CN107998396B

CN107998396B - 一种肿瘤治疗的靶点及其应用

Info

Publication number: CN107998396B
Application number: CN201610952945.2A
Authority: CN
Inventors: 唐丽; 贺福初; 柳迪; 王兴
Original assignee: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER; Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER; Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2016-11-02
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2036-11-02
Also published as: CN107998396A

Abstract

本发明公开了一种肿瘤治疗的靶点及其应用。本发明通过实验证明：LSECtin、BTN3A2及BNT3A3通过促进肿瘤细胞干性的维持促进肿瘤进程，具体体现在促进肿瘤细胞球形成、干性转录因子的表达以及小鼠肿瘤模型中对肿瘤进程的促进；抑制LSECtin与BTN3A2及BTN3A3相互作用能够有效减缓肿瘤进程，具体体现在降低肿瘤发生率和减缓肿瘤体积增长。

Description

一种肿瘤治疗的靶点及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肿瘤治疗的靶点及其应用。

背景技术

全球肿瘤发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。目前对于乳腺癌的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗及中医药辅助治疗等，困扰肿瘤治疗的根本问题在于对药物的抵抗和治愈后的复发。研究表明，抗药性以及复发的根本原因在于肿瘤细胞干性的提升。例如，以***受体(ER)、孕激素受体(PR)、表皮生长因子受体2(HER2)阴性为特征的三阴性乳腺癌往往被认为拥有更高的肿瘤干性特性。还有研究结果显示，大多数非三阴性的乳腺癌病人，往往以三阴性乳腺癌的形式复发，这是造成复发乳腺癌肿瘤具有更高抗药性、更强转移能力的原因。然而，由于三阴性乳腺癌缺乏药物靶点，目前还没有治愈三阴性乳腺癌的治疗方案。

肿瘤的干性受基因的多样性、表观遗传以及肿瘤微环境三个因素调控。由于肿瘤细胞存在高度异质性，因此，从基因多样性及表观遗传角度，很难提出行之有效的治疗方案。与之相比，肿瘤微环境浸润的免疫细胞通过交互作用对肿瘤细胞干性的维持与促进作用，因其具有较强的应用前景日益成为研究的热点。基于肿瘤免疫治疗的基本原理，针对免疫细胞对肿瘤细胞交互作用的靶向药物，有望应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，协同机体免疫***，从而抑制肿瘤的生长、转移与复发。

LSECtin(Liver Sinusoidal Endothelial Cells lectin)是Ⅱ型跨膜糖蛋白，位于人类19p13.3，是C型凝集素家族的新成员。

BTN3A2(Butyrophilin subfamily 3member A2)和BTN3A3(Butyrophilinsubfamily 3 member A3)均为Ⅰ型跨膜糖蛋白，位于人类6p22.2，是B7超家族的成员。

发明内容

本发明的一个目的是提供抑制BTN3A表达和/或活性的物质的新用途。

本发明提供了抑制BTN3A表达和/或活性的物质在制备具有如下(1)-(5)中至少一种功能的产品中的应用：

(1)治疗和/或预防肿瘤；

(2)抑制肿瘤细胞的生长；

(3)抑制肿瘤细胞干性的维持或促进；

(4)抑制肿瘤细胞干性相关特征分子的表达；

(5)抑制肿瘤细胞内部STAT3磷酸化；

所述BTN3A为如下a1)或a2)：

a1)BTN3A3；

a2)BTN3A2和BTN3A3。

上述应用中，所述抑制BTN3A表达和/或活性的物质为如下任一种：干扰BTN3A2和BTN3A3表达的RNA分子、抗LSECtin抗体、LSECtin小分子抑制剂、LSECtin可溶性蛋白、干扰LSECtin表达的RNA分子、抗BTN3A2抗体、BTN3A2小分子抑制剂、BTN3A2可溶性蛋白、干扰BTN3A2表达的RNA分子、抗BTN3A3抗体、BTN3A3小分子抑制剂、BTN3A3可溶性蛋白和干扰BTN3A3表达的RNA分子。

上述应用中，所述干扰BTN3A2和BTN3A3表达的RNA分子和所述干扰BTN3A3表达的RNA分子均为如下b1)-b4)：

b1)序列4所示的shRNA分子；

b2)将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4相同功能的核苷酸；

b3)序列5所示的shRNA分子；

b4)将序列5删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列5相同功能的核苷酸。

上述应用中，所述肿瘤细胞干性相关特征分子为Oct4基因和/或Nanog基因和/或Sox基因。

上述应用中，所述抑制肿瘤细胞的生长体现在降低肿瘤细胞的成瘤率和/或减小肿瘤细胞的体积。

上述应用中，所述产品为药品。

上述应用中，所述肿瘤为如下c1)或c2)：

c1)BTN3A3表达的肿瘤；

c2)LSECtin刺激下的且BTN3A3表达的肿瘤；

所述肿瘤具体为乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、骨巨细胞瘤、肾癌、腮腺癌。

本发明的另一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品的活性成分为抑制BTN3A表达和/或活性的物质，所述产品的用途为如下(1)-(5)中的至少一种：

(1)治疗和/或预防肿瘤；

(2)抑制肿瘤细胞的生长；

(3)抑制肿瘤细胞干性的维持或促进；

(4)抑制肿瘤细胞干性相关特征分子的表达；

(5)抑制肿瘤细胞内部STAT3磷酸化；

所述BTN3A为如下a1)或a2)：

a1)BTN3A3；

a2)BTN3A2和BTN3A3。

上述产品中，所述抑制BTN3A表达和/或活性的物质为如下任一种：干扰BTN3A2和BTN3A3表达的RNA分子、抗LSECtin抗体、LSECtin小分子抑制剂、LSECtin可溶性蛋白、干扰LSECtin表达的RNA分子、抗BTN3A2抗体、BTN3A2小分子抑制剂、BTN3A2可溶性蛋白、干扰BTN3A2表达的RNA分子、抗BTN3A3抗体、BTN3A3小分子抑制剂、BTN3A3可溶性蛋白和干扰BTN3A3表达的RNA分子。

