CN108004270B - 利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法 - Google Patents

利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN‑β启动子活性的方法，包括以下步骤：A、构建含鸭IFN‑β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒；B、将含鸭IFN‑β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒与刺激物、内参质粒及脂质体预混后转染目标细胞；所述内参质粒为海参荧光素酶质粒；C、将转染后的目标细胞进行培养后裂解，检测荧光素酶活性，即得鸭IFN‑β启动子活性。该方法操作简单易行，通量高，且具有较高的可重复性和准确度，为研究鸭IFN‑β通路提供了有效的检测工具。

Description

利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法
技术领域
本发明涉及分子遗传学及细胞生物技术领域，具体涉及一种双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法。
背景技术
鸭是主要的家禽养殖物种，近年来受高致病性禽流感的影响，给养殖户带来巨大的损失，同时对公共安全也产生了严重的威胁。干扰素(Interferon，IFN)具有抗病毒、抗肿瘤活性及强大的免疫调节作用，对于禽类的先天性免疫及触发适应性免疫十分重要。根据IFN氨基酸序列和其特异性识别受体的不同，将IFN分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，β干扰素(IFN-β)属于Ⅰ型IFN。IFN-β是由微生物、dsRNA和病毒等干扰素诱生剂刺激细胞后所产生的高活性多功能蛋白，抗病毒活性强，具有广谱的抑制病毒、抗肿瘤、调节免疫力和激素刺激等生物学活性，在细胞因子基础和临床研究中具有重要价值。
目前为止，由于IFN-β具有很强的疏水性，一直没有可靠稳定的色谱方法对其进行准确定量分析。当前IFN活性检测方法主要有：抗病毒活性检测方法，常用水泡性口炎病毒(VSV)进行检测，但该方法敏感性和准确率较低，且具有一定生物安全危险性；ELISA检测方法，检测方便快捷，但局限于检测IFN的抗原性，且不同IFN需要不同的单抗，通用性低；荧光定量PCR检测方法，该方法是在提取宿主细胞mRNA的基础上进行，但RNA极不稳定，对检测结果的准确性有一定影响。因此建立一种适用范围广，精确率高的检测方法对IFN的研究具有重要意义。
启动子是真核基因转录起始位点上游一段长度不等的特异性序列，该片段有多种调节因子的结合位点，能顺式调控基因的转录。因此可以通过检测启动子的激活程度间接定量IFN-β的表达量。双荧光素酶报告基因检测***具有检测快速、灵敏度高、线性范围广且在大多数哺乳动物细胞无内源性表达等诸多优点。本方法将鸭IFN-β的启动子片段***带有萤火虫荧光素酶基因的报告质粒，若启动子被激活，则其下游的萤火虫荧光素酶表达，通过对荧光素酶的检测来确定目的基因的表达情况。该检测方法的建立，为后续鸭先天性免疫信号通路的研究提供了有效的工具。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法。本发明充分利用双荧光素酶报告基因检测***，将鸭IFN-β启动子***萤火虫荧光素酶报告质粒，通过检测荧光素酶的表达量表征启动子的激活情况，从而达到对IFN-β表达量的检测，是一种便捷快速、灵敏性高且重复性好的鸭IFN-β检测方法。该检测方法的建立，为后续鸭先天性免疫信号通路的研究提供了有效的工具。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、构建含鸭IFN-β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒；
B、将含鸭IFN-β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒与刺激物、内参质粒及脂质体预混后转染鸭胚成纤维细胞DEF,所述内参质粒为海参荧光素酶质粒；
C、将转染后的DEF细胞进行培养后裂解，检测荧光素酶活性，即得鸭IFN-β启动子活性。
优选地，步骤A的构建方法包括以下步骤：将鸭IFN-β启动子靶序列连接至萤火虫荧光素酶报告质粒上，从而构建了含鸭IFN-β启动子不同区域的萤火虫荧光素酶重组质粒。
优选地，所述鸭IFN-β靶序列选自IFN-β启动子区域-1530位和-390位至第一外显子+63位形成的2个片段中的任意一个片段序列。
优选地，获得所述鸭IFN-β启动子靶序列采用的引物包括：上游引物，SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2所示的序列中的任意一个序列；下游引物，SEQ ID No.3所示的序列。
