96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min;4℃维持。
杂交反应-洗涤程序:选择相应报告探针的MagPlex-TAG磁珠,并重悬,将每种磁珠混合,并稀释至100u颗/ul,用2X Tm hybridization buffer,振荡混合20s;加入25ul磁珠混合物至每孔中(应该提供2500颗珠子/每种反应)。添加1-5ul OLA reaction和25ul dH2O至每个孔,调整H2O的体积,使总体积接近50ul。盖上盖子,进行PCR反应:96℃90s,37℃30min。放于磁力板中30s-60s,使磁珠吸住,小心吸走上清,别吸走磁珠;用1x Tmhybridization buffer 75ul,重悬MagPlex-TAG磁珠,吸磁30-60s,小心吸走上清,别吸走磁珠;重复用1x Tm hybridization buffer 75ul,重悬MagPlex-TAG磁珠,吸磁30-60s,小心吸走上清;用75ul 1x Tm hybridization buffer(包含2-8ug/mlSAPE),重悬磁珠,在37℃温育15min。在37℃中,加入50ul反应产物至LUMINEX中分析。
或者,
杂交反应-不洗涤程序:1.选择合适的MagPlex-TAG磁珠,并重悬;2.将每种磁珠混合,并稀释至100u颗/ul,用2X Tm hybridization buffer,振荡混合20s;3.加入20ul磁珠混合物至每孔中(应该提供2500颗珠子/每种反应)。4.添加5uL样品至每孔中;5.关上盖子,进行PCR反应,PCR反应:96℃90s,37℃30min;6.准备6ug/ml SAPE在1x hybridizationbuffer;7.添加100ul SAPE mix,轻柔混匀;8.37℃温育15min;9.加入100ul至37℃的luminex中分析。
结果分析
通过质粒及水对照,获得背景信号,检测样本结果时,减去背景后,数值大于200即为阳性反应。
检测报告中会提供3个SNP型别结果,检测MIF(-173G>C)基因rs755622突变型对应的结果显示为CC,杂合型对应的结果显示为CT,野生型对应的结果显示为TT。MTHFR基因677T(rs1801133)突变型对应的结果显示为TT,杂合型对应的结果显示为CT,野生型对应的结果显示为CC。MTHFR基因1298C(rs1801131)突变型对应的结果显示为CC,杂合型对应的结果显示为AC,野生型对应的结果显示为AA。
Claims (10)
1.一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括有如下序列的引物:
2.如权利要求1所述的一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括特异探针,所述的特异探针序列如下:
3.如权利要求1所述的糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括报告探针,所述的报告探针序列如下:
4.一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的方法,其特征在于,所述的方法包括如下的步骤:首先进行PCR反应,实现扩增;再进行多重OLA反应,标记和连接;然后进行杂交反应,最后进行基因型的分析。
5.如权利要求4所述的一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的方法,其特征在于,PCR反应体系如下:2x qiagen Hotstar MM 5ul,primer mix 1ul,DNA样本2ul,灭菌水2ul;PCR反应条件为95℃、15min,进行30个循环的94℃,30秒,60℃,30秒,72℃,30秒;72℃、7分钟,4℃维持。
6.如权利要求4所述的一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的方法,其特征在于,多重OLA反应如下:配制2xOLA master mix,将OLA master mix与PCR反应产物混合,混匀后进行连接反应。
7.如权利要求6所述的一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的方法,其特征在于,配制2xOLA master mix包括有:10x Taq Ligase buffer 2ul,40000U/ml的Taq DNA Ligase0.25ul,野生型探针mix 1ul,突变型探针mix 2ul,去离子水4.75ul。
8.如权利要求6所述的一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的方法,其特征在于,连接反应条件如下:96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min;4℃维持。
9.如权利要求4所述的一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的方法,其特征在于,杂交反应的洗涤程序过程如下:选择相应的报告探针的磁珠,重悬,然后将每种磁珠混合,稀释最多至100u颗/ul,用2X Tm hybridization buffer,混合后加入磁珠混合物至每孔中,添加1-5ul OLA reaction和25ul dH2O至每个孔,进行PCR反应:96℃90s,37℃30min,吸走上清,用1x Tm hybridization buffer重悬磁珠,吸磁30-60s,再次吸走上清,重复用1x Tmhybridization buffer重悬磁珠,吸磁30-60s,第三次吸走上清,用1x Tm hybridizationbuffer重悬磁珠,在37℃温育15min,加入50ul反应产物至LUMINEX中分析。
10.如权利要求4所述的一种糖皮质激素疗效预测SNP位点检测的方法,其特征在于,杂交反应的不洗涤程序过程如下:1、选择磁珠,并重悬;2、将每种磁珠混合,并稀释至100u颗/ul,用2X Tm hybridization buffer,振荡混合;3、加入磁珠混合物至每孔中;4、添加样品至每孔中;5、进行PCR反应:96℃90s,37℃30min;6、准备6ug/ml SAPE在1x hybridizationbuffer;7、添加100ul SAPE mix,混匀;8、37℃温育15min;9、加入100ul至37℃的luminex中分析。
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