上述产品中，所述干扰BTN3A2和BTN3A3表达的RNA分子和所述干扰BTN3A3表达的RNA分子均为如下b1)-b4)：

b1)序列4所示的shRNA分子；

b3)序列5所示的shRNA分子；

上述产品中，所述肿瘤细胞干性相关特征分子为Oct4基因和/或Nanog基因和/或Sox基因。

上述产品中，所述抑制肿瘤细胞的生长体现在降低肿瘤细胞的成瘤率和/或减小肿瘤细胞的体积。

上述产品中，所述产品为药品。

上述产品中，所述肿瘤为如下c1)或c2)：

c1)BTN3A3表达的肿瘤；

c2)LSECtin刺激下的且BTN3A3表达的肿瘤；

本发明的最后一个目的是提供BTN3A2和/或BTN3A3作为靶点的新用途。

本发明提供了BTN3A2和/或BTN3A3作为靶点在肿瘤免疫治疗中的应用。

本发明还提供了BTN3A2和/或BTN3A3作为靶点在开发或设计肿瘤免疫治疗药物中的应用。

上述应用中，所述产品为药品。

上述应用中，所述肿瘤为如下c1)或c2)：

c1)BTN3A3表达的肿瘤；

c2)LSECtin刺激下的且BTN3A3表达的肿瘤；

上述应用或产品中，

所述LSECtin为如下1)或2)：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

所述BTN3A2为如下1)或2)：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；

所述BTN3A3为如下1)或2)：

1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。

本发明通过实验证明：LSECtin、BTN3A2及BNT3A3通过促进肿瘤细胞干性的维持促进肿瘤进程，具体体现在促进肿瘤细胞球形成、干性转录因子的表达以及小鼠肿瘤模型中对肿瘤进程的促进；抑制LSECtin与BTN3A2及BTN3A3的相互作用能够有效减缓肿瘤进程，具体体现在降低肿瘤发生率和减缓肿瘤体积增长。

附图说明

图1为临床样本肿瘤细胞表达BTN3A3。图1(a)为流式检测乳腺癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞表达水平；图1(b)为流式检测肺癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞表达水平；图1(c)为流式检测结肠癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞表达水平；图1(d)为流式检测骨巨细胞瘤病人肿瘤组织中肿瘤细胞表达水平；图1(e)为流式检测肾癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞表达水平；图1(f)为流式检测腮腺癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞表达水平。

图2为多种肿瘤细胞系表达BTN3A3。图2(a)为多种乳腺癌细胞系表达BTN3A3；图2(b)为多种肝癌细胞系表达BTN3A3；图2(c)为人黑色素瘤细胞系表达BTN3A3；图2(d)为多种胃癌细胞系表达BTN3A3；图2(e)为结肠癌细胞系表达BTN3A3。

图3为BTN3A2及BTN3A3在乳腺癌细胞上的表达。图3(a)为qPCR检测表明乳腺癌细胞系表达BTN3A2与BTN3A3；图3(b)为流式细胞显示BTN3A表达于乳腺癌细胞表面；图3(c)为细胞免疫荧光检测BTN3A3于乳腺癌细胞表面膜定位。

图4为肿瘤细胞表达的BTN3A3促进肿瘤形成。图4(a)为BTN3A3和BTN3A2的mRNA水平表达量检测；图4(b)为BTN3A3的蛋白水平表达量检测；图4(c)为人-裸鼠移植模型中231-NC与231-sh4成瘤体积对比；图4(d)人-裸鼠移植模型中231-NC与231-sh4成瘤率对比。

图5为LSECtin与肿瘤细胞表达的BTN3A3存在直接且特异性的相互作用。；图5(a)为人源LSECtin与肿瘤细胞表达的BTN3A3存在直接且特异性的相互作用；图5(b)为鼠源LSECtin与肿瘤细胞表达的BTN3A3存在直接且特异性的相互作用。

图6为LSECtin通过与肿瘤细胞表达的BTN3A3相互作用促进肿瘤细胞干性。图6(a)和图6(b)为LSECtin/BTN3A3促进肿瘤细胞MDA-MB-231球形成能力；图6(c)为LSECtin与BTN3A3相互作用促进肿瘤细胞干性转录因子上调。

图7为LSECtin与肿瘤细胞表达的BTN3A3相互作用促进肿瘤细胞内STAT3磷酸化进而促进肿瘤细胞干性维持结果。图7(a)为LSECtin/BTN3A3促进肿瘤细胞STAT3磷酸化，但对其它STAT分子无激活作用；图7(b)为抑制STAT3抑制剂可阻断LSECtin/BTN3A3促进肿瘤细胞成球效应。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒(A3500)和Mix(A6001)均为Promega公司的产品。

下述实施例中的细胞计数板(145-0011)是Biorad公司的产品。

下述实施例中的CCK8细胞计数试剂盒(CK04)是东仁化学科技公司的产品。

下述实施例中的LSECtin(QT01034446)、BTN3A2(QT00060039)和BTN3A3(QT00060039)的qPCR引物均是Qiagen公司合成。

下述实施例中的4-6周雌性裸鼠是维通利华公司的产品。

下述实施例中的胶原酶Ⅳ(C5138)是Sigma公司的产品。

下述实施例中的DNaseⅠ是西美杰公司的产品。

下述实施例中的封闭液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和脱脂牛奶；溶质Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和脱脂牛奶在封闭液中的浓度分别为0.02M、0.0015M、0.14M和3％(质量百分含量)。

下述实施例中的人乳腺癌细胞MDA-MB-231购自国家实验细胞资源共享平台，并按照该平台提供的培养方式培养。人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的培养条件为在含有10％的胎牛血清(Gibico，货号：10100-147-FBS)的RPMI 1640培养基(Thermofish，货号：SH30809.01B)中37℃，5％CO₂孵育。

下述实施例中的小鼠抗人LSECtin抗体CCB059在文献“Zhao D,Han X,Zheng X,etal.Correction:The Myeloid LSECtin Is a DAP12-Coupled Receptor That Is Crucialfor Inflammatory Response Induced by Ebola Virus Glycoprotein[J].PLoSpathogens,2016,12(3).”中公开过，公众可从军事医学科学院获得。

下述实施例中的兔抗小鼠LSECtin多抗在文献“Xu F,Liu J,Liu D,etal.LSECtin expressed on melanoma cells promotes tumor progression byinhibiting antitumor T-cell responses[J].Cancer research,2014,74(13):3418-3428.”中公开过，公众可从军事医学科学院获得。

下述实施例中的鼠源LSECtin-Fc在文献“Tang L,Yang J,Tang X,et al.The DC-SIGN family member LSECtin is a novel ligand of CD44on activated T cells[J].European journal of immunology,2010,40(4):1185-1191.”中公开过，公众可从军事医学科学院获得。

实施例1、多种临床样本肿瘤细胞表达BTN3A2及BTN3A3

一、临床样本肿瘤细胞的分离

(1)消化液的配制：将20ml的1640培养基(Hyclone公司，SH30809)、20mg胶原酶Ⅳ及1mg DNaseⅠ混匀，得到消化液，0.45μm滤膜过滤。

