CN107988351A - 一种环状dna在正义rna的检测、成像及基因治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种环状DNA在正义RNA的检测、成像及基因治疗中的应用，所述环状DNA至少包含一个或多个与检测目标正义RNA序列互补的DNA探针片段，所述环状DNA由ssDNA自身的3’和5’端连接环化形成。通过使环状DNA与检测目标正义RNA形成杂合双链，使杂合双链从载体上脱离，从而（1）实现相应的荧光信号变化实现检测、成像的应用；（2）使杂合双链中的正义RNA被酶分解，从而实现基因治疗的目的。

Description

一种环状DNA在正义RNA的检测、成像及基因治疗中的应用
技术领域
本发明涉及环状DNA在检测、成像及基因治疗领域中的应用，尤其涉及一种环状DNA在正义RNA检测、成像及基因治疗中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
DNA除了作为生物体的遗传物质之外，近年来被认为是构建分子探针的理想结构单元，并广泛用于生物分析和生物医药领域，包括核酸适体、分子信标和DNAzyme在内的多种功能化DNA被用于生物传感、诊断和疾病治疗。DNA具有合成简单、适合进行结构修饰、选择性和亲和性高等优点，但同时DNA应用于生物活体中所面临的最大阻碍是稳定性和生物利用率不够高，因而会产生由于蛋白干扰和酶降解导致的假阳性信号或者治疗效果不理想。因此，许多方法都被用于克服这些问题。
根据早期的研究，经过不同化学修饰合成的核酸衍生物由于无法被内源性的核酸分解机制识别，例如在DNA的磷酸骨架上进行硫代磷酸化修饰、锁核酸取代物、2’-糖基位点被甲氧基和氟取代等。除了这些修饰方法之外，环化也为提高核酸稳定性提供了另一种可能性。
上世纪90年代，人们发现生命体内除了线状核酸还存在另一种核酸——环状RNA（circRNA）。近年来，大量研究开始关注内源性circRNA，这些研究主要集中于将利用circRNA通过海绵调节机制对相关miRNA或者蛋白的活性进行调节。由于circRNA结构上缺少游离的末端，它具有很好的稳定性，在活体内的半衰期从几小时到几天不等。另外，与其他化学修饰方式相比，核酸的环化只需要天然核苷酸参与，避免了由于引入非天然核酸可能带来的潜在毒性。
因此，近年来开发了一些用于体外合成环状核酸的方法，它们不仅适用于RNA环化也被拓展用于DNA的环化。鉴于环化核酸的诸多优点，本发明中构建了一种简单的环状DNA探针用于生物活体。虽然目前已经有较多关于环状DNA的合成和性质的研究，但是未见将其应用于活体的检测、成像和基因治疗。
发明内容
本发明提供了一种环状DNA在正义RNA的检测、成像及基因治疗中的应用，所述环状DNA至少包含一个或多个与检测目标正义RNA序列互补的DNA探针片段，所述环状DNA由ssDNA自身的3’和5’端连接环化形成。通过使环状DNA与检测目标正义RNA形成杂合双链，从而（1）实现相应的荧光信号变化实现检测、成像的应用；（2）使杂合双链从载体上脱离，使正义RNA被酶分解，从而实现基因治疗的应用。
本发明首次将环状DNA探针用于正义RNA的检测；进一步的，将环状DNA探针用于细胞内正义RNA的检测和基因治疗；再进一步的，将环状DNA与氧化石墨烯等类似性能的核酸载体结合构建生物传感平台用于活细胞内正义RNA的检测和基因治疗。
本发明提供的具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种环状DNA在正义RNA的检测或成像中的应用，具体的，所述环状DNA包含一个或多个与检测目标正义RNA序列互补的DNA探针片段、荧光标记物；所述环状DNA由ssDNA自身的3’和5’端连接环化形成。
具体的，环状DNA由ssDNA自身连接环化而成的过程如下：（1）加入引物序列作为引发剂形成局部双链结构后，在T4 DNA连接酶催化下反应；（2）升温使连接酶失活；（3）加入外切酶将未反应的ssDNA和引物序列降解；（4）加热使外切酶失活；（5）产物纯化，得到纯净的环状DNA，根据需要可以通过紫外-可见分光光度计测定260nm处的吸光度进行定量。
本发明采用通用的荧光标记物，例如：荧光素类的异硫氰酸荧光素（FITC）、羟基荧光素（FAM）、四氯荧光素（TET）等；菁染料类的Cy3、Cy5等；以及菲锭类、罗丹明类、量子点类等荧光标记物。
