CN108003240B - 一种海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，包括将海水养殖鱼致病菌灭活后免疫小鼠与家兔；使用6种兔抗病原血清混合后免疫产蛋鸡；筛选产蛋鸡，收集、精制纯化获得抗独特型卵黄抗体粗品与海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗。其中，所述海水养殖鱼致病菌为鳗弧菌，爱德华氏菌，溶藻弧菌，副溶血弧菌，创伤弧菌，链球菌。本发明多联抗独特型卵黄抗体疫苗，可以增强海水鱼对多种鱼病的抵抗力，对多种海水鱼病进行预防；还能通过口服途径免疫接种海水鱼；制备抗独特型卵黄抗体简便易行、取材容易，无菌化处理方便，制备程序简便，成本低，产量高，符合国家节能环保，可持续发展的政策导向。

Description

一种海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于水产疫苗领域，具体涉及一种海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗及其制备方法。

背景技术

我国是海水养殖鱼产量最大的国家，每年养殖海鱼的数量达70亿尾。随着养殖密度的增加，水环境不断恶化，病害也日渐严重，每年因病害死亡的海水养殖动物给国家造成一百多亿的经济损失。危害我国海水养殖动物的病害主要为细菌病和病毒病。细菌病如鳗弧菌，爱德华氏菌，副溶血弧菌，创伤弧菌，链球菌，溶藻弧菌；病毒病如虹彩病毒，虾白斑病毒及神经坏死病毒等，它们是导致海水养殖动物大批死亡的元凶。

一直以来，用于应对海水养殖动物疾病的手段主要有大量使用抗生素和化学药物，但是这些药物的长期大量使用，已经引起严重的抗药耐药，环境污染及药物残留，最终通过食物链危害人类的健康。所以许多国家及我国政府正逐渐禁止使用抗生素和化学药物来对海水养殖动物进行防病治病，一大批抗生素及化学药物已被许多国家及我国政府列入海水养殖动物违禁药物名单。

疫苗及生物制剂符合对环境无污染，无耐药，无残留等特点，已成为当今世界水生动物疾病防控的主流产品。目前全世界获得生产批文的水产养殖动物疫苗已有100多种，但大多数都是传统的灭活疫苗和减毒活疫苗，这些疫苗的主要缺陷是毒副作用不能完全避免。我国迄今获得批文的鱼用疫苗仅有三个产品：草鱼出血病活疫苗，爱德华氏菌减毒活疫苗，和牙鲆鱼多联抗独特型抗体疫苗。然而迄今国内外均没有抗独特型卵黄抗体疫苗的报道，

现有灭活疫苗及减毒活疫苗的制备方案是：首先用发酵罐或其它方法大量扩增繁殖病原(病菌或病毒)，然后用化学或物理方法对其进行灭活或减少其活性，即成灭活疫苗或减毒活疫苗。这种疫苗的主要缺点是灭活或减毒方法只能消除或减低病原体的生长活性，但不能消除病原本身含有的内外毒素，处理不当很容易产生毒副作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)、将海水养殖鱼致病菌半数致死量浓度的菌液，灭活后加入佐剂免疫小鼠与家兔；

2)、分别收集小鼠与家兔的血清，使用6种兔抗病原血清混合后加入佐剂免疫产蛋鸡；

3)、筛选产蛋鸡，使用间接ELISA法检测高免鸡所产鸡蛋，将含有六种病原菌的抗独特型卵黄抗体且效价在10^-4以上，列为采蛋鸡；

4)、收集产蛋鸡的鸡蛋、分离卵黄、破碎去除杂蛋白，沉淀分层取上清，进一步去除脂蛋白与脂肪后获得抗独特型卵黄抗体粗品；

5)纯化抗独特型卵黄抗体粗品即得海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗。

优选地，本发明所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法中，所述步骤1)中的海水养殖鱼致病菌为鳗弧菌，爱德华氏菌，溶藻弧菌，副溶血弧菌，创伤弧菌，链球菌。

优选地，本发明所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法中，所述步骤1)中免疫小鼠与家兔的方法为腹腔注射或皮下注射，免疫次数为免疫3～4次，每次间隔7～10天；更优选地，所述小鼠每次免疫的灭活菌量为0.25×10⁴～0.25×10⁵。所述家兔免疫的灭活菌量为0.5×10⁴～0.5×10⁵；最优选地，所述免疫小鼠或家兔的血清抗体效价达到10^-4。