3条引物分别为：
上游引物P1(SEQ ID No.1)：
CGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCATTGCACAAAGTATAATC；
上游引物P2(SEQ ID No.2)：
CGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCCTAAAACACTTCTGCAGC；
通用下游引物(SEQ ID No.3)：
GCTTACTTAGATCGCAGATCTCATGGTGGCTCTTGGGTTG。
优选地，获得所述鸭IFN-β启动子靶序列采用的PCR扩增的反应条件为：变性98℃10s、退火58℃ 15s、延伸68℃ 1min，30个循环，终延伸68℃ 5min。
优选地，步骤B中，所述刺激物包括RIG-I、poly(I:C)或dsDNA中的至少一种。
优选地，步骤B中，所述转染细胞采用的脂质体的转染量为1μL/孔。
优选地，步骤C中，所述培养时间为20小时。
优选地，所述转染前将生长状态良好的DEF细胞以每孔2×105个细胞密度接种于24孔板，待细胞单层长至密度约为90％时进行质粒转染；转染时将培养基更换为10％FBS的DMEM(无双抗)，每孔400μL，用DMEM将脂质体及萤火虫荧光素酶重组质粒、刺激物预混至100μL，常温孵育20分钟后均匀滴加入每孔。转染6小时后换为10％FBS的DMEM(无双抗)，于转染后20小时测荧光。
启动子是真核基因转录起始位点上游一段长度不等的特异性序列，该片段有多种调节因子的结合位点，能顺式调控基因的转录。因此可以通过检测启动子的激活程度间接定量IFN-β的表达量。双荧光素酶报告基因检测***具有检测快速、灵敏度高、线性范围广且在大多数哺乳动物细胞无内源性表达等诸多优点。本方法将鸭IFN-β的启动子片段***带有萤火虫荧光素酶基因的报告质粒上，若启动子被激活，则其下游的荧光素酶表达，通过对荧光素酶的检测来确定目的基因的表达情况。该检测方法的建立，为后续鸭先天性免疫信号通路的研究提供了有效的工具。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1.本发明将包含鸭IFN-β启动子1530bp，第一外显子63bp的片段连接至萤火虫荧光素酶报告质粒构建了pGL-IFN-β-1593重组质粒，与不同刺激物共转染DEF，荧光素酶的表达量均显著，且在不同的刺激物下表达量不同，表明可以利用此重组质粒定量检测在不同条件、不同刺激下对IFN-β表达水平的影响。
2.本发明将鸭IFN-β启动子截短至-390位至+63位的片段连接至萤火虫荧光素酶报告质粒构建了pGL-IFN-β-453重组质粒，结果显示与全长构建的pGL-IFN-β-1593重组质粒具有相同检测活性，因此在后续研究中可运用该截短片段构建的重组质粒检测IFN-β的表达水平，不仅可以达到较高的准确率，同时还可降低整个重组质粒的碱基数，除去冗余碱基的影响。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明所述的萤火虫荧光素酶重组质粒的构建图；
图2为本发明中2个不同长度的鸭IFN-β启动子片段PCR产物的电泳示意图；
图3为本发明中确认最佳脂质体转染量的细胞显微镜图；其中，左侧第一列为10倍物镜下蓝色光激发的绿色荧光视野，发光斑块代表荧光蛋白在细胞内表达，第二列为同一视野下的白光；第三列为20倍物镜下蓝色光激发的绿色荧光视野，第四列为同一视野下的白光；第一排至第四排分别是脂质体转染量为0.5μL/孔、1μL/孔、2μL/孔以及4μL/孔；
图4为本发明中构建的2个含靶片段的萤火虫荧光素酶重组质粒在过表达免疫分子RIG-I、双链RNA类似物poly(I:C)或dsDNA pCAGGS刺激下检测到的IFN-β启动子激活情况示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明的实施例：以双荧光素酶报告基因检测DEF在过表达免疫分子RIG-I、双链RNA类似物poly(I:C)或dsDNA pCAGGS刺激下IFN-β启动子的活性。
实施例1
1.1材料
实验鸭胚购自上海凌华绿头鸭养殖合作社；绿色荧光质粒pCDNA-GFP在文献“Cheng Y,Sun Y,Wang H,et al.Chicken STING Mediates Activation of the IFN GeneIndependently of the RIG-I Gene[J].Journal of Immunology,2015,195(8):3922-3936”中公开过，公众可从上海交通大学获得，dsDNA质粒pCAGGS及RIG-I真核表达质粒pCAGGS-RIG-I在文献“Y Cheng，Q Huang，W Ji,et al.Muscovy duck retinoic acid-induced gene I(MdRIG-I)functions in innate