进一步的，该方法包括如下步骤：（1）将所述环状DNA与荧光淬灭剂复合形成复合探针；（2）使所述复合探针与包含检测目标正义RNA的待检测物相互作用，形成环状DNA与正义RNA的杂合双链；（3）检测所述环状DNA与正义RNA的杂合双链的荧光强度。
进一步的，所述荧光淬灭剂具有荧光淬灭能力，并且与单链核酸的结合能力高于与双链核酸的结合能力。作为优选的，所述荧光淬灭剂为氧化石墨烯、碳纳米管、氮化碳纳米片、二氧化锰纳米片或氮化硼纳米片。具体的，例如氧化石墨烯（GO）是一种具有平面结构以及许多特殊性能的二维纳米材料。由于氧化石墨烯具有高负载量、淬火能力和细胞运输能力，被广泛应用于与核酸共同构建功能化平台，例如分子探针、细胞成像以及药物递送等。
进一步的，为提高检测效率，所述环状DNA包含两个以上的与检测目标正义RNA序列互补的DNA探针片段，还包括连接各DNA探针片段的连接片段。
进一步的，作为一般的选择，诉述正义RNA为mRNA、siRNA或microRNA。
进一步的，本发明实现了体内检测，具体的为，步骤（2）中所述包含检测目标正义RNA的待检测物为细胞，所述复合探针与细胞共同孵育，在细胞内形成环状DNA与正义RNA的复合物。
第二方面，本发明提供了一种环状DNA在正义RNA的基因治疗中的应用，包括如下步骤：使负载所述环状DNA的核酸载体进入与包含检测目标正义RNA的细胞中，形成环状DNA与正义RNA的杂合双链并从所述核酸载体上脱离，所述杂合双链中的正义RNA被酶分解，相关基因的表达过程受阻；所述环状DNA包含一个或多个与检测目标正义RNA序列互补的DNA探针片段；所述环状DNA由ssDNA自身的3’和5’端连接环化形成。
进一步的，为提高基因治疗效果，所述环状DNA包含两个以上的与检测目标正义RNA序列互补的DNA探针片段，还包括连接各DNA探针片段的连接片段。
进一步的，所述正义RNA为mRNA、siRNA或microRNA；所述核酸载体为氧化石墨烯、碳纳米管、氮化碳纳米片、二氧化锰纳米片或氮化硼纳米片。具体的，氧化石墨烯（GO）是一种具有平面结构以及许多特殊性能的二维纳米材料。由于氧化石墨烯具有高负载量、淬火能力和细胞运输能力，被广泛应用于与核酸共同构建功能化平台，例如分子探针、细胞成像以及药物递送等。
本发明的技术方案相比于现有技术至少达到如下有益效果：
（1）由于环状DNA具有许多优于单链DNA（ssDNA）的性质，例如更强的抗酶切能力以及在生物流体内的稳定性，本发明利用环状DNA对细胞内的反义RNA进行识别效率更高、稳定性更好。
（2）引入具有荧光淬灭能力，并且与单链核酸的结合能力高于与双链核酸的结合能力的荧光淬灭剂，如氧化石墨烯与环状DNA进行复合，实现了在活细胞内进行高效的成像和治疗由于环状DNA缺乏游离末端，不易被核酸外切酶降解，且环状DNA与荧光淬灭剂的亲和性较高，环状DNA在活细胞或者活体内不易产生受核酸酶以及蛋白干扰产生非特异性检测信号，具有更高的信噪比和较低的假阳性信号。
（3）由于环状DNA缺乏游离末端，不易被核酸外切酶降解，因此，环状DNA在活细胞或者活体内滞留时间更长，用于基因治疗时效率更高。
（4）核酸探针复合物在通过内吞途径进入细胞后，会进入细胞内的酸性并富含大量酶的囊泡中，包括早期内涵体、晚期内涵体和溶酶体。由于环状DNA具有更高的稳定性，能够使它在内涵体/溶酶体中不被降解，最终逃逸到细胞质中，与目标正义RNA结合发挥检测和基因治疗的功能。
（5）环状DNA能够更有效地抑制正义RNA的翻译，从而更有效地抑制靶标蛋白的表达进而抑制细胞的增殖。
因此，环状DNA能够在生物活体内作为高效的生物检测、传感和治疗工具。
附图说明
图1为环状DNA与相应的ssDNA在细胞内正义RNA检测、成像及基因治疗中的应用的示意图。
图2为（a）环状DNA和ssDNA的凝胶电泳图；（b）环DNA和ssDNA在含10%血清中孵育不同时间后产物的凝胶电泳图。
图3a Cy5-环状DNA和Cy5-ssDNA在不同溶液环境中的FP值。
图3b Cy5-环状DNA/GO在不同浓度目标mRNA溶液中的荧光发射光谱。
图3c Cy5-环状DNA/GO和Cy5-ssDNA/GO在10%FBS溶液中荧光动力学曲线。
图3d Cy5-环状DNA/GO和Cy5-ssDNA/GO在与完全互补目标mRNA序列（实线）或单碱基突变目标mRNA序列（虚线）共孵育后的荧光动力学曲线。
