CN107991485A - 用于检测可溶性st2蛋白的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测可溶性ST2蛋白的试剂盒。具体地，本发明涉及的可溶性ST2蛋白检测试剂盒包含偶联有第一抗ST2蛋白单克隆抗体的磁珠和包含被标记物标记的第二抗ST2蛋白单克隆抗体的酶工作液。另一方面，本发明涉及2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞、由所述杂交瘤细胞产生的抗ST2蛋白单克隆抗体、以及所述抗ST2蛋白单克隆抗体在制备用于检测可溶性ST2蛋白的试剂盒中的用途。

Description

用于检测可溶性ST2蛋白的试剂盒
技术领域
本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一种可溶性生长刺激表达因子2(ST2)蛋白检测试剂盒、以及检测ST2蛋白的蛋白单克隆抗体及其用途。
背景技术
心力衰竭(简称心衰)为各种心脏疾病的始末和严重阶段，发病率高，是当今重要的心血管疾病之一。心衰是由于心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的一组复杂临床综合症，其发病率和病死率高，5年存活率与恶性肿瘤相近。
近年来随着人口老龄化程度加重，高血压、糖尿病、肥胖发病率逐年上升及各种血管危险因素的増加，心衰发病率日益上升。因此快速判断心衰患者预后，早期采取积极的管理方法具有重要意义。
ST2基因于1989年首次发现，ST2蛋白由328个氨基酸组成，是Toll/IL-1(IL-1R)超受体家族的成员之一。ST2基因位于2号染色体(2ql2)，包含11个外显子，一个近端启动子和个远端启动子。ST2蛋白主要有两种由不同启动子调控的初级亚型，一种可溶性蛋白(可溶性ST2或sST2)和一种跨膜形式蛋白(ST2L)。可溶性ST2在心肌受到过度牵拉受到损伤的过程中大量生成，作为一种诱骗受体，可以通过与ST2L竞争性结合IL-33，阻断经ST2L的信号转导，对IL-33/ST2L信号转导通路的效应进行负调节。可溶性ST2是一种机械应力诱导性蛋白，心力衰竭时可溶性ST2浓度升高机制可能是心衰时随着心脏容量负荷增加心肌细胞处于拉伸状态，在机械及炎症刺激的心肌细胞及心脏成纤维细胞可溶性ST2的表达量升高。
在临床上，急性心力衰竭和慢性心力衰竭患者血清可溶性ST2浓度明显升高，且升高水平与心衰严重程度呈正相关。另外，可溶性ST2水平升高可作为心力衰竭患者不良结局的危险预测因子。对心衰患者的随访发现，可溶性ST2浓度可预测患者1年死亡率并可提高死亡预测效能。目前市场主流产品为Critical公司的ST2反应试剂盒，总时间为120分钟；并且Critical公司的ST2试剂盒主要组份大多需要提前进行稀释或者溶解，对于操作人员实施较为繁琐，本发明具有检测速度快、操作简便、灵敏度高、特异性好、稳定性高，可以批量生产等特点。
发明内容
一方面，本发明提供了一种可溶性ST2蛋白检测试剂盒，其包含：
偶联有第一抗ST2蛋白单克隆抗体的磁珠和包含被标记物标记的第二抗ST2蛋白单克隆抗体的酶工作液，其中所述标记物选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、放射性标记和免疫荧光标记；其中所述第一抗ST2蛋白单克隆抗体和所述第二抗ST2蛋白单克隆抗体分别选自由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体；或者所述第一抗ST2蛋白单克隆抗体和所述第二抗ST2蛋白单克隆抗体分别选自由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。
一方面，本发明提供一种杂交瘤细胞，其于2017年10月23日提交于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏号为CGMCC No.14727，分类命名为ST2杂交瘤细胞株。
另一方面，本发明提供一种杂交瘤细胞，其于2017年10月23日提交于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏号为CGMCC No.14728，分类命名为ST2杂交瘤细胞株。
根据本发明的一些具体实施方案，提供了根据本发明的抗ST2蛋白单克隆抗体在制备诊断试剂中的用途。根据本发明的一些具体实施方案，提供了本发明的杂交瘤细胞在制备诊断试剂中的用途。本发明的两种抗ST2蛋白单克隆抗体可以单独用于制备诊断试剂，然而优选本发明的两种抗ST2蛋白单克隆抗体组合用于制备诊断试剂。在一些具体实施方案中，所述诊断试剂是可溶性ST2蛋白检测试剂。可溶性ST2蛋白检测试剂是指用于定量或定性检测人类样本中可溶性ST2蛋白的试剂。可溶性ST2蛋白检测试剂可检测人类样本中可溶性ST2蛋白的存在和/或含量。所述诊断试剂可以是现有技术中任何适当的形式，包括但不限于ELISA检测试剂、免疫比浊检测试剂、磁颗粒检测试剂、化学发光检测试剂、放射免疫检测试剂、免疫荧光检测试剂。实际上，本发明的抗ST2蛋白单克隆抗体或杂交瘤细胞可以用于制备任何基于抗原-抗体相互作用的检测试剂。在一些具体实施方案中，所述诊断试剂可以体现为液体形式、干粉、冻干粉形式、颗粒形式、多孔板形式或其它本领域公知的形式。