immunity against H9N2avianinfluenza viruses(AIV)infection[J].Veterinary Immunology&Immunopathology,2015,163(3-4):183”中公开过，公众可从上海交通大学获得；Trans5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；萤火虫荧光素酶报告质粒(pGL3.0)、海肾荧光素酶报告质粒(pRL-TK)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒均购自promega公司；去内毒素质粒提取试剂盒、组织DNA提取试剂盒购自OMEGA公司；PrimeSTAR GXL、连接酶、限制性内切酶Nhe I、BglⅡ及胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；脂质体转染试剂购自上海翊圣生物科技有限公司；poly(I:C)购自Invivogen公司；高糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、0.25％胰酶均为GIBCO公司产品；引物合成及测序由北京六合华大基因科技有限公司上海分公司完成。
1.2鸭IFN-β基因启动子PCR扩增
按照组织DNA提取试剂盒说明书从鸭气管组织中提取鸭基因组DNA，于-20℃保存。根据GenBank上已公布的鸭IFN-β基因启动子序列(登录号：KM032183.1)设计3条引物分别用于扩增IFN-β启动子区域-1530位和-390位至第一外显子+63位片段，引物序列见表1。其中上游引入Nhe I酶切位点，下游引入BglⅡ酶切位点(下划线为酶切位点)。以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：PrimeSTAR GXL 1.5μL、5×buffer 10μL、dNTP 4μL、DNA模板1μL、上游引物2μL、下游引物2μL、ddH2O 29.5μL，总体积50μL；PCR程序：变性98℃10s、退火58℃ 15s、延伸68℃ 1min、终延伸68℃5min，30个循环。产物经1％琼脂糖检测后切胶回收于-20℃保存待用。2种PCR产物的电泳示意图如图2所示，其中泳道1为采用引物IFN-β-1530U和IFN-β+63L扩增得到的PCR产物，片段大小为1593bp；泳道2为采用引物IFN-β-390U和IFN-β+63L扩增得到的PCR产物，片段大小为453bp。
表1文中所用引物
引物名称 引物序列(5’-3’) 目的片段长度/bp
IFN-β-1530U CGAGCTCTTACGCGT<u>GCTAGC</u>CATTGCACAAAGTATAATC 1593
IFN-β-390U CGAGCTCTTACGCGT<u>GCTAGC</u>CCTAAAACACTTCTGCAGC 453
IFN-β+63L GCTTACTTAGATCGC<u>AGATCT</u>CATGGTGGCTCTTGGGTTG -
1.3鸭胚成纤维细胞的制备
取11日龄鸭胚用PBS洗净去除残留血液及胚液，去掉头颈四肢，剪碎后以胰酶消化，将消化物用5倍体积的高糖DMEM培养基轻轻浸洗2-3次，至悬液清亮，经四层纱布过滤后3000rpm离心3min，去上清后保留底部细胞，以10％FBS-DMEM培养基重悬，转移至细胞瓶，置于37℃恒温培养箱培养。4-6小时后于显微镜下观察其贴壁情况。
1.4鸭胚成纤维细胞转染条件摸索
按照脂质体核酸转染试剂说明书转染细胞。转染前将生长状态良好的DEF细胞以每孔2×105个细胞密度接种于24孔板，待细胞单层长至密度约为90％时进行质粒转染。转染前，将培养基更换为10％FBS的无双抗DMEM，每孔400μL，用DMEM分别将0.5μL、1μL、2μL以及4μL的脂质体与0.5μg绿色荧光质粒pCDNA-GFP预混至100μL，常温孵育20分钟后均匀滴加入每孔。转染6小时后换为10％FBS的DMEM(无双抗)，转染后20小时显微镜下观察拍照。如图3所示，左侧第一列为10倍物镜下蓝色光激发的绿色荧光视野，发光斑块代表荧光蛋白在细胞内表达，第二列为同一视野下的白光，第三列为20倍物镜下蓝色光激发的绿色荧光视野，第四列为同一视野下的白光；第一排至第四排分别是脂质体转染量为0.5μL/孔、1μL/孔、2μL/孔以及4μL/孔。
1.5萤火虫荧光素酶重组质粒的构建及鉴定
将上述1.2的回收片段与pGL3.0质粒经Nhe I、Bgl Ⅱ双酶切处理后按照连接酶说明书进行连接，分别构建重组质粒pGL-IFN-β-1593和pGL-IFN-β-453，转化Trans5α感受态细胞、测序正确后按照去内毒素质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
1.6重组质粒瞬时转染细胞
按照1.4中的方法，用DMEM将0.2μg萤火虫荧光素酶重组质粒或空质粒PGL3.0、0.05μg pRL-TK(内参)、1μL脂质体与0.3μg pCAGGS-RIG-I或pCAGGS或0.1μL poly(I:C)预混至100μL，常温孵育20min后均匀滴加入每孔。每孔设置3个重复。于37℃，5％CO2培养箱中培养。6h后更换为10％FBS的无双抗DMEM，并将poly(I:C)刺激组用promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒收集细胞，测荧光值。其余组在20h后测荧光值。
1.7结果
在确认最佳脂质体转染量中，如图3所示，从白光下可以发现细胞状态随着脂质体的量增加而越多凋亡，在绿色荧光视野下发现脂质体的量在1μL/孔时，荧光强度最强，且细胞状态较好。确定了后续实验的脂质体的量为1μL/孔。
将1.5构建的2种重组质粒分别转染DEF细胞，并分别以过表达RIG-I、poly(I:C)或dsDNA为刺激物来检测启动子激活情况，如图4所示，结果显示在三种不同刺激物作用下，以pGL-IFN-β-1593重组质粒荧光素酶的表达量为例，均与空质粒PGL3.0转染组差异极显著(P<0.01)。其中在过表达免疫分子RIG-I的刺激下pGL-IFN-β-1593重组质粒荧光素酶的表达量是空质粒转染组的280倍，在双链RNA类似物poly(I:C)的刺激下是空质粒转染组的380倍，在dsDNA刺激下是空质粒转染组的14倍。pGL-IFN-β-453重组质粒结果显示与全长构建的pGL-IFN-β-1593重组质粒具有相同检测活性，因此在后续研究中可运用该片段构建的重组质粒检测IFN-β的表达水平。
该实施方法成功的检测了免疫分子RIG-I、双链RNA类似物poly(I:C)或dsDNA在IFN-β信号通路中对激活IFN-β的激活作用。因此可利用本发明定量检测不同条件下IFN-β的表达水平，是研究鸭IFN-β免疫通路的基本工具。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学
<120> 利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法
<130> DAG34063
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 1
cgagctctta cgcgtgctag ccattgcaca aagtataatc 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 2
cgagctctta cgcgtgctag ccctaaaaca cttctgcagc 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 3
gcttacttag atcgcagatc tcatggtggc tcttgggttg 40

Claims (5)

1.一种利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、构建含鸭IFN-β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒；
B、将含鸭IFN-β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒与刺激物、内参质粒及脂质体预混后转染鸭胚成纤维细胞DEF，所述内参质粒为海参荧光素酶质粒；
C、将转染后的DEF细胞进行培养后裂解，检测荧光素酶活性，即得鸭IFN-β启动子活性；
步骤A的构建方法包括以下步骤：将鸭IFN-β启动子靶序列连接至萤火虫荧光素酶报告质粒上；
所述鸭IFN-β启动子靶序列为鸭IFN-β启动子区域-324位至第一外显子+63位形成的片段序列；
所述鸭IFN-β基因启动子序列的GenBank登录号为KM032183.1；
获得所述鸭IFN-β启动子靶序列采用的上游引物的序列如SEQ ID No.2所示；下游引物的序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，获得所述鸭IFN-β启动子靶序列采用的PCR扩增的反应条件为：变性 98℃ 10s、退火 58℃ 15s、延伸 68℃ 1min，30个循环，终延伸 68℃ 5min。
3.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，步骤B中，所述刺激物包括RIG-I、poly(I:C) 或dsDNA中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，步骤B中，所述转染细胞采用的脂质体的转染量为1μL/孔。
5.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，步骤C中，所述培养时间为20小时。
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