图4为（a）环状DNA和ssDNA与GO结合的lg(F0/F-1)-lgCGO曲线；（b）环状DNA/GO和ssDNA/GO在对目标mRNA产生响应时的荧光动力学曲线；（c）Cy5-环状DNA和Cy5-ssDNA被不同浓度GO淬灭荧光的比例；（d）Cy5-环状DNA/GO和Cy5-ssDNA/GO在检测10%血清溶液中目标序列的信背比S/B。
图5为HeLa细胞与survivin mRNA靶向的（a）Cy3-环状DNA/GO或（b）Cy3-ssDNA/GO共孵育不同时间后的激光共聚焦图像。
图6为 MCF-10A细胞与survivin mRNA和c-raf mRNA靶向的环状DNA/GO或ssDNA/GO共孵育60min后的激光共聚焦图像。
图7a为环状DNA/GO在HeLa细胞内的亚细胞定位共聚焦图像。
图7b ssDNA/GO在HeLa细胞内的亚细胞定位共聚焦图像。
图8为（a）HeLa细胞与不同浓度环状DNA/GO或ssDNA/GO共孵育24h后的细胞存活率；HeLa细胞与不同浓度环状DNA/GO或ssDNA/GO共孵育24h后（b）survivin和（c）c-raf激酶的蛋白表达量。
图9为 MCF-10A细胞与不同浓度环状DNA/GO或ssDNA/GO共孵育24h后的细胞存活率。
具体实施方式
以下，使用实施例和对比例更加详细地说明本发明的具体实施示例，本发明的技术范围不限于以下实施例。
为直观的表现本发明实施例与对比例的技术内容，参见图1做如下解释：
如图1所示，本发明实施例（图1中左侧部分）中环状DNA含有与目标正义RNA互补的序列，当目标正义RNA存在时，形成环状DNA/正义RNA双链杂合物并从载体（以氧化石墨烯GO为例，作为荧光淬灭剂和核酸载体）上脱落。与ssDNA（图1中右侧部分）不同的是，环状DNA具有更强的稳定性能够耐受细胞内含体以及细胞质内的酶降解。因此，环状DNA/GO在细胞内具有好的效率和性能。本发明不仅探讨了环状DNA/GO在细胞内的命运，同时在正义RNA成像以及基因治疗方面的效率也进行了研究。
本具体实施方式中涉及的实验用品及相关验证方法如下：
（1）化学试剂：所有核酸（序列见表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并经HPLC纯化。GO水分散液购于北京纳诺昂纳米材料科技有限公司。LysoTracker Green和Hoechst 33342购于美国赛默飞世尔科技公司。T4 DNA连接酶购于NEB(北京)有限公司。外切酶Ⅰ和Ⅲ购于宝生物工程（大连）有限公司。超纯水由Milli-Q水净化***制备（18.2MΩ）。
（2）细胞系和细胞培养：人宫颈上皮癌细胞HeLa和正常人乳腺上皮细胞MCF-10A购于美国模式培养物保藏所（ATCC）。HeLa细胞培养于RMPI 1640培养基（HyClone）添加10%胎牛血清（Gibco）和100 IU/mL 青霉素-链霉素，在37℃含5% CO2的气氛中进行培养。MCF-10A细胞生长于含有霍乱毒素的乳腺上皮细胞培养基MEGM kit（Lonza），在37℃含5% CO2的气氛中进行培养。
实施例1
环状DNA的制备：通过ssDNA自身连接环化而成，加入引物序列作为引发剂形成局部双链结构后，在T4 DNA连接酶催化下16℃反应过夜，随后在65℃下放置10min使连接酶失活。接着加入外切酶Ⅰ和Ⅲ于37℃反应1h将未反应的ssDNA和引物序列降解，再加热到90℃保持10min使酶失活。最终，用QIAEX Ⅱ凝胶回收试剂盒（Qiagen）对产物进行纯化，得到纯净的环状DNA，通过紫外-可见分光光度计测定260nm处的吸光度进行定量。
本实施例1中以Survivin mRNA作为目标正义RNA，相应ssDNA及正义RNA的序列参见表1。
对比例1
直接以实施例1中的ssDNA替代环状DNA，其余实验条件均相同。
表1 实施例1和对比例1中采用的ssDNA及正义RNA的序列表
注： survivin探针的目标序列是总长度为2655-bp的survivin mRNA的NO.304-NO.323碱基区间（GenBank中编号为NM001168）
实施例2
采用c-raf mRNA作为目标正义RNA，相应的环状DNA的制备同实施例1，相应ssDNA及正义RNA的序列参见表2。
对比例2
直接以实施例2中的ssDNA替代环状DNA，其余实验条件均相同。
表2 实施例2和对比例2中采用的ssDNA及正义RNA的序列表
注： c-raf 探针的目标序列是总长度为3282-bp的c-raf mRNA的NO.2771-NO.2790碱基区间（GenBank中编号为NM002880）