优选地，本发明所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法中，所述步骤2)中产蛋鸡的免疫方法为肌肉注射，免疫量0.5ml，抗体含量为10～50μg；每隔7～10天免疫1次，共免疫3次。

优选地，本发明所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法中，所述步骤3)筛选产蛋鸡，使用间接ELISA法检测高免鸡所产鸡蛋，是否含有六种病原菌的抗独特型卵黄抗体且效价均在10^-4以上。

优选地，本发明所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法中，所述步骤3)中所述蛋黄组织破碎方法为：用高压均质机进行卵黄组织破碎，破碎后加蒸馏水搅拌均匀。

优选地，本发明所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法中，所述步骤3)中杂蛋白去除方法为将卵黄溶液的pH值调至脂蛋白的等电点，沉淀静置取上清，底部浑浊部分放入离心取上清，合并上清后微孔过滤进一步去除脂蛋白和脂肪，取滤液，该滤液为抗独特型卵黄抗体粗制品。

优选地，本发明所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法中，所述步骤3)中抗独特型抗体粗品的纯化方法为有机溶剂沉淀离心，取沉淀物；反复处理1～2次取沉淀，干燥或加适量蒸馏水使其沉淀物溶解，即得精制海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗。

本发明还提供了上述方法获得的海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体或海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明制备一种多联(针对六种以上海水鱼病)抗独特型卵黄抗体疫苗，用以接种免疫海水养殖鱼，以增强海水鱼对多种鱼病的抵抗力，对多种海水鱼病进行预防。目前关于鱼病疫苗报道较多，但大多数为灭活疫苗，减毒活疫苗。国内有草鱼出血病活疫苗，多宝鱼迟缓爱德华菌减毒活疫苗，牙鲆鱼多联抗独特型单克隆抗体疫苗的报道。但迄今国内外未见鱼用抗独特型卵黄抗体疫苗的报道。

2.抗独特型卵黄抗体疫苗，除了通过注射，浸泡途径免疫海水鱼外，还能将其喷洒到饵料上通过口服途径免疫海水养殖鱼，通过口服途径免疫接种海水鱼，省时省力，免疫过程无须对养殖鱼进行任何翻动，不给养殖鱼带来任何伤害。不同鱼种，不同鱼龄均可方便使用。通过口服途径接种免疫的鱼用疫苗迄今国内外均未见报道。

3.在筛选抗独特型卵黄抗体时，无须杀生，无须抽血，只需采集高免鸡的鸡蛋，节约资源，简便易行。

4.制备海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗，一个生产流程生产的疫苗能同时预防多种海水鱼病，起到一举多得，节源增效的效果。制备抗独特型卵黄抗体疫苗，资源丰富，取材容易，无菌化处理方便，制备程序简便，成本低，产量高。符合国家节能环保，可持续发展的政策导向。

具体实施方式

本发明所涉及的菌种来源及编号表

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.海水鱼病免疫原的制备

根据我国近海致病菌的调查研究报告，我国沿海主要致病菌有鳗弧菌，爱德华氏菌，溶藻弧菌，副溶血弧菌，创伤弧菌，链球菌。从国际，国内细胞库购入以上海水鱼致病菌的标准菌株，将其扩增培养，测毒，分别计算出每种病原菌的半数致死量的浓度。六种病菌的半数致死量为1×10⁴～1×10⁵/ml。

2.海水鱼病抗体的制备

免疫：将各种病原菌半数致死量浓度的菌液，经甲醛固定液固定灭活，和弗氏不完全佐剂体积1：1混合后分别免疫小鼠和家兔，小鼠每只腹腔注射免疫0.5ml免疫原，家兔每只皮下注射免疫1ml免疫原，共免疫3～4次，每次间隔7～10天，每只小鼠每次免疫的灭活菌量为0.25×10⁴～0.25×10⁵。家兔每次免疫灭活菌量为0.5×10⁴～0.5×10⁵。