优选地，根据本发明所提供的可溶性ST2蛋白检测试剂盒的酶工作液中还包含酶缓冲液，所述酶缓冲溶液包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清和Proclin-300。当磁珠上的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞所产生时，则酶工作液中的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.14728的另一株杂交瘤细胞产生；反之亦然，当磁珠上的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞所产生时，则酶工作液中的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞产生。
在一个优选的实施方案中，所述磁珠和所述第一抗ST2蛋白单克隆抗体的质量比为10∶1至40∶1，优选20:1。
在又一个优选的实施方案中，所述包含标记的第二抗ST2蛋白单克隆抗体的酶工作液中第二抗ST2蛋白单克隆抗体的终浓度为1mg/L。
在一些具体实施方案，本发明的可溶性ST2蛋白检测试剂盒还可以根据需要包含样本稀释液、酶反应底物、ST2蛋白校准品和ST2蛋白质控品。样本稀释液包含盐、表面活性剂、缓冲成分，pH在5-8之间，优选6-7。在一些具体实施方案，样本稀释液包含NaCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、山羊血清、吐温20、Proclin-300，pH值6.2-6.6。在一些具体实施方案，样本稀释液可以配制成浓缩型。所述酶反应底物根据所标记的酶而改变，例如当使用辣根过氧化物酶时，适合的底物包括但不限于邻苯二胺(OPD)、ABTS、四甲基联苯胺(TMB)或4氨基安替比林等。当使用碱性磷酸酶时，适合的底物包括但不限于BCIP/NBT。
在一些具体实施方案中，本发明的ST2蛋白检测试剂盒包含：包被有本发明的一种抗ST2蛋白单克隆抗体的磁珠、酶工作液、样本稀释液、酶反应底物、ST2蛋白校准品和ST2蛋白质控品，其中酶工作液包含辣根过氧化物酶标记的另一种ST2蛋白单克隆抗体。
优选地，根据本发明所述的可溶性ST2蛋白检测试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含酶反应底物、ST2蛋白校准品和ST2蛋白质控品；其中
所述ST2蛋白校准品为已知ST2蛋白浓度的血清，其中ST2蛋白浓度分别为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、5ng/ml、0ng/ml，
所述ST2蛋白质控品为ST2蛋白浓度在80ng/ml至120ng/ml和16ng/ml至24ng/ml之间的血清。
在一个具体实施方案，本发明提供了一种可溶性ST2蛋白检测试剂盒，其包含：
偶联有第一抗ST2蛋白单克隆抗体的磁珠工作液，
酶工作液，
校准品稀释液，
化学发光液A，
化学发光液B，
酶反应底物，
ST2蛋白校准品，和
ST2蛋白质控品；
其中所述磁珠工作液包含预包被第一抗ST2蛋白单克隆抗体的磁性微球，按滴定浓度用含有磷酸氢二钠十二水：5.8g/L、磷酸二氢钠二水：0.59g/L、氯化钠：9g/L、BSA：10g/L、Tween-20：1ml/L、Proclin300：1ml/L；
所述酶工作液包含5.8g/L磷酸氢二钠、0.59g/L磷酸二氢钠、9.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、1.0g/L酶稳定剂和1ml/L Proclin-300；
所述校准品稀释液包含9.0g/L氯化钠、5.8g/L磷酸氢二钠十二水、0.59g/L磷酸二氢钠、10g/L牛血清白蛋白、50g/L蔗糖、1ml/L Proclin-300；
所述化学发光液A含鲁米诺和发光增强剂，化学发光液B含有过氧化物和发光增强剂；
所述酶反应底物为辣根过氧化物酶的底物；
所述ST2蛋白质控品为ST2蛋白浓度在80ng/ml至120ng/ml和16ng/ml至24ng/ml之间的血清；
所述第一ST2蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞所产生时，第二ST2蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞所产生。
另一方面，本发明提供了一种抗ST2蛋白单克隆抗体，其由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞产生或由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞产生。