（一）相关实验过程
将实施例1、对比例1、实施例2、对比例2中的相关环状DNA、ssDNA进行以下相关实验：
A. 血清中DNA稳定性评价：
用含10%胎牛血清的RPMI 1640配制2μM 环状DNA或ssDNA溶液置于37℃下孵育。在各时间点进行取样，在95℃加热5min使血清中的酶失活，样品-80℃保存备用。
B. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析：
环状DNA的不同性质分别用尿素变性PAGE和非变性PAGE进行分析。前者用于鉴定环状DNA是否成功合成，后者用于验证环状DNA与目标mRNA的结合能力以及DNA的稳定性。
C. 溶液中的荧光实验：
Cy5标记的环状DNA或者ssDNA-2用于进行荧光光谱分析实验，采用的激发光波长为640nm，采集波长位于650-750nm范围内的发射光谱。
D. 荧光共聚焦显微镜分析：
将细胞接种到35mm共聚焦皿里培养24h后，加入荧光标记的环状DNA/氧化石墨烯GO或ssDNA/氧化石墨烯GO。经过在37℃不同时间的共孵育，用LysoTracker Green和Hochest3324进行染色，清洗后进行荧光共聚焦成像。
E. 细胞毒性分析：
环状DNA/氧化石墨烯GO或ssDNA/氧化石墨烯GO的基因治疗效果通过CCK-8进行分析。用酶标仪测定吸光度，计算细胞存活率。
F. 蛋白质印迹分析：
HeLa细胞培养24h后，加入环状DNA/氧化石墨烯GO或ssDNA/氧化石墨烯GO用于细胞的基因调控。共孵育24h后，将细胞收集加入细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂来提取细胞的全蛋白。得到的蛋白提取液用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。取蛋白提取物与上样缓冲液混合后在SDS-PAGE内进行电泳，随后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将膜浸泡到含有封闭液的平皿中封闭。将膜浸泡在含有目标蛋白的一抗anti-survivin或者anti-raf1的溶液中，4℃孵育过夜。再将膜浸泡到含有标记有HRP的二抗的溶液中，4℃孵育后，加入HRP检测试剂进行化学发光成像。
（二）相关实验结果
A. 环状DNA的性质：
实施例1、对比例1、实施例2、对比例2中选择了2种蛋白的mRNA作为检测和治疗的目标——survivin和c-raf激酶，两种蛋白在多种肿瘤细胞中高表达，可作为肿瘤的生物标志分子。
合成的环状DNA的序列中包含了3段与目标正义RNA互补的DNA序列，在目标正义RNA存在时发生互补杂交形成环状DNA/正义RNA杂合物。通过凝胶电泳验证环状DNA合成成功，环化后的DNA在凝胶中迁移速率降低，出现了分子量高于同样序列的ssDNA（图2a）。另外，环状DNA在血清中的稳定性也通过电泳进行检验（图2b），可以看到ssDNA在含有胎牛血清的培养基中3h后被完全降解，然而环状DNA直到8h后才出现明显降解，因此环状DNA在生物体系中具有更高的抗酶解能力。
为了构建传感平台，需要对环状DNA与氧化石墨烯GO间的相互作用强度进行考察。采用荧光分子标记的环状DNA进行下列实验。首先，通过荧光偏振（FP）对环状DNA与GO的结合进行验证，荧光偏振反映的是荧光分子受所处微环境影响导致分子转动能力发生变化。如图3a所示，Cy5-环状DNA的FP值很低，当加入GO后，FP值增加，说明Cy5-环状DNA吸附在GO表面形成复合物。再加入目标正义RNA，FP值再次降低至与Cy5-环状DNA的初始值接近的水平。这个变化过程说明在目标正义RNA存在的情况下，环状DNA与目标正义RNA形成环状DNA/正义RNA杂合物并从GO表面脱离。其次，通过测定结合动力学来评价环状DNA与ssDNA在结合GO时亲和性的差异。根据公式1结合常数K A
公式1
式中，F0和F分别为在无和有GO存在时Cy5-环状DNA的荧光强度。如图4a所示，在低GO浓度范围内（0-0.8μg·mL-1），K A 的数值等于曲线的斜率。在相同条件下环状DNA/GO的KA值（1.212 mL·μg-1）高于ssDNA/GO（0.060 mL·μg-1），说明环状DNA与GO结合的亲和力强于ssDNA。另外，在目标正义RNA存在的情况下，环状DNA/GO和ssDNA/GO的荧光-时间曲线也反映出相似的结论（如图4b）。当溶液中存在目标正义RNA时，环状DNA从GO上脱离的速率要低于ssDNA。根据上述实验数据得出相比于ssDNA，环状DNA与GO的结合亲和性更强。