(2)分别取新鲜临床病人肿瘤组织，剪碎后，放入步骤(1)配制的消化液中，得到肿瘤消化液，37℃消化40min。

(3)用70μm的滤网过滤肿瘤消化液，250g离心10min。

(4)用1640培养基清洗肿瘤消化液中的肿瘤细胞3次，通过流式分选分别获得肿瘤细胞富集亚群：具体步骤如下：将活细胞群依次通过SSC-H/FSC-W及SSC-W/FSC-H去除粘连细胞、SSC-A与FSC-A去除细胞碎片、CD45-获得肿瘤细胞富集亚群，并通过用anti-CD277抗体(该抗体同时识别膜形式的BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3)进行BTN3A表达检测。

二、乳腺癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平的检测

按照上述一中的描述，对乳腺癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平进行检测。

结果如图1(a)所示：以CD45^-定义的乳腺癌肿瘤细胞表面表达BTN3A。

三、肺癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平的检测

按照上述一中的描述，对肺癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平进行检测。

结果如图1(b)所示：以CD45^-定义的肺癌肿瘤细胞部分表面表达BTN3A。

四、结肠癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平的检测

按照上述一中的描述，对结肠癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平进行检测。

结果如图1(c)所示：以CD45^-定义的结肠癌肿瘤细胞部分表面表达BTN3A。

五、骨巨细胞瘤病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平的检测

按照上述一中的描述，对骨巨细胞瘤病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平进行检测。

结果如图1(d)所示：以CD45^-定义的骨巨细胞瘤肿瘤细胞部分表面表达BTN3A。

六、肾癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平的检测

按照上述一中的描述，对肾癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平进行检测。

结果如图1(e)所示：以CD45^-定义的肾癌肿瘤细胞部分表面表达BTN3A。

七、腮腺癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平的检测

按照上述一中的描述，对腮腺癌病人肿瘤组织中肿瘤细胞BTN3A表达水平进行检测。

结果如图1(f)所示：以CD45^-定义的腮腺癌肿瘤细胞部分表面表达BTN3A。

实施例2、多种肿瘤细胞系表达BTN3A3

1、肿瘤细胞系的培养

培养如下乳腺癌细胞系：MCF7(3111C0001CCC000013)、ZR75-1(3111C0001CCC000090)、BT474(3111C0001CCC000129)、T47D(3111C0001CCC000265)、MDA-MB-453(3111C0001CCC000016)、SKBR3(3111C0001CCC000085)、MDA-MB-468(3111C0001CCC000249)、MDA-MB-436(3111C0001CCC000352)；MDA-MB-231(3111C0001CCC000013)；肝癌细胞系：BEL-7402(3131C0001000700010)、HepG2(3111C0001CCC000035)、HCC-LM3(3142C0001000000316)、HHCC(3111C0002000000069)、Hep3B(3111C0001CCC000376)、QGY7701(3131C0001000700042)、SMCC7721(3111C0001CCC000087)、Huh7(3131C0001000700182)；黑色素瘤细胞系：A875(3111C0001CCC000094)、A375(3131C0001000700004)；胃癌细胞系：MKN28(3111C0001CCC000482)、NCI-N87(3111C0001CCC000481)、MGC-803(3111C0001CCC000227)、SGC-7901(3131C0001000700046)；结肠癌细胞系：LOVO(3111C0001CCC000164)、SW480(3142C0001000000064)、LS174T(3111C0001CCC000248)、DLD-1(3131C0001000700134)。上述细胞均购自国家实验细胞资源共享平台。上述细胞培养条件按“国家实验细胞资源共享平台”网站查询的方法培养。

2、用RIPA裂解液(Thermofisher，89901)分别将上述各个细胞系进行裂解，分别获得细胞裂解液，并分别对细胞裂解液进行Western Blot检测，通过anti-BTN3A3抗体(Sigma,HPA007904)检测BTN3A3表达水平。

结果如图2(a)-(e)所示：从图中可以看出，多种肿瘤细胞系表达BTN3A3。

实施例3、BTN3A2和BTN3A3在乳腺癌细胞上的表达

一、qPCR检测乳腺癌细胞系上BTN3A2和BTN3A3的表达水平

1、RNA的提取及cDNA的反转录

采用RNA提取试剂盒提取如下各乳腺癌细胞：MCF7、ZR75-1、BT474、T47D、SKBR3、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MDA-MB-436的RNA；按照cDNA合成试剂盒的方法合成cDNA。

2、qPCR检测乳腺癌细胞系上BTN3A3表达水平

以步骤1获得的cDNA为模板，使用实时荧光定量核酸扩增检测***(qPCR)扩增BTN3A2，BTN3A3及GAPDH，并通过软件分析BTN3A2，BTN3A3相对表达量。上述BTN3A2，BTN3A3以及GAPDH引物均购自Qiagen公司。

结果如图3(a)所示。qPCR检测结果表明：乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-436上高表达BTN3A2和BTN3A3。

二、流式细胞显示BTN3A分子表达于乳腺癌细胞表面

用anti-CD277抗体(该抗体同时识别膜形式的BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3)对如下乳腺癌细胞系：MCF7、ZR75-1、BT474、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MDA-MB-436进行流式检测。具体步骤如下：实验组用1×PBS以1:50体积比稀释anti-CD277抗体(eBioscience，14-2779)，对照组用1×PBS以1:50体积比稀释同型对照抗体(eBioscience，14-4714-82)，4℃孵育30min。用1×PBS洗细胞3次后，弃上清。以1:50体积比稀释羊抗小鼠PE标记荧光二抗(Biolegend，405307)标记细胞，4℃孵育30min。用1×PBS洗细胞3次后，弃上清，用300μlPBS重悬后进行流式检测。

结果如图3(b)所示，从图中可以看出：BTN3A表达于乳腺癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-231和MDA-MB-436的表面。

三、细胞免疫荧光检测BTN3A3于乳腺癌细胞表面膜定位

收集培养状态下的MDA-MB-231细胞，用PBS洗三遍，洗去多余血清。稀释10X的透膜液(达科为，421002)成1×的工作液。用透膜液重悬固定细胞，350g离心10min，弃上清，重复该步骤一次。100ul透膜液重悬固定破膜后的细胞，用透膜液以1:200体积比稀释的anti-BTN3A3抗体(Sigma，HPA007904)，4℃孵育30min。用透膜液洗细胞3次后，弃上清。加入以体积比1:200稀释的兔TRITC荧光抗体(中杉金桥，ZF-0318)，4℃避光孵育30min。用透膜液洗细胞三次后，将细胞放入载玻片，荧光显微镜下观察BTN3A3表达情况。