另一方面，本发明提供了由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCCNo.14727的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的组合在制备用于检测可溶性ST2蛋白的试剂盒中的用途。
优选地，根据本发明所述的用途，所述试剂盒选自ELISA检测试剂盒、免疫比浊检测试剂盒、磁颗粒检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒和放射免疫检测试剂盒。
另一方面，本发明提供了一种可溶性ST2蛋白检测试剂盒，其包含：
由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。
优选地，根据本发明的试剂盒选自ELISA检测试剂盒、免疫比浊检测试剂盒、磁颗粒检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒和放射免疫检测试剂盒。
附图说明
图1.本发明所制备的可溶性ST2蛋白检测试剂盒中校准品的线性标准曲线。其中线性曲线拟合：
Log(Abs)＝3.694+1.028Log(Conc)；
相关系数＝1.00。
具体实施方式
为了使本发明易于理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
实施例1：单克隆抗体的获得
1.动物免疫
为了产生抗ST2单克隆抗体，选取6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠。初次免疫，取ST2重组抗原(抗原购自北京泽睿生物技术有限公司ST2protein(货号：0101512101)20-50μg加完全福氏佐剂皮下多点注射，第14和28天分别进行第二次和第三次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂腹腔内注射，融合前3天加强免疫，剂量20-50μg为宜，3天后，取脾融合。通常，制备鼠科来源的单克隆抗体，可参考《抗体》手册中描述的方法(Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor NY，pp.726，1988)或Kohler和Milstein描述的制备杂交瘤的技术(Nature，256:495-497，1975)。
2.细胞融合
制备饲养细胞层：取一只未免疫的Balb/c小鼠，6周，处死小鼠，浸泡在75％酒精内，5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)，反复冲洗，吸出冲洗液，冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离6min，用20％胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，放入37℃CO2孵箱培养。
制备免疫脾细胞：取免疫好的Balb/c小鼠，处死，无菌取脾脏，用10ml不完全培养液洗一次，脾脏研碎，过200目细胞筛，将脾细胞转移至10ml离心管中，800rpm离心10min，细胞用10ml培养液洗2次，细胞计数，取1×108脾淋巴细胞悬液备用。
制备骨髓瘤细胞SP2/0：取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数，取得5×107细胞备用。
细胞融合：将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm，8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
加入37℃预温的1ml 45％PEG(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。离心，800rpm，6min。充上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬。将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养。
3.杂交瘤细胞的筛选
脾细胞和骨髓瘤细胞融合后5天，形成多种细胞的混合体，补加HAT培养基100ul，第10天换HT培养基培养。杂交瘤细胞布满孔底1/5面积时，即可采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆。以ST2重组抗原包被酶标板(5μg/ml)100μl/孔，4℃过夜，将酶标板孔中的液体倒尽，加入PBST，重复洗涤三次；加入封闭液200μl/孔进行封闭，置于37℃，1小时。洗涤封闭液，加入100μl细胞培养上清，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培养上清，空白为洗涤液，于37℃静置2h。加入HRP标记羊抗鼠二抗(1:5000)100μl/孔，于37℃静置60min。加入PBST，重复洗涤三次；加入底物反应液100μl/孔，37℃置暗处反应10分钟。加入H2SO4(2mol/L)50μl/孔，终止反应。酶标仪检测450nm吸光度值。结果以ST2重组抗原免疫小鼠，成功得到分泌ST2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