B. 溶液中mRNA检测：
将环状DNA与GO结合构建识别目标正义RNA的生物传感平台，首先在溶液体系中考察其性能，包括灵敏度、选择性和抗干扰能力。首先，对GO的剂量进行优化，配置从1μg/mL到4μg/mL不同浓度的GO溶液加入含有100nM 环状DNA的结合缓冲液，37℃孵育10min后测定665nm处的荧光强度，根据测定曲线得到GO的最优浓度为3μg/mL（如图4c）。其次，进行检测限的测定，先在结合缓冲液中制得的Cy5-环状DNA/GO或Cy5-ssDNA/GO复合物，向溶液中加入浓度为1 nM到1000 nM的目标正义RNA，在37℃孵育后，测定荧光发射光谱。溶液荧光强度发现随着正义RNA浓度的增加荧光强度逐步增强，并且在一定范围内，荧光强度与正义RNA的浓度是成比例变化的（图3b）。根据三倍信噪比的标准，环状DNA/GO对目标正义RNA的检测限可达到0.4nM，略低于ssDNA/GO的检测限。生物体内的DNA/RNA结合蛋白和内源性核酸酶产生的非特异性干扰是限制DNA生物传感器在生物活体内的应用。为了解决这个问题，环状DNA/GO在复杂溶液环境中的检测能力是另一个重要的评价标准。通过对比环状DNA/GO和ssDNA/GO在含10% FBS的溶液中荧光的动态变化曲线（如图3c）可以发现，ssDNA/GO出现了非常明显的荧光信号，而环状DNA/GO的荧光值基本保持不变，说明ssDNA/GO在复杂溶液环境中会产生更强的假阳性信号，环状DNA/GO在生物体系中更加稳定几乎不产生非特异性的响应信号。随后，继续对环状DNA/GO在血清中的目标检测能力进行考察。Cy5-环状DNA/GO或者Cy5-ssDNA/GO用于检测溶于含有10%血清的缓冲液中的目标正义RNA，孵育30min后，记录发射光谱如图4d所示，Cy5-环状DNA/GO的背景荧光信号明显低于Cy5-ssDNA/GO，当目标正义RNA存在时，Cy5-环状DNA/GO的荧光明显增强，而Cy5-ssDNA/GO的荧光增强较弱，说明环状DNA/GO具有较ssDNA/GO更强的抗干扰能力。最后，为了考察环状DNA/GO识别目标的特异性，分别用Cy5-环状DNA/GO和Cy5-ssDNA/GO对溶液中的目标正义RNA或者单碱基错配的正义RNA（1-mut）进行检测。加入300nM完全互补的目标正义RNA或者单碱基错配的正义RNA序列后，监测2h内的荧光强度变化得到动力学曲线。如图3d所示，环状DNA/GO比ssDNA/GO具有更强的目标选择性。
另外，引入选择性系数α对检测的选择性进行定量分析，，其中或表示探针在溶液中存在目标或时的信背比的数值，定义探针对完全互补序列的目标正义RNA的选择性为标准值，即。环状DNA/GO和ssDNA/GO对单碱基错配的正义RNA序列的选择性系数分别为0.313和0.745，说明环状DNA/GO对单碱基错配的识别能力优于ssDNA/GO。综上，由于环状DNA具有抗酶解、与GO亲和性高的优点，利用环状DNA/GO对目标正义RNA进行检测能够获得更高的灵敏度、更低的背景信号以及更好的选择性。
C. 细胞内正义RNA成像：
将构建的传感探针用于活细胞内的正义RNA成像。选择高表达survivin和c-raf 正义RNA的宫劲癌细胞HeLa作为阳性细胞系，正常乳腺细胞MCF-10A作为阴性细胞系。利用激光共聚焦显微镜对细胞内的survivin 正义RNA进行实时成像，向细胞培养基内加入Cy3-环状DNA/GO进行共培养，15min后HeLa细胞内观察到明显的荧光且荧光强度随着孵育时间延长而增强（图5a），而即使加入Cy3-ssDNA/GO共培养60min后产生的荧光也很弱（图5b）。值得注意的是，在与MCF-10A细胞共培养后，Cy3-环状DNA/GO基本观察不到荧光产生，说明由于缺乏目标正义RNA在阴性细胞内环状DNA/GO产生的背景信号非常微弱，相较而言，Cy3-ssDNA/GO在阴性细胞内会产生非特异性的荧光信号，这可能是由于在细胞内受到蛋白干扰以及发生酶解产生的背景荧光信号（图6）。上述实验表明，即使应用与活细胞体系，环状DNA/GO具有优于ssDNA/GO的灵敏度和特异性。
D. 亚细胞定位分析：