结果如图3(c)所示，从图中可以看出：MDA-MB-231细胞表达BTN3A3，并主要定位于细胞膜。

实施例4、肿瘤细胞表达的BTN3A2和BTN3A3促进肿瘤形成

利用231-NC细胞及231-sh4细胞验证肿瘤表达的BTN3A3对肿瘤进程的影响。具体步骤如下：

1、敲低BTN3A3的人乳腺癌细胞MDA-MB-231的构建

231-sh3细胞和231-sh4细胞均为稳定表达绿色荧光蛋白且敲低BTN3A3的人乳腺癌细胞MDA-MB-231，231-NC细胞是稳定表达绿色荧光蛋白的人乳腺癌细胞MDA-MB-231。具体构建步骤如下

(1)委托苏州吉玛公司完成敲低BTN3A3的sh表达质粒的构建及慢病毒的包装与纯化的步骤。sh RNA序列如下：sh3：GCCACAGATGGATCTCATATC(序列4)；sh4：CCCTTCTGCAACAACCAATCA(序列5)；NC(阴性对照序列)：TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC。

(2)利用慢病毒分别将构建的sh3表达质粒转染目的细胞(人乳腺癌细胞MDA-MB-231)，并通过荧光蛋白进行筛选，得到敲低BTN3A3的稳定细胞系231-sh3。

利用慢病毒分别将构建的sh4表达质粒转染目的细胞(人乳腺癌细胞MDA-MB-231)，并通过荧光蛋白进行筛选，得到敲低BTN3A3的稳定细胞系231-sh4。

利用慢病毒分别将构建的NC表达质粒转染目的细胞(人乳腺癌细胞MDA-MB-231)，并通过荧光蛋白进行筛选，得到对照细胞系231-NC。

上述转染的具体步骤如下：病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10⁵个/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10⁵MOI/孔左右。第二天，用含有6μg/mlpolybrene(苏州吉玛公司)的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。病毒感染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。扩大培养一周，通过流式分选获得带有GFP的细胞。

(3)BTN3A3和BTN3A2的mRNA水平表达量检测

分别收集10⁵个231-sh4细胞和231-NC对照细胞，利用qPCR分别对231-sh4细胞和231-NC对照细胞的BTN3A1，BTN3A2，BTN3A3mRNA水平表达进行检测。具体步骤如下：按照试剂盒说明书所示方法进行RNA提取及反转录，获得的cDNA，再利用qPCR引物进行qPCR。其中，RNA小提试剂盒(74034)购自Qiagen公司。RNA反转录试剂盒(Promega)购自Promega公司。BTN3A1(QF00264803)，BTN3A2(QT00060039)，BTN3A3(QF00264803)基因qPCR引物均购自Qiagen公司。

检测结果如图4(a)所示，与对照细胞231-NC相比，敲低BTN3A3的稳定细胞系231-sh4中，BTN3A2及BTN3A3的相对表达量均低于0.4，说明敲低BTN3A3的稳定细胞系231-sh4中BTN3A2及BTN3A3表达水平均明显降低。

(4)BTN3A3的蛋白水平表达量检测

分别收集10⁵个231-sh3细胞、231-sh4细胞和231-NC对照细胞，对231-sh3细胞、231-sh4细胞和231-NC对照细胞的BTN3A3蛋白水平表达进行检测。具体步骤如下：用RIPA裂解液(Thermofisher，89901)分别将上述各个细胞系进行裂解，分别获得细胞裂解液，并分别对细胞裂解液进行Western Blot检测，通过anti-BTN3A3抗体(Sigma,HPA007904)检测BTN3A3表达水平，具体方法参照抗体说明书。

结果如图4(b)所示，与对照细胞231-NC相比，敲低BTN3A3的稳定细胞系231-sh3和敲低BTN3A3的稳定细胞系231-sh4中BTN3A3表达水平明显降低。

2、分别将对照细胞231-NC和231-sh4细胞以1000个细胞/只原位种植裸鼠乳腺脂肪垫。在接种细胞后，第8天开始观察，之后每周观察一次，使用游标卡尺分别测量小鼠肿瘤的长径a和短径b，并计算肿瘤体积和成瘤率。肿瘤体积计算公式为0.5*ab²。直到6周时，处死小鼠。

肿瘤体积的检测结果如图4(c)所示，小鼠在接种231-NC细胞后第0、1、2、3、4、5、6周肿瘤体积分别为0.000±0.000、3.398±5.829、10.627±10.152、32.637±20.258、60.116±24.670、158.550±59.933和331.362±100.745(单位为mm³)；小鼠在接种231-sh4细胞后第0、1、2、3、4、5、6周肿瘤体积分别为0.000±0.000、0.000±0.000、4.068±6.957、14.460±20.532、13.208±17.609、36.183±48.657和96.543±127.005(单位为mm³)；

成瘤率的检测结果如图4(d)所示，对照细胞231-NC组小鼠的成瘤率明显高于231-sh4组。

上述结果均表明：敲低BTN3A2和BTN3A3后，乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤率、成瘤体积均明显下降。说明BTN3A2和BTN3A3促进肿瘤形成。

实施例5、LSECtin与BTN3A2及BTN3A3存在直接且特异性的相互作用

粘附实验验证LSECtin与BTN3A2及BTN3A3存在直接且特异的相互作用

1、过表达BTN3A1，BTN3A2，BTN3A3的载体的构建

分别将BTN3A1序列(序列6)、BTN3A2序列(序列7)、BTN3A3序列(序列8)替换pIRES2-EGFP载体(Clotech，6029-1)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点间的DNA片段，分别获得表达BTN3A1的载体pIRES2-EGFP-BTN3A1、表达BTN3A2的pIRES2-EGFP-BTN3A2、表达BTN3A3的pIRES2-EGFP-BTN3A3。

2、分别将表达BTN3A1的载体pIRES2-EGFP-BTN3A1、表达BTN3A2的pIRES2-EGFP-BTN3A2、表达BTN3A3的pIRES2-EGFP-BTN3A3及空载体pIRES2-EGFP转染BT474细胞(国家实验细胞资源共享平台，3111C0001CCC000129)，转染36h后，分别得到过表达BTN3A1的细胞BT474-BTN3A1、过表达BTN3A2的细胞BT474-BTN3A2、过表达BTN3A3的细胞BT474-BTN3A3和过表达空载体的细胞BT474-EGFP。

3、消化收集步骤2获得的各个细胞，分别用人源LSECtin蛋白(R&D,2947-CL)和鼠源LSECtin-Fc蛋白与上述各个细胞粘附，并用小鼠抗人LSECtin抗体CCB059检测人源LSECtin粘附率，用anti-IgG(Biolegend，405307)检测鼠源LSECtin粘附率，通过流式检测粘附比例。粘附实验具体步骤参照文献“Tang L,Yang J,Tang X,et al.The DC-SIGNfamily member LSECtin is a novel ligand of CD44 on activated T cells[J].European journal of immunology,2010,40(4):1185-1191.”中的方法。