4.杂交瘤的克隆化
筛选得到的阳性克隆，采用有限稀释法对杂交瘤克隆化，克隆前1天制备饲养细胞层，将要克隆的杂交瘤细胞用不完全培养基从培养孔内轻轻吹干，计数。调整细胞为5个细胞/ml。取准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5％CO2孵箱中。在第7天换液，以后每3天换液1次。9天可见细胞克隆形成，ELISA法检测检测抗体效价。并将最强的两株阳性克隆再次克隆化，直至细胞阳性率达100％，即可定株；定株的细胞扩大培养。
5.杂交瘤细胞的保藏
将能够分泌这两种单克隆抗体的杂交瘤细胞与2017年10月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号分别为CGMCC No.14727和CGMCCNo.14728。
实施例2.单克隆抗体的制备
将已保藏的二株杂交瘤细胞分别以1×107的细胞浓度注射于BALB/c小鼠腹腔，10天后分别收集腹水。通过以下步骤分别纯化两株单克隆抗体：
1)收集所得的腹水以2500rpm离心，取上清。加等体积的PBS(pH7.4)与1/2体积的饱和硫酸铵，4℃、静置30min；
2)以3000rpm，4℃，离心20min；
3)去沉淀，上清加等体积的饱和硫酸铵，静置30min；
4)以3000rpm，4℃，离心20min；
5)取沉淀，加5ml生理盐水与5ml饱和硫酸铵静置30min；
6)以3000rpm，4℃，离心20min；
7)沉淀加5ml生理盐水与5ml 0.02M的PBS(PH7.4)；
8)加8倍柱体积的PB缓冲液平衡Protein G凝胶柱(购自GE)；
9)将第7步中的混合液加到凝胶柱中；
10)使用10倍柱体积的PB缓冲液洗脱杂蛋白；
11)用0.2M pH2.8甘氨酸缓冲液洗脱抗体并收集；
12)使用再生液清洗柱子；
13)加平衡液(按GE推荐的)平衡柱子。
实施例3.检测试剂的制备
1.制备偶联有ST2第一抗体的磁珠：
磁珠偶联抗体：将磁珠摇匀后取出放入小瓶内，用0.05MMES清洗磁珠，清洗后加入EDC室温活化30分钟。根据磁珠的量按照磁珠和抗体的比例(质量比)10∶1、20∶1和40∶1分别加入ST2第一抗体(保藏号为CGMCC No.14727)离心管室温偶联过夜。磁分离吸出反应液分别加入PBST清洗2次，磁分离吸出洗液，再加入磁珠稀释液制成磁珠工作液(贮存液)，备用；
0.05M MES标准配方：
MES 10.67g
纯化水定容至1000ml。
磁珠稀释液：
磷酸氢二钠十二水：5.8g
磷酸二氢钠二水：0.59g
氯化钠：9g
BSA：10g
Tween-20：1ml
Proclin300：1ml
纯化水定容至1000ml。
清洗液：
磷酸氢二钠十二水：5.8g
磷酸二氢钠二水：0.59g
氯化钠：9g
Tween-20：0.5ml
纯化水定容至1000ml。
2.辣根过氧化物酶标记抗体的制备：
(1)称取1mg辣根过氧化物酶(HRP，购自Sigma)溶解于300μl蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.6μl新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，使用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl 1M PH9.5碳酸盐缓冲液，使HRP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入5mg本发明的另一株抗体(CGMCC No.14728)(在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中)，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)加0.05ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
(7)加入等体积的甘油，-20℃保存，最终辣根过氧化物酶标抗体浓度为1mg/ml。
3.采用棋盘法(矩阵法)确定最佳包被抗体与酶标记抗体的工作浓度。使用步骤1中偶联好的磁珠与抗体比例为10∶1、20∶1和40∶1的包被磁珠、步骤2的酶标抗体(工作浓度分别为：1:250、1:500和1:1000稀释)进行实验。确定最终磁珠与抗体偶联比例为20：1，包被磁珠浓度为0.2mg/ml(相当于500ng/孔的抗人ST2单克隆抗体)、酶标抗体工作浓度为1:500。
4.辣根过氧化物酶标记抗体工作液的配制：
将2步骤中制备的辣根过氧化物酶的单克隆抗体，以1：500的比例溶于酶缓冲液中。酶缓冲液配方为：5.8g/L磷酸氢二钠、0.59g/L磷酸二氢钠、9.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、1.0g/L酶稳定剂和1ml/L Proclin-300。辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体的终浓度为1mg/L。