大多数的外来物质被内吞进入细胞后都无可避免地进入了内含体/溶酶体内，在这样一个高酸度且富含酶的微环境中，大多数未经修饰的单链DNA会被迅速降解导致功能丧失。为了研究环状DNA/GO进入细胞后的命运，对环状DNA/GO的亚细胞分布进行了研究，重点关注与内含体/溶酶体的共定位情况。在与Cy5-环状DNA/GO或Cy5-ssDNA/GO共孵育一段时间后，用LysoTracker Green染料对HeLa细胞进行染色，使细胞内的酸性细胞器标记上绿色荧光。如图7，通过共聚焦显微镜观察细胞可以发现，在任何一个时间点，细胞内环状DNA的荧光都比ssDNA强，这与之前的正义RNA成像结果一致。更重要的是，通过对细胞内的荧光分布进行选区分析后发现，环状DNA与内含体/溶酶体的荧光重叠比例非常低，大多数观察到的是红色的环状DNA荧光与绿色的内含体/溶酶体荧光独立存在。说明大部分环状DNA是处于细胞质当中，即环状DNA/GO的稳定性使得能够耐受内含体/溶酶体内的环境不被降解，进而从中逃逸到细胞质中，并与目标正义RNA结合后产生荧光信号。而ssDNA的红色荧光与内含体/溶酶体的绿色荧光则发生明显的重叠，是由于在内含体/溶酶体内发生降解产生了非特异性的荧光信号，也使得能够进入细胞质识别目标正义RNA的探针数量大大降低。通过亚细胞分布的研究，证实了环状DNA/GO不会被困在内含体/溶酶体内，使其更适用于细胞内的正义RNA成像乃至基因治疗。
E. 基因治疗：
为了考察环状DNA是否能够作为正义RNA靶向的基因治疗药物，我们研究了环状DNA对survivin和c-raf mRNA的反义效果。Survivin和c-raf激酶都在肿瘤的发生和发展过程中扮演了非常重要的角色。因此，我们研究了环状DNA/GO对肿瘤细胞的增殖产生的影响。在与靶向survivin和c-raf的环状DNA/GO共同孵育后，进行细胞存活率的测定。如图8a，环状DNA/GO能够比ssDNA/GO更有效地抑制HeLa细胞的增殖，并且具有浓度依赖性。然而，对于阴性细胞MCF-10A，环状DNA/GO几乎没有抑制增殖的效果（图9）。上述结果说明环状DNA/GO能够更有效地抑制肿瘤细胞生长。随后，通过蛋白免疫印迹法对环状DNA/GO的基因抑制效果进行验证，图8b和8c显示细胞与survivin和c-raf mRNA靶向的环状DNA/GO共孵育24h后，survivin和c-raf激酶的表达量都显著下调，效果优于ssDNA/GO。综上，环状DNA/GO对目标基因具有更高的抑制率，能够导致更高的细胞死亡率。
上述实验结果分析表明，环状DNA探针可以用于细胞内的高效的正义RNA成像和基因治疗。环状DNA/GO在许多方面具有优于ssDNA/GO的性质。首先，环状DNA/GO具有更高的目标正义RNA的识别效率，包括灵敏度、选择性和抗干扰能力。在用于细胞内传感检测时，环状DNA/GO能够有效地消除假阳性信号并降低背景信号。此外，环状DNA/GO进入细胞后能够从内含体/溶酶体内逃逸，对正义RNA翻译的抑制效率更高，因此对蛋白表达和细胞增殖都具有更好的抑制效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种环状DNA在正义RNA的检测、成像及基因治疗中的应用
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caaggagctg gaaggctggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caaggagctg caaggctggg 20
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctgatccca gccttccagc tccttgttcc cagccttcca gctccttgtt cccagccttc 60
cagctccttg ttagtcggta 80
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctgatccca gccttccagc tccttgttcc cagccttcca gctccttgtt cccagccttc 60
cagctccttg ttagtcggta 80
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aatgcatgtc acaggcggga 20
<210> 6