粘附实验验证LSECtin与BTN3A3存在直接且特异性的相互作用的结果如图5(a)和图5(b)所示。其中，人源LSECtin粘附结果如图5(a)所示，LSECtin与过表达空载体的细胞BT474-EGFP不粘附(粘附率为3.579％)，与过表达BTN3A1的细胞BT474-BTN3A1不粘附(粘附率为0.775％)，与过表达BTN3A2的细胞BT474-BTN3A2弱粘附(粘附率为42.33％)，与过表达BTN3A3的细胞BT474-BTN3A3强粘附(粘附率为57.587％)。鼠源LSECtin-Fc粘附结果如图5(b)所示，LSECtin与过表达空载体的细胞BT474-EGFP不粘附(粘附率为0.967％)、与过表达BTN3A1的细胞BT474-BTN3A1不粘附(粘附率为1.598％)，与过表达BTN3A2的细胞BT474-BTN3A2不粘附(粘附率为6.61％)，与BT474-BTN3A3粘附(粘附率为27.345％)。

上述结果说明，人源及鼠源LSECtin与人肿瘤细胞表面表达的BTN3A3存在直接且特异的强相互作用，人源LSECtin与人肿瘤细胞表面表达的BTN3A3存在强相互作用。

实施例6、LSECtin与BTN3A2及BTN3A3相互作用促进肿瘤细胞干性的维持

一、球形成实验证明LSECtin与BTN3A2及BTN3A3相互作用促进肿瘤细胞干性的维持

本实施例通过球形成实验证明LSECtin与BTN3A2及BTN3A3相互作用促进肿瘤细胞干性的维持。具体步骤如下：

1、分别将231-sh3细胞、231-sh4细胞和231-NC细胞，以及实施例5步骤二中的2获得的过表达BTN3A1的细胞BT474-BTN3A1、过表达BTN3A2的细胞BT474-BTN3A2、过表达BTN3A3的细胞BT474-BTN3A3和过表达空载体的细胞BT474-EGFP制成单细胞悬液，第一代细胞以20,000个/mL铺板，传代以1000个/mL铺板。

2、分别将上述各个细胞、B27(Life,17504044)、bFGF(Sigam,SRP2092)、EGF(Sigma,E9644)、胰岛素(Sigma,I3536)、肝素(sigma,1235853)和DMEM/F12无血清培养基混匀后，分别得到培养体系，各个组分在培养体系中的浓度为：B27(10ng/ml)、bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、胰岛素(5μg/ml)、肝素(4μg/ml)，培养7-10天后，计算直径大于75μm的球体数量并拍照。

3、800rpm离心收集球体，胰酶(Gibico,25300120)消化，40μm筛网过滤，进行二次球体形成实验。

4、分别向上述各个培养体系中加入浓度为100ng/ml的LSECitn刺激肿瘤细胞，分别得到LSECitn刺激后的各个细胞。

结果如图6(a)和图6(b)所示，在100ng的LSECtin刺激浓度下，LSECtin能够促进对照细胞231-NC细胞球形成；但不能促进敲低BTN3A2及BTN3A3的231-sh3细胞和231-sh4细胞的球形成。在100ng的LSECtin刺激浓度下，LSECtin不能促进过表达空载体的细胞BT474-EGFP的球形成；但可以促进过表达BTN3A2的细胞BT474-BTN3A2、过表达BTN3A3的细胞BT474-BTN3A3的球形成。

二、干性特征分子表达水平的检测

收集步骤一中的4获得的球形成实验中的231-sh4细胞和231-NC细胞，通过qPCR检测乳腺肿瘤干性相关特征分子OCT4、NANOG、SOX2的表达变化。DC-SIGN代表阴性对照，Control为未用LSECtin刺激组，231-sh4为敲低BTN3A3的细胞，231-NC为对照细胞。引物序列如下：OCT4：Up-GCTCGAGAAGGATGTGGTCC；Down-GTTGTGCATAGTCGCTGCT；NANOG：Up-TCTGGACACTGGCTGAATCCT；Down-CGCTGATTAGGCTCCAACCAT；SOX2：Up-GCTCGCAGACCTACATGAAC；Down-GGGAGGAAGAGGTAACCACA。

结果如图6(c)所示，在100ng的LSECtin刺激浓度下，LSECtin能够促进干性关键转录因子Oct4，Nanog和Sox的表达；但该促进效应在敲除BTN3A3后，则不能。

上述结果说明，LSECtin与BTN3A2及BTN3A3相互作用促进肿瘤进程和促进肿瘤细胞干性的维持。

实施例7、LSECtin与BTN3A2及BTN3A3相互作用促进肿瘤进程依赖激活肿瘤细胞内STAT3磷酸化

一、LSECtin刺激表达BTN3A3的乳腺癌细胞STAT3磷酸化

分别收集实施例6中步骤一的4获得的经LSECtin刺激的球形成样本：敲低BTN3A3的231-sh3细胞(LSECitn-231-sh3)、敲低BTN3A3的231-sh4细胞(LSECitn-231-sh4)、细胞231-NC(LSECitn-231-NC)和实施例6步骤一的3中获得的未经LSECtin刺激的球形成样本：敲低BTN3A3的231-sh3细胞(231-sh3)、敲低BTN3A3的231-sh4细胞(231-sh4)、细胞231-NC(231-NC)。利用胰酶进行消化，4℃，1000rmp离心后，弃上清，收集细胞，并通过PBS洗细胞三次。通过RIPA裂解液冰上裂解30min，12,000rmp离心，取上清，获得细胞裂解液。通过StatAntibody Sampler Kit试剂盒(Cell signaling technology，9939)Western Blot检测裂解液中STAT1、STAT3、STAT5、STAT6的本底水平，通过Phospho-Stat Antibody Sampler Kit试剂盒(Cell signaling technology，9914)检测裂解液中STAT1、STAT3、STAT5、STAT6的磷酸化水平。具体检测方法参照试剂盒中的说明书。

结果如图7(a)所示，LSECtin刺激下，正常表达BTN3A2及BTN3A3的231-NC细胞的p-STAT3水平明显上调；但在敲低BTN3A2及BTN3A3的231-sh3细胞(LSECitn-231-sh3)、敲低BTN3A2及BTN3A3的231-sh4细胞(LSECitn-231-sh4)中，LSECtin不能刺激p-STAT3水平上调；但无论是否敲低BTN3A3，STAT家族的其它分子STAT1、STAT5、STAT6磷酸化水平无上调作用。