5.校准品稀释液的制备：
1000ml校准品稀释液包括9.0g氯化钠、5.8g磷酸氢二钠十二水、0.59g磷酸二氢钠、10g牛血清白蛋白、50g蔗糖、1ml Proclin-300。
6.化学发光液A含鲁米诺和发光增强剂，化学发光液B含有过氧化物和发光增强剂。
7.校准品的赋值与配制：
按对比试剂盒说明书操作，以工作校准品定标，对校准品稀释液稀释的ST2高值人源样本进行检测。在不同实验室、不同操作者条件下，重复独立测定20次，得出20次测量结果的RLU值(发光强度值)。选择RLU值稳定的人源样本作为产品校准品，计算其平均值根据纯品配制的工作校准品约定的校曲方程，将所对应的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为产品校准品靶值。用校准品稀释液根据赋值结果配制校准品：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、5ng/ml、0ng/ml。
9.质控品的配制：
收集人ST2临床检测高值的人样本(血清或血浆)，用校准品稀释液稀释高值人血清至期望的浓度范围内。高值质控：80ng/ml至120ng/ml；低值质控：16ng/ml至24ng/ml。2-8℃保存备用。
10.将上述各试剂组装成试剂盒，根据需要还可以在试剂盒中并入使用说明书、反应杯、配套磁架等工具。
测试例：
测试例1.本公开人ST2化学发光试剂盒的使用方法
1.实验前准备
自4℃冰箱中取出试剂盒，均应平衡到室温(18-25℃)。
2.试验方法
2.1加样温育：取足够数量的反应板或反应杯，固定于框架上，分别设置校准品孔、质控品孔和待测样本孔，记录各孔位置。按顺序在样本孔中分别加入10μl的待测样本，在校准品孔中加入校准品10μl，在质控品孔加入质控品10μl，每孔再分别加入50μl包被磁珠工作液和50μl酶工作液，充分混匀，于37℃下温育10min。
2.2清洗：
手工清洗：将反应板或反应杯放置在配套磁架上静止吸附2分钟，吸出反应液，移去磁架，每孔加入300μl洗涤液，混匀磁珠，将反应板或反应杯放置在配套磁架上静止吸附2分钟，吸出洗涤液，重复冲洗3次；
配套仪器清洗：按照仪器操作说明，设置好程序，将磁珠置于相应磁架上，静止吸附后吸出反应液，离开磁架，每孔加入400μl清洗液，震荡混匀后将磁珠置于磁架上静止吸附，吸出清洗液，重复操作3次。
2.3加发光液：每孔加入50μl化学发光液A和50μl化学发光液B，充分混匀。
2.4测定：将加了发光液的反应板或反应杯置化学发光仪下测定RLU值。
2.5计算：根据校准品的浓度及对应的RLU，均以校准品S0孔调零(包括校准品S1-S5、质控品和待检测样本)。使用双对数线性拟合方式(log(X)-log(Y))计算结果(S0不参与计算)。
线性方程为log(RLU)＝2.694+1.028log(浓度)；r＝1。
以下表表示ST2磁微粒化学发光试剂盒校准曲线检测RLU值。
表1
浓度(ng/ml) RLU值1 RLU值2 RLU(均值)
0 164 149 157
5 2524 2525 2525
20 10987 11430 11209
50 27431 28485 27958
100 53161 54284 53723
200 112130 120033 116082
低值质控 10236 10234 10235
高值质控 55423 54657 55040
使用发明的ST2检测试剂盒总体反应时间为10分钟，而市场主流产品Critical公司的ST2反应总时间为120分钟；并且Critical公司的ST2试剂盒主要组份大多需要提前进行稀释或者溶解，对于操作人员实施较为繁琐。
测试例2.本公开人ST2化学发光试剂盒的方法学指标
1.准确度：回收率应在85％至115％之间；
2.空白检出限：应不高于1ng/ml；
3.测量***的线性：在1ng/ml至200ng/ml范围内线性相关系数r≥0.9900。
4.重复性：批内变异系数CV批内应不超过8％；
5.批间差：批间变异系数CV批间应不超过10％。
表2表明准确性、最低检出限、***线性、重复性检测结果。
表2
6.分析特异性：
分别检测人ST2阴性样本N1、阳性样本P1标本。
在N1、P1样本中分别添加三个浓度梯度的交叉反应原，检测交叉反应原对ST2抗体检测的交叉反应情况：
人心肌肌钙蛋白C(cTnC)浓度(1000ng/ml、500ng/ml、0ng/ml)；
人心肌肌钙蛋白T(cTnT)浓度(1000ng/ml、500ng/ml、0ng/ml)；
人骨骼肌肌钙蛋白I(cTnI)浓度(1000ng/ml、500ng/ml、0ng/ml)。
交叉反应原通常是与待测物质具有较高的同源性、序列相似或者具有相似检测意义的蛋白。可以想象，如果样本中存在这些交叉反应原时，抗体可能会识别并结合这些交叉反应原，导致假阳性。因此，诊断试剂盒的交叉反应性是一项重要的指标。这对于临床结果的可靠性非常重要。
从表5可见，当人心肌肌钙蛋白C不大于1000ng/ml、人人心肌肌钙蛋白T不大于1000ng/ml、人骨骼肌肌钙蛋白I不大于1000ng/ml时，对人ST2的检测结果没有明显影响。展示出本公开试剂盒优良的抗交叉反应性。
7.稳定性
7.1试剂盒各组份在37℃条件下存放3天、6天、8天后参数检测结果见表3。
表3：37℃存放稳定性实验结果
7.2试剂盒各组份在4℃条件下存放6个月、12个月、14个月后参数检测结果见表4。
表4：4℃存放稳定性实验结果
R-H、R-L分别代表高值准确度参考品、低值准确度参考品。试剂盒保存稳定性良好，可以在37℃条件下存放8天，在4℃条件下可以存放12个月。
8.干扰物质分析
8.1血红蛋白，实验结果见表6。
结论：根据结果，当血红蛋白≤200mg/ml内，对人ST2抗原检测结果无明显影响。
8.2甘油三酯，实验结果见表7。
结论：当甘油三酯浓度在4000mg/dl内，对人ST2抗原检测结果没有显著性影响。
8.3胆红素，实验结果见表8。
结果分析：当胆红素浓度不大于20mg/dl时，对人ST2抗原检测结果无明显影响。
8.4人IgG，实验结果见表9。
结果分析：当人IgG浓度不大于20mg/ml时对人ST2抗原检测结果无明显影响。

Claims (10)

1.一种可溶性ST2蛋白检测试剂盒，其包含：
偶联有第一抗ST2蛋白单克隆抗体的磁珠和包含被标记物标记的第二抗ST2蛋白单克隆抗体的酶工作液，其中所述标记物选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、放射性标记和免疫荧光标记；其中所述第一抗ST2蛋白单克隆抗体和所述第二抗ST2蛋白单克隆抗体分别选自由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体；或者所述第一抗ST2蛋白单克隆抗体和所述第二抗ST2蛋白单克隆抗体分别选自由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的可溶性ST2蛋白检测试剂盒，其中所述磁珠和所述第一抗ST2蛋白单克隆抗体的质量比为10∶1至40∶1，优选20:1。
3.根据权利要求1或2所述的可溶性ST2蛋白检测试剂盒，其中所述包含被标记物标记的第二抗ST2蛋白单克隆抗体的酶工作液中第二抗ST2蛋白单克隆抗体的终浓度为1mg/L。
4.根据权利要求3所述的可溶性ST2蛋白检测试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含酶反应底物、ST2蛋白校准品和ST2蛋白质控品；其中
所述ST2蛋白校准品为已知ST2蛋白浓度的血清，其中ST2蛋白浓度分别为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、5ng/ml、0ng/ml，
所述ST2蛋白质控品为ST2蛋白浓度在80ng/ml至120ng/ml和16ng/ml至24ng/ml之间的血清。
5.一种抗ST2蛋白单克隆抗体，其选自由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。
6.一种杂交瘤细胞，其选自2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞。
7.由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的组合在制备用于检测可溶性ST2蛋白的试剂盒中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，所述试剂盒选自ELISA检测试剂盒、免疫比浊检测试剂盒、磁颗粒检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒和放射免疫检测试剂盒。
9.一种可溶性ST2蛋白检测试剂盒，其包含：
由2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14727的杂交瘤细胞和2017年10月23日保藏在CGMCC的保藏号为CGMCC No.14728的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的ST2蛋白检测试剂盒，所述试剂盒选自ELISA检测试剂盒、免疫比浊检测试剂盒、磁颗粒检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒和放射免疫检测试剂盒。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108982871A (zh) * 2018-07-19 2018-12-11 北京市心肺血管疾病研究所 血清sST2在小儿扩张型心肌病预后中的应用
CN110208549A (zh) * 2019-07-01 2019-09-06 北京利德曼生化股份有限公司 一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白sST2发光试剂盒
CN112710841A (zh) * 2020-12-15 2021-04-27 深圳天辰医疗科技有限公司 St2蛋白检测试剂盒和检测方法
WO2021164109A1 (zh) * 2020-02-21 2021-08-26 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 一种检测可溶性st2含量的酶联免疫检测试剂盒及用途
CN113777324A (zh) * 2021-09-10 2021-12-10 普十生物科技(北京)有限公司 生长刺激表达因子2即时检测试剂盒、其制备方法及应用
CN113846066A (zh) * 2021-09-15 2021-12-28 海珂分子（北京）科技有限责任公司 分泌st2抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102830234A (zh) * 2012-08-10 2012-12-19 杭州华得森生物技术有限公司 一种检测人心力衰竭新型标志物st2的快速诊断试剂盒
CN103487586A (zh) * 2013-09-04 2014-01-01 石家庄洹众生物科技有限公司 一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置
CN104151416A (zh) * 2013-05-15 2014-11-19 中国科学院上海巴斯德研究所 抗人sST2单克隆抗体及其应用
CN106199002A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 河南华程氏生物科技股份有限公司 一种用于检测st2的化学发光免疫分析试剂盒、制备方法及应用
CN107340386A (zh) * 2017-06-09 2017-11-10 厦门大学附属中山医院 基于微粒子化学发光免疫分析的sST2检测试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102830234A (zh) * 2012-08-10 2012-12-19 杭州华得森生物技术有限公司 一种检测人心力衰竭新型标志物st2的快速诊断试剂盒
CN104151416A (zh) * 2013-05-15 2014-11-19 中国科学院上海巴斯德研究所 抗人sST2单克隆抗体及其应用
CN103487586A (zh) * 2013-09-04 2014-01-01 石家庄洹众生物科技有限公司 一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置
CN106199002A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 河南华程氏生物科技股份有限公司 一种用于检测st2的化学发光免疫分析试剂盒、制备方法及应用
CN107340386A (zh) * 2017-06-09 2017-11-10 厦门大学附属中山医院 基于微粒子化学发光免疫分析的sST2检测试剂盒

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108982871A (zh) * 2018-07-19 2018-12-11 北京市心肺血管疾病研究所 血清sST2在小儿扩张型心肌病预后中的应用
CN108982871B (zh) * 2018-07-19 2021-09-24 北京市心肺血管疾病研究所 血清sST2在小儿扩张型心肌病预后中的应用
CN110208549A (zh) * 2019-07-01 2019-09-06 北京利德曼生化股份有限公司 一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白sST2发光试剂盒
WO2021164109A1 (zh) * 2020-02-21 2021-08-26 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 一种检测可溶性st2含量的酶联免疫检测试剂盒及用途
CN112710841A (zh) * 2020-12-15 2021-04-27 深圳天辰医疗科技有限公司 St2蛋白检测试剂盒和检测方法
CN113777324A (zh) * 2021-09-10 2021-12-10 普十生物科技(北京)有限公司 生长刺激表达因子2即时检测试剂盒、其制备方法及应用
CN113846066A (zh) * 2021-09-15 2021-12-28 海珂分子（北京）科技有限责任公司 分泌st2抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN113846066B (zh) * 2021-09-15 2024-06-07 海珂分子（北京）科技有限责任公司 分泌st2抗体的杂交瘤细胞株及其应用

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