抗体效价检测：第二次免疫后第3～5天，分别采集各小鼠和家兔的血液(小鼠剪尾取血，家兔从耳静脉抽血)，离心取血清，用ELISA法检测血清中每种病原菌抗体及效价。如果抗体效价达到10^-4以上的小鼠和家兔，第三次免疫后第七天放血收取血清。如果抗体效价达不到10^-4，则进行第四次免疫，或者淘汰，换新的动物重新免疫。

收取抗体及保存：抗体效价达到10^-4的小鼠和家兔，即可放血收取血清。小鼠通过断颈髓后摘眼球放血。家兔通过颈动脉插管放血。离心后取血清。分装后置-25℃冰箱保存。每种病原菌都制备两种抗血清，一种是小鼠抗病原菌血清(用于抗独特型卵黄抗体及其产蛋鸡的初筛)，另一种为兔抗病原血清(作为抗独特型抗体制备的免疫原)。

3.海水鱼病抗独特型卵黄抗体的制备

免疫原的制备：将6种兔抗海水鱼病原体的抗体(抗体效价为10^-4)等体积混合，再和等体积的弗氏不完全佐剂混合后，肌肉注射免疫产蛋鸡，每只产蛋鸡注射0.5ml，含每种病原菌抗体的量约为10～50μg。每隔7～10天免疫一次，共免疫三次。

产蛋鸡的筛选：第二次免疫后第3～5天，采集产蛋鸡当天产的蛋，用ELISA法检测其卵黄内是否存在各种病原菌抗独特型抗体及其效价。如果卵黄内分别含有6种病原菌抗独特型抗体，而且效价均达10^-4以上，该产蛋鸡被列为采集鸡蛋制备抗独特型卵黄抗体的对象，达不到此标准的产蛋鸡则不被列为采集鸡蛋的对象。其鸡蛋照常售给客户食用，不存在食品安全问题。判断卵黄内是否含有病原菌抗独特型抗体的标准是：能否与抗原特异性的不同机体产生的抗体反应；是否能和抗原竞争结合抗原特异性的抗体；是否能诱导不同种机体产生抗原特异性的抗体。

鸡蛋的采集：符合采集鸡蛋标准的产蛋鸡，经第三次免疫后第三天开始采集鸡蛋，连续采集20天，20天后，如果还需要，再追加免疫一次，然后在继续采集20天，直到产蛋鸡被淘汰。

卵黄分离：将鸡蛋用自来水洗净，放入75％酒精浸泡10分钟杀菌消毒，捞出晾干后，传入洁净间，人工分离蛋黄。

蛋黄组织破碎：用高压均质机(60Pa)进行卵黄组织破碎。破碎后加10～40倍蒸馏水搅拌均匀。

杂蛋白去除：用盐酸和氢氧化钠溶液将卵黄溶液的PH值调至各种脂蛋白的等电点(PH5.2～6.0)，使卵黄溶液产生浑浊沉淀。将以上溶液静置4℃～8℃冰箱过夜。使卵黄溶液的杂蛋白沉淀。第二天用吸管吸取沉淀后的上清，底部浑浊部分放入3500～4000r/min离心机离心20～40分钟后取上清。将两种上清混合后经微孔过滤(孔径0.22μm)进一步去除脂蛋白和脂肪，取滤液，该滤液为抗独特型卵黄抗体粗制品。

抗独特型卵黄抗体的纯化：用有机溶剂沉淀法分离纯化抗独特型卵黄抗体，在抗独特型抗体粗提液中加冷酒精使其浓度达到50～60％，充分搅拌使其浑浊沉淀，在4000r/min离心机离心20～30min，取沉淀物。加蒸馏水恢复到原来体积，然后加冷酒精使其浓度达到25～30％，充分搅拌使其浑浊沉淀，同上进行离心，取沉淀物。再加蒸馏水使其恢复到原来体积。加酒精使其浓度达20～25％，充分搅拌，使其浑浊沉淀，同上进行离心，收取沉淀物，沉淀物在37℃温箱烤干，或加适量蒸馏水使其沉淀物溶解，即成精制海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗，收率为25～45％。