上述结果说明，LSECtin通过与BTN3A3相互作用，能够刺激p-STAT3水平上调。

二、LSECtin促进表达BTN3A2及BTN3A3的乳腺癌细胞球形成依赖STAT3磷酸化

分别收集实施例6步骤一的4中获得的球形成样本：敲低BTN3A3的细胞231-sh3、敲低BTN3A3的细胞231-sh4和敲低BTN3A3的细胞231-NC，并在收集样本后的第三天加入STAT3抑制剂(selleck，S1155)，第十天检测球形成数量。

结果如图7(b)所示，加入STAT3抑制剂后，LSECtin促进正常表达BTN3A2及BTN3A3的231-NC细胞的球形成能力明显降低；在敲低BTN3A2及BTN3A3的231-sh3及231-sh4细胞中，加入STAT3抑制剂使得LSECtin促进球形成作用完全消失。

上述结果说明，LSECtin与乳腺癌细胞表达的BTN3A2及BTN3A3相互作用促进肿瘤进程依赖于细胞内部的STAT3磷酸化水平。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京蛋白质组研究中心

<120>一种肿瘤治疗的靶点及其应用

<160>8

<210>1

<211>293

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Met Asp Thr Thr Arg Tyr Ser Lys Trp Gly Gly Ser Ser Glu Glu Val

1 5 10 15

Pro Gly Gly Pro Trp Gly Arg Trp Val His Trp Ser Arg Arg Pro Leu

20 25 30

Phe Leu Ala Leu Ala Val Leu Val Thr Thr Val Leu Trp Ala Val Ile

35 40 45

Leu Ser Ile Leu Leu Ser Lys Ala Ser Thr Glu Arg Ala Ala Leu Leu

50 55 60

Asp Gly His Asp Leu Leu Arg Thr Asn Ala Ser Lys Gln Thr Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gly Ala Leu Lys Glu Glu Val Gly Asp Cys His Ser Cys Cys Ser

85 90 95

Gly Thr Gln Ala Gln Leu Gln Thr Thr Arg Ala Glu Leu Gly Glu Ala

100 105 110

Gln Ala Lys Leu Met Glu Gln Glu Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg Glu

115 120 125

Arg Val Thr Gln Gly Leu Ala Glu Ala Gly Arg Gly Arg Glu Asp Val

130 135 140

Arg Thr Glu Leu Phe Arg Ala Leu Glu Ala Val Arg Leu Gln Asn Asn

145 150 155 160

Ser Cys Glu Pro Cys Pro Thr Ser Trp Leu Ser Phe Glu Gly Ser Cys

165 170 175

Tyr Phe Phe Ser Val Pro Lys Thr Thr Trp Ala Ala Ala Gln Asp His

180 185 190

Cys Ala Asp Ala Ser Ala His Leu Val Ile Val Gly Gly Leu Asp Glu

195 200 205

Gln Gly Phe Leu Thr Arg Asn Thr Arg Gly Arg Gly Tyr Trp Leu Gly

210 215 220

Leu Arg Ala Val Arg His Leu Gly Lys Val Gln Gly Tyr Gln Trp Val

225 230 235 240

Asp Gly Val Ser Leu Ser Phe Ser His Trp Asn Gln Gly Glu Pro Asn

245 250 255

Asp Ala Trp Gly Arg Glu Asn Cys Val Met Met Leu His Thr Gly Leu

260 265 270

Trp Asn Asp Ala Pro Cys Asp Ser Glu Lys Asp Gly Trp Ile Cys Glu

275 280 285

Lys Arg His Asn Cys

290

<210>2

<211>334

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Lys Met Ala Ser Ser Leu Ala Phe Leu Leu Leu Asn Phe His Val

1 5 10 15

Ser Leu Leu Leu Val Gln Leu Leu Thr Pro Cys Ser Ala Gln Phe Ser

20 25 30

Val Leu Gly Pro Ser Gly Pro Ile Leu Ala Met Val Gly Glu Asp Ala

35 40 45

Asp Leu Pro Cys His Leu Phe Pro Thr Met Ser Ala Glu Thr Met Glu

50 55 60

Leu Lys Trp Val Ser Ser Ser Leu Arg Gln Val Val Asn Val Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Gly Lys Glu Val Glu Asp Arg Gln Ser Ala Pro Tyr Arg Gly Arg

85 90 95

Thr Ser Ile Leu Arg Asp Gly Ile Thr Ala Gly Lys Ala Ala Leu Arg

100 105 110

Ile His Asn Val Thr Ala Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Leu Cys Tyr Phe

115 120 125

Gln Asp Gly Asp Phe Tyr Glu Lys Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Ser Asn Leu His Val Glu Val Lys Gly Tyr Glu Asp Gly

145 150 155 160

Gly Ile His Leu Glu Cys Arg Ser Thr Gly Trp Tyr Pro Gln Pro Gln

165 170 175

Ile Gln Trp Ser Asn Ala Lys Gly Glu Asn Ile Pro Ala Val Glu Ala

180 185 190

Pro Val Val Ala Asp Gly Val Gly Leu Tyr Glu Val Ala Ala Ser Val

195 200 205

Ile Met Arg Gly Gly Ser Gly Glu Gly Val Ser Cys Ile Ile Arg Asn

210 215 220

Ser Leu Leu Gly Leu Glu Lys Thr Ala Ser Ile Ser Ile Ala Asp Pro

225 230 235 240

Phe Phe Arg Ser Ala Gln Pro Trp Ile Ala Ala Leu Ala Gly Thr Leu

245 250 255

Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ser Tyr Phe Leu Trp Arg

260 265 270

Gln Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu Ser Ser Glu Ile Glu Ser Glu Gln

275 280 285

Glu Met Lys Glu Met Gly Tyr Ala Ala Thr Glu Arg Glu Ile Ser Leu

290 295 300

Arg Glu Ser Leu Gln Glu Glu Leu Lys Arg Lys Lys Ile Gln Tyr Leu

305 310 315 320

Thr Arg Gly Glu Glu Ser Ser Ser Asp Thr Asn Lys Ser Ala

325 330

<210>3

<211>584

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Met Lys Met Ala Ser Ser Leu Ala Phe Leu Leu Leu Asn Phe His Val

1 5 10 15

Ser Leu Phe Leu Val Gln Leu Leu Thr Pro Cys Ser Ala Gln Phe Ser

20 25 30

Val Leu Gly Pro Ser Gly Pro Ile Leu Ala Met Val Gly Glu Asp Ala

35 40 45

Asp Leu Pro Cys His Leu Phe Pro Thr Met Ser Ala Glu Thr Met Glu

50 55 60

Leu Arg Trp Val Ser Ser Ser Leu Arg Gln Val Val Asn Val Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Gly Lys Glu Val Glu Asp Arg Gln Ser Ala Pro Tyr Arg Gly Arg