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cctgattccc gcctgtgaca tgcatttttc ccgcctgtga catgcatttt tcccgcctgt 60
gacatgcatt ttagtcggta 80

Claims (10)

1.一种环状DNA在正义RNA的检测或成像中的应用，其特征在于，所述环状DNA包含一个或多个与检测目标正义RNA序列互补的DNA探针片段、荧光标记物；所述环状DNA由ssDNA自身的3’和5’端连接环化形成。
2.根据权利要求1所述的环状DNA在正义RNA的检测或成像中的应用，其特征在于，包括如下步骤：（1）将所述环状DNA与荧光淬灭剂复合形成复合探针；（2）使所述复合探针与包含检测目标正义RNA的待检测物相互作用，形成环状DNA与正义RNA的杂合双链；（3）检测所述环状DNA与正义RNA的杂合双链的荧光强度。
3.根据权利要求2所述的环状DNA在正义RNA的检测或成像中的应用，其特征在于，所述荧光淬灭剂具有荧光淬灭能力，并且单链核酸的结合而不与双链核酸结合。
4.根据权利要求3所述的环状DNA在正义RNA的检测或成像中的应用，其特征在于，所述荧光淬灭剂为氧化石墨烯、碳纳米管、氮化碳纳米片、二氧化锰纳米片或氮化硼纳米片。
5.根据权利要求1或2所述的环状DNA在正义RNA的检测或成像中的应用，其特征在于，所述环状DNA包含两个以上的与检测目标正义RNA序列互补的DNA探针片段，还包括连接各DNA探针片段的连接片段。
6.根据权利要求1所述的环状DNA在正义RNA的检测或成像中的应用，其特征在于，所述正义RNA为mRNA、siRNA或microRNA。
7.根据权利要求2所述的环状DNA在正义RNA的检测或成像中的应用，其特征在于，步骤（2）中所述包含检测目标正义RNA的待检测物为细胞，所述复合探针与细胞共同孵育，在细胞内形成环状DNA与正义RNA的复合物。
8.一种环状DNA在正义RNA的基因治疗中的应用，其特征在于，包括如下步骤：使负载所述环状DNA的核酸载体进入与包含检测目标正义RNA的细胞中，形成环状DNA与正义RNA的杂合双链并从所述核酸载体上脱离，所述杂合双链中的正义RNA被酶分解，相关基因的表达过程受阻；所述环状DNA包含一个或多个与检测目标正义RNA序列互补的DNA探针片段；所述环状DNA由ssDNA自身的3’和5’端连接环化形成。
9.根据权利要求8所述的环状DNA在正义RNA的基因治疗中的应用，其特征在于，所述环状DNA包含两个以上的与检测目标正义RNA序列互补的DNA探针片段，还包括连接各DNA探针片段的连接片段。
10.根据权利要求8所述的环状DNA在正义RNA的基因治疗中的应用，其特征在于，所述正义RNA为mRNA、siRNA或microRNA；所述核酸载体为氧化石墨烯、碳纳米管、氮化碳纳米片、二氧化锰纳米片或氮化硼纳米片。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108956563A (zh) * 2018-06-21 2018-12-07 东南大学 一种以肿瘤细胞原位生物合成多功能金属纳米探针的方法
CN108949910A (zh) * 2018-06-08 2018-12-07 武汉博杰生物医学科技有限公司 一种高通量miRNAs表达谱的检测方法及生物传感器
CN109295168A (zh) * 2018-10-18 2019-02-01 山东大学 二氧化锰纳米片介导的比率荧光生物传感器用于细胞内microRNA的检测与成像
CN110082531A (zh) * 2019-04-11 2019-08-02 南方医科大学南方医院 一种肿瘤外泌体纳米荧光检测试剂盒及其应用
CN110904224A (zh) * 2019-07-19 2020-03-24 中国科学院长春应用化学研究所 一种可信号特异放大的二氧化锰/核酸探针复合纳米探针及其制备方法、应用
CN111234815A (zh) * 2020-01-22 2020-06-05 哈尔滨工业大学 一种生物质碳量子点荧光检测器的制备及使用方法
CN116148457A (zh) * 2022-07-23 2023-05-23 河南工业大学 一种碳纳米材料和核酸外切酶辅助的荧光适配体传感器的制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102998292A (zh) * 2012-12-13 2013-03-27 湖北中烟工业有限责任公司 利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测***的荧光检测方法
CN104651501A (zh) * 2015-01-30 2015-05-27 湖南大学 裂开型激活式核酸适配体诊疗探针及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102998292A (zh) * 2012-12-13 2013-03-27 湖北中烟工业有限责任公司 利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测***的荧光检测方法
CN104651501A (zh) * 2015-01-30 2015-05-27 湖南大学 裂开型激活式核酸适配体诊疗探针及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUN-HUA LU ET AL.: "Using graphene to protect DNA from cleavage during cellular delivery", 《CHEM. COMMUN.》 *
DANIEL A. DI GIUSTO，ET AL: "Construction, Stability, and Activity of Multivalent Circular Anticoagulant Aptamers", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
JINGYING LI,ET AL: "Circular DNA: a stable probe for highly efficient mRNA imaging and gene therapy in living cells", 《CHEM. COMMUN》 *
PETER T. ROWLEY ET AL.: "Circular Antisense Oligonucleotides Inhibit Growth of Chronic Myeloid Leukemia Cells", 《MOLECULAR MEDICINE》 *
YONG JIAN JIANG，ET AL: "Dual Energy Transfer-Based DNA/Graphene Oxide Nanocomplex Probe for Highly Robust and Accurate Monitoring of Apoptosis-Related microRNAs", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949910A (zh) * 2018-06-08 2018-12-07 武汉博杰生物医学科技有限公司 一种高通量miRNAs表达谱的检测方法及生物传感器
CN108956563A (zh) * 2018-06-21 2018-12-07 东南大学 一种以肿瘤细胞原位生物合成多功能金属纳米探针的方法
CN109295168A (zh) * 2018-10-18 2019-02-01 山东大学 二氧化锰纳米片介导的比率荧光生物传感器用于细胞内microRNA的检测与成像
CN109295168B (zh) * 2018-10-18 2022-02-15 山东大学 二氧化锰纳米片介导的比率荧光生物传感器用于细胞内microRNA的检测与成像
CN110082531A (zh) * 2019-04-11 2019-08-02 南方医科大学南方医院 一种肿瘤外泌体纳米荧光检测试剂盒及其应用
CN110904224A (zh) * 2019-07-19 2020-03-24 中国科学院长春应用化学研究所 一种可信号特异放大的二氧化锰/核酸探针复合纳米探针及其制备方法、应用
CN111234815A (zh) * 2020-01-22 2020-06-05 哈尔滨工业大学 一种生物质碳量子点荧光检测器的制备及使用方法
CN116148457A (zh) * 2022-07-23 2023-05-23 河南工业大学 一种碳纳米材料和核酸外切酶辅助的荧光适配体传感器的制备方法和应用

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