4.海鱼病多联抗独特型卵黄抗体的检测

1)抗独特型卵黄抗体含量检测：

用定量ELISA法检测本发明实施例1生产的抗独特型卵黄抗体疫苗的含量，结果显示其含量为7～8mg/ml以上。

具体程序如下：

A用包被缓冲液(0.05MpH9.6碳酸盐色被缓冲液)将卵黄抗体标准品

和本发明制备的卵黄抗体分别以2ⁿ(平方倍数)稀释至n¹²。

B将以上2倍系列稀释，共12级稀释的卵黄抗体标准品及本发明抗独特型卵黄抗体分别依序加到酶标板反应小孔内，每种12孔，每孔加100μl，置37℃孵育1小时。

C弃去小孔内的液体，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟，拍干。

D加兔抗卵黄抗体的抗体(用抗体稀释液稀释为1:1000)，每孔100μl，置37℃孵育0.5～1小时。

E重复程序C。

F加HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1:1000稀释)，每孔100μl，置37℃

孵育0.5～1小时。

G重复程序C。

H加显色剂(含0.045％过氧化氢和10～20mg邻苯二安的PH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲剂)，每孔100μl，在常温避光下显色15～20分钟。

I在ELISA检测仪上，于490nm被长处，空白对照组调零后，测各孔OD值，若待测孔OD值大于或等于对照孔2.1倍即为阳性，阴性对照孔无色。

检测结果如表1：

表1本发明抗独特型卵黄抗体不同稀释度的OD值表

注：标准品液的原始浓度为1mg/ml。

K结果：卵黄抗体标准品和本发明制备抗独特型卵黄抗体各级稀释度的OD值如表1，通过曲线专家软件绘制标准曲线，R值达到0.98以上，本发明产品中抗独特型卵黄抗体含量为7～8mg/ml。

2)抗独特型卵黄抗体效价检测

用间接ELISA法，检测本发明生产的抗独特型卵黄抗体的效价，结果显示其效价为1×10^-4～1×10^-5。

具体程序如下:

A用包被缓冲液(0.05MpH9.6碳酸盐色被缓冲液)将六种小鼠抗海水

病原菌抗体进行1:1000稀释。然后分别加到酶标板小孔内，每种抗体加10个小孔，每孔100μl，置37℃孵育1～2小时。

B弃去小孔内的小鼠抗病原菌抗体，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

C用抗体稀释液对本发明的抗独特型抗体进行10倍系列稀释(10ⁿ)，一直稀释10级(10¹⁰)。将不同稀释度抗独特型卵黄抗体依序加到酶标板小孔内，每级稀释度加6孔(与六种病原菌小鼠抗体相对应)，10级稀释度共加60个小孔，每孔100μl，置37℃孵育0.5～1小时。

D重复B程序。

E加兔抗卵黄抗体的抗体(用抗体稀释液稀释1:1000)，每孔100μl，置37℃孵育0.5～1小时。

F重复B程序。

G加HRP标记的单抗兔IgG抗体(1:1000稀释)，每孔100μl，置37℃孵育0.5～1小时。

H重复B程序。

I加显示剂(含0.045％过氧化氢液体和10～20mg邻苯二胺的PH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液)每孔100μl，在常温避光显色15～20分钟。

J加终止液(10.6％硫酸溶液)，每孔50μl。

K在ELISA检测仪上，于490nm波长处，空白对照调零后，测各孔OD值，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔2.1倍即为阳性。

多联抗独特型卵黄抗体中各联抗独特型抗体的效价如下表

表2本发明制备的多联抗独特型卵黄抗体中各联抗独特型抗体的效价检测结果表

结果：表2显示本发明制备的海水鱼病多联抗独特型抗体中各联抗独特型抗体的效价为10^-4～10^-5。

3)抗独特型卵黄抗体效力检测

A实验鱼：牙鲆鱼600尾，(5～7cm,4～5月龄)分成4组，各组150尾。

B免疫：

实验Ⅰ组(150尾)用腹腔注射进行疫苗接种免疫。将疫苗和不完全佐剂混合后，经腹腔注射免疫海鱼，每尾注射50μl(含疫苗量为3.75μg)。

实验Ⅱ组(150尾)，浸泡免疫，其疫苗免疫量为注射的3倍，

将1.69mg的疫苗溶解到13.5升海水中，搅匀，然后将150尾海鱼放入

含疫苗的海水中浸泡30分钟，如果一批密度过大可分2～3批进行。30

分钟后捞回池中正常饲养。

实验Ⅲ组(150尾)通过口服途径进行免疫，将疫苗溶于生理盐水中，喷洒到鱼饵料上，使饵料成半湿状态，投到水中喂鱼，免疫疫苗量和浸泡免疫相当，但分三次进行，间隔时间为一周。对照组(150尾)，不做任何处理，作对照。免疫后正常放养一个月后进行攻毒。