85 90 95

Thr Ser Ile Leu Arg Asp Gly Ile Thr Ala Gly Lys Ala Ala Leu Arg

100 105 110

Ile His Asn Val Thr Ala Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Leu Cys Tyr Phe

115 120 125

Gln Asp Gly Asp Phe Tyr Glu Lys Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Ser Asp Leu His Ile Glu Val Lys Gly Tyr Glu Asp Gly

145 150 155 160

Gly Ile His Leu Glu Cys Arg Ser Thr Gly Trp Tyr Pro Gln Pro Gln

165 170 175

Ile Lys Trp Ser Asp Thr Lys Gly Glu Asn Ile Pro Ala Val Glu Ala

180 185 190

Pro Val Val Ala Asp Gly Val Gly Leu Tyr Ala Val Ala Ala Ser Val

195 200 205

Ile Met Arg Gly Ser Ser Gly Gly Gly Val Ser Cys Ile Ile Arg Asn

210 215 220

Ser Leu Leu Gly Leu Glu Lys Thr Ala Ser Ile Ser Ile Ala Asp Pro

225 230 235 240

Phe Phe Arg Ser Ala Gln Pro Trp Ile Ala Ala Leu Ala Gly Thr Leu

245 250 255

Pro Ile Ser Leu Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ser Tyr Phe Leu Trp Arg

260 265 270

Gln Gln Lys Glu Lys Ile Ala Leu Ser Arg Glu Thr Glu Arg Glu Arg

275 280 285

Glu Met Lys Glu Met Gly Tyr Ala Ala Thr Glu Gln Glu Ile Ser Leu

290 295 300

Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu Leu Lys Trp Arg Lys Ile Gln Tyr Met

305 310 315 320

Ala Arg Gly Glu Lys Ser Leu Ala Tyr His Glu Trp Lys Met Ala Leu

325 330 335

Phe Lys Pro Ala Asp Val Ile Leu Asp Pro Asp Thr Ala Asn Ala Ile

340 345 350

Leu Leu Val Ser Glu Asp Gln Arg Ser Val Gln Arg Ala Glu Glu Pro

355 360 365

Arg Asp Leu Pro Asp Asn Pro Glu Arg Phe Glu Trp Arg Tyr Cys Val

370 375 380

Leu Gly Cys Glu Asn Phe Thr Ser Gly Arg His Tyr Trp Glu Val Glu

385 390 395 400

Val Gly Asp Arg Lys Glu Trp His Ile Gly Val Cys Ser Lys Asn Val

405 410 415

Glu Arg Lys Lys Gly Trp Val Lys Met Thr Pro Glu Asn Gly Tyr Trp

420 425 430

Thr Met Gly Leu Thr Asp Gly Asn Lys Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Pro

435 440 445

Arg Thr Asn Leu Lys Leu Pro Glu Pro Pro Arg Lys Val Gly Ile Phe

450 455 460

Leu Asp Tyr Glu Thr Gly Glu Ile Ser Phe Tyr Asn Ala Thr Asp Gly

465 470 475 480

Ser His Ile Tyr Thr Phe Pro His Ala Ser Phe Ser Glu Pro Leu Tyr

485 490 495

Pro Val Phe Arg Ile Leu Thr Leu Glu Pro Thr Ala Leu Thr Ile Cys

500 505 510

Pro Ile Pro Lys Glu Val Glu Ser Ser Pro Asp Pro Asp Leu Val Pro

515 520 525

Asp His Ser Leu Glu Thr Pro Leu Thr Pro Gly Leu Ala Asn Glu Ser

530 535 540

Gly Glu Pro Gln Ala Glu Val Thr Ser Leu Leu Leu Pro Ala His Pro

545 550 555 560

Gly Ala Glu Val Ser Pro Ser Ala Thr Thr Asn Gln Asn His Lys Leu

565 570 575

Gln Ala Arg Thr Glu Ala Leu Tyr

580

<210>4

<211>21bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gccacagatg gatctcatat c 21

<210>5

<211>21bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

cccttctgca acaaccaatc a 21

<210>6

<211>1542bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

atgaaaatgg caagtttcct ggccttcctt ctgctcaact ttcgtgtctg cctccttttg 60

cttcagctgc tcatgcctca ctcagctcag ttttctgtgc ttggaccctc tgggcccatc 120

ctggccatgg tgggtgaaga cgctgatctg ccctgtcacc tgttcccgac catgagtgca 180

gagaccatgg agctgaagtg ggtgagttcc agcctaaggc aggtggtgaa cgtgtatgca 240

gatggaaagg aagtggaaga caggcagagt gcaccgtatc gagggagaac ttcgattctg 300

cgggatggca tcactgcagg gaaggctgct ctccgaatac acaacgtcac agcctctgac 360

agtggaaagt acttgtgtta tttccaagat ggtgacttct atgaaaaagc cctggtggag 420

ctgaaggttg cagcactggg ttctgatctt cacgttgatg tgaagggtta caaggatgga 480

gggatccatc tggagtgcag gtccactggc tggtaccccc aaccccaaat acagtggagc 540

aacaacaagg gagagaacat cccgactgtg gaagcacctg tggttgcaga cggagtgggc 600

ctgtatgcag tagcagcatc tgtgatcatg agaggcagct ctggggaggg tgtatcctgt 660

accatcagaa gttccctcct cggcctggaa aagacagcca gcatttccat cgcagacccc 720

ttcttcagga gcgcccagag gtggatcgcc gccctggcag ggaccctgcc tgtcttgctg 780

ctgcttcttg ggggagccgg ttacttcctg tggcaacagc aggaggaaaa aaagactcag 840

ttcagaaaga aaaagagaga gcaagagttg agagaaatgg catggagcac aatgaagcaa 900

gaacaaagca caagagtgaa gctcctggag gaactcagat ggagaagtat ccagtatgca 960

tctcggggag agagacattc agcctataat gaatggaaaa aggccctctt caagcctgcg 1020

gatgtgattc tggatccaaa aacagcaaac cccatcctcc ttgtttctga ggaccagagg 1080

agtgtgcagc gtgccaagga gccccaggat ctgccagaca accctgagag atttaattgg 1140

cattattgtg ttctcggctg tgagagcttc atatcaggga gacattactg ggaggtggag 1200

gtaggggaca ggaaagagtg gcatataggg gtgtgcagta agaatgtgca gagaaaaggc 1260

tgggtcaaaa tgacacctga gaatggattc tggactatgg ggctgactga tgggaataag 1320

tatcggactc taactgagcc cagaaccaac ctgaaacttc ctaagccccc taagaaagtg 1380

ggggtcttcc tggactatga gactggagat atctcattct acaatgctgt ggatggatcg 1440

catattcata ctttcctgga cgtctccttc tctgaggctc tatatcctgt tttcagaatt 1500

ttgaccttgg agcccacggc cctgactatt tgtccagcgt ga 1542

<210>7

<211>1005bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

atgaaaatgg caagttccct ggctttcctt ctgctcaact ttcatgtctc cctcctcttg 60

gtccagctgc tcactccttg ctcagctcag ttttctgtgc ttggaccctc tgggcccatc 120

ctggccatgg tgggtgaaga cgctgatctg ccctgtcacc tgttcccgac catgagtgca 180

gagaccatgg agctgaagtg ggtaagttcc agcctaaggc aggtggtgaa cgtgtatgca 240

gatggaaagg aagtggaaga caggcagagt gcaccgtatc gagggagaac ttcgattctg 300

cgggatggca tcactgcagg gaaggctgct ctccgaatac acaacgtcac agcctctgac 360

agtggaaagt acttgtgtta tttccaagat ggtgacttct atgaaaaagc cctggtggag 420

ctgaaggttg cagcactggg ttctaatctt cacgtcgaag tgaagggtta tgaggatgga 480

gggatccatc tggagtgcag gtccaccggc tggtaccccc aaccccaaat acagtggagc 540

aacgccaagg gagagaacat cccagctgtg gaagcacctg tggttgcaga tggagtgggc 600

ctatatgaag tagcagcatc tgtgatcatg agaggcggct ccggggaggg tgtatcctgc 660

atcatcagaa attccctcct cggcctggaa aagacagcca gcatttccat cgcagacccc 720

ttcttcagga gcgcccagcc ctggatcgca gccctggcag ggaccctgcc tatcttgctg 780

ctgcttctcg ccggagccag ttacttcttg tggagacaac agaaggaaat aactgctctg 840

tccagtgaga tagaaagtga gcaagagatg aaagaaatgg gatatgctgc aacagagcgg 900

gaaataagcc taagagagag cctccaggag gaactcaaga ggaaaaaaat ccagtacttg 960

actcgtggag aggagtcttc gtccgatacc aataagtcag cctga 1005

<210>8

<211>1755bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

atgaaaatgg caagttccct ggctttcctt ctgctcaact ttcatgtctc cctcttcttg 60

gtccagctgc tcactccttg ctcagctcag ttttctgtgc ttggaccctc tgggcccatc 120

ctggccatgg tgggtgaaga cgctgatctg ccctgtcacc tgttcccgac catgagtgca 180

gagaccatgg agctgaggtg ggtgagttcc agcctaaggc aggtggtgaa cgtgtatgca 240

gatggaaagg aagtggaaga caggcagagt gcaccgtatc gagggagaac ttcgattctg 300

cgggatggca tcactgcagg gaaggctgct ctccgaatac acaacgtcac agcctctgac 360

agtggaaagt acttgtgtta tttccaagat ggtgacttct acgaaaaagc cctggtggag 420

ctgaaggttg cagcattggg ttctgatctt cacattgaag tgaagggtta tgaggatgga 480

gggatccatc tggagtgcag gtccactggc tggtaccccc aaccccaaat aaagtggagc 540

gacaccaagg gagagaacat cccggctgtg gaagcacctg tggttgcaga tggagtgggc 600

ctgtatgcag tagcagcatc tgtgatcatg agaggcagct ctggtggggg tgtatcctgc 660

atcatcagaa attccctcct cggcctggaa aagacagcca gcatatccat cgcagacccc 720

ttcttcagga gcgcccagcc ctggatcgcg gccctggcag ggaccctgcc tatctcgttg 780

ctgcttctcg caggagccag ttacttcttg tggagacaac agaaggaaaa aattgctctg 840

tccagggaga cagaaagaga gcgagagatg aaagaaatgg gatacgctgc aacagagcaa 900

gaaataagcc taagagagaa gctccaggag gaactcaagt ggaggaaaat ccagtacatg 960

gctcgtggag agaagtcttt ggcctatcat gaatggaaaa tggccctctt caaacctgcg 1020

gatgtgattc tggatccaga cacggcaaac gccatcctcc ttgtttctga ggaccagagg 1080

agtgtgcagc gtgctgaaga gccgcgggat ctgccagaca accctgagag atttgaatgg 1140

cgttactgtg tccttggctg tgaaaacttc acatcaggga gacattactg ggaggtggaa 1200

gtgggggaca gaaaagagtg gcatattggg gtatgtagta agaacgtgga gaggaaaaaa 1260

ggttgggtca aaatgacacc ggagaacgga tactggacta tgggcctgac tgatgggaat 1320

aagtatcggg ctctcactga gcccagaacc aacctgaaac ttcctgagcc tcctaggaaa 1380

gtggggatct tcctggacta tgagactgga gagatctcgt tctataatgc cacagatgga 1440

tctcatatct acacctttcc gcacgcctct ttctctgagc ctctatatcc tgttttcaga 1500

attttgacct tggagcccac tgccctgacc atttgcccaa taccaaaaga agtagagagt 1560

tcccccgatc ctgacctagt gcctgatcat tccctggaga caccactgac cccgggctta 1620

gctaatgaaa gtggggagcc tcaggctgaa gtaacatctc tgcttctccc tgcccaccct 1680

ggagctgagg tctccccttc tgcaacaacc aatcagaacc ataagctaca ggcacgcact 1740

gaagcacttt actga 1755

Claims

1.抑制BTN3A表达的物质在制备具有如下（1）-（5）中至少一种功能的产品中的应用：

（1）治疗和/或预防肿瘤；

（2）抑制肿瘤细胞的生长；

（3）抑制肿瘤细胞干性的维持或促进；

（4）抑制肿瘤细胞干性相关特征分子的表达；

（5）抑制肿瘤细胞内部STAT3磷酸化；

所述BTN3A为如下a1）或a2）：

a1）BTN3A3；

a2）BTN3A2和BTN3A3；

所述肿瘤为乳腺癌；

所述抑制BTN3A表达的物质为SEQ ID NO：5所示的shRNA分子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述肿瘤细胞干性相关特征分子为Oct4基因和/或Nanog基因和/或Sox基因；

所述抑制肿瘤细胞的生长体现在降低肿瘤细胞的成瘤率和/或减小肿瘤细胞的体积。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为药品。

4.BTN3A2和/或BTN3A3作为靶点在开发或设计肿瘤免疫治疗药物中的应用；所述肿瘤为乳腺癌。