C毒株准备：将6种菌种扩增培养后，测毒。

测毒程序：用平皿计数法检测各株病菌原液浓度，然后以10倍系列稀释法，进行5级稀释。用不同稀释浓度级别的菌液腹腔注射攻毒海鱼(每尾注射100μl)，计算出各种病菌对海鱼的半数致死量。用各种菌的半致死量浓度对海鱼做攻毒试验。各种菌半数致死量见表3。

表3各种菌半数致死量试验结果表

结果：表3显示，六种致病菌对实验海鱼的半数致死量分别为10⁶/ml～10⁴/ml。

攻毒：用各种毒株的5倍半数致死量浓度对各级鱼进行攻毒，每组鱼20尾，每尾腹腔注射100μl，观察7天，记数各组鱼的死亡数及计算出疫苗对海鱼的保护率见表4.

表4显示，注射型疫苗对六种病菌攻毒的保护率分别为75％～85％；浸泡型疫苗对六种病菌攻毒的保护率为55％～65％；口服型疫苗对六种病菌攻毒的保护率为75％～85％。

表4攻毒法疫苗对海鱼保护率

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)、将海水养殖鱼致病菌半数致死量浓度的菌液，灭活后加入佐剂免疫小鼠与家兔，小鼠每次免疫的灭活菌量为0.25×10⁴～0.25×10⁵，家兔免疫的灭活菌量为0.5×10⁴～0.5×10⁵，使免疫小鼠或家兔的血清抗体效价达到10^-4；

2)、分别收集小鼠与家兔的血清，使用6种兔抗病原血清混合后加入佐剂免疫产蛋鸡，产蛋鸡的免疫方法为肌肉注射，免疫量0.5ml，抗体含量为10～50μg；每隔7～10天免疫1次，共免疫3次；

3)、筛选产蛋鸡，使用间接ELISA法检测高免鸡所产鸡蛋，是否含有六种病原菌的抗独特型卵黄抗体及效价；

4)收集产蛋鸡的鸡蛋、分离卵黄、破碎去除杂蛋白，沉淀分层取上清，进一步去除脂蛋白与脂肪后获得抗独特型卵黄抗体粗品；

5)纯化抗独特型卵黄抗体粗品即得海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗；

所述海水养殖鱼致病菌为溶藻弧菌编号为ATCC 33838，鳗弧菌编号为ATCC 19106，迟缓爱德华菌编号为ATCC 23657，副溶血弧菌编号为ATCC 7802T，创伤弧菌编号为ATCC33147，链球菌编号为MCCC1A10884。

2.根据权利要求1所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中免疫小鼠与家兔的方法为腹腔注射或皮下注射，免疫次数为免疫3～4次，每次间隔7～10天。

3.根据权利要求1所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤3)产蛋鸡筛选的方法为ELISA法检测高免鸡产的蛋含有6种病原菌的抗独特型抗体，且效价均在10^-4以上。

4.根据权利要求1所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中所述破碎方法为：用高压均质机进行卵黄组织破碎，破碎后加蒸馏水搅拌均匀。

5.根据权利要求1所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中杂蛋白去除方法为将卵黄溶液的pH值调至脂蛋白的等电点，沉淀静置取上清，底部浑浊部分放入离心取上清，合并上清后微孔过滤进一步去除脂蛋白和脂肪，取滤液，该滤液为抗独特型卵黄抗体粗制品。

6.根据权利要求1所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中抗独特型抗体粗品的纯化方法为有机溶剂沉淀离心，取沉淀物；反复处理1～2次取沉淀，干燥或加适量蒸馏水使其沉淀物溶解，即得精制海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗。

7.根据权利要求1～6任意一项所述的海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法获得的海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体或海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗。