CN107987141A - 一种玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米核因子基因ZmNF‑YA1在植物抗逆性改造中的应用，是从玉米中克隆出ZmNF‑YA1基因，以正义或反义形式或RNAi结构形式将该基因重组到植物表达载体中，采用转基因技术将ZmNF‑YA1基因导入植株；通过检测转基因表达和对植株进行抗逆性测定，筛选出对逆境抗性提高或降低的转基因植株及后代，创造出在植物育种中具有应用价值的新种质。本发明利用ZmNF‑YA1基因通过基因表达调控来参与植物抗逆性调节，对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。

Description

一种玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用

技术领域

本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用；即通过构建转基因过表达结构和转基因途径改变玉米抗逆性的方案及用途。

背景技术

NF-Y(nuclear factor-y)是真核生物中普遍存在的一种转录因子复合物,由3个不同的亚基(NF-YA/CBF-B、NF-YB/CBF-A和NF-YC/CBF-C)组成,并通过作用于其他调控因子的启动子来调节目的基因的表达。完整的NF-Y转录复合物与靶基因启动子中的CCAAT基序结合,调控靶基因的转录。其中NF-YA是DNA序列特异性的亚基，结合到基因启动子区的核心五聚体核苷酸CCAAT基序(motif)上。NF-Y复合体能够作为一个转录激活因子或阻遏因子起作用，其与DNA的结合和转录调控活性也受到其它转录因子调节，后者通过与NF-Y亚基相互作用起作用。

在酵母和哺乳动物中，每种NF-Y亚基均由一个单基因编码，这些基因有多种剪接方式、有多种翻译后修饰。在哺乳动物中，NF-Y复合体的生理功能及其参与调节途径包括多种分子生化过程，如内质网胁迫、DNA损伤及修复、细胞周期调控等。但在植物中，每中NF-Y亚基均由一个基因家族编码，因此，NF-Y复合体具有由不同亚基组成的多样性。在拟南芥中，NF-YA亚基由10个基因编码，NF-YB亚基由13个基因编码，NF-YC亚基由13个基因编码。水稻至少有11个NF-YA基因，12个NF-YB基因，8个NF-YC基因。在玉米中，目前发现有14个NF-YA基因，18个NF-YB基因，18个NF-YC基因。对拟南芥的36个NF-Y亚基基因进行GUS表达分析，发现各亚家族成员具有复杂多样的表达模式，暗示这些家族成员组成的不同NF-Y复合体的功能的多样化，可调节多种基因的表达。

现有工作表明，NF-Y三个亚基家族成员均参与了植物生长发育的调控。在拟南芥中LEAFY COTYLEDON1诱导营养细胞发育成胚，两个NF-Y亚基基因(AtLEC1/AtNF-YB9)调节胚胎发生和种子成熟。AtNF-YB9和LEC1-LIKE(L1L/NF-YB6)通过诱导胚胎形成和细胞分化相关基因的表达来调控拟南芥胚胎发育。拟南芥中多个NF-YA亚基基因在胚中表达，如NF-YA1,YA2,A3,A4,A6,A7,A8,和A^]。过表达NF-YA1,A5,A6,或A9株系在种子萌发时对ABA超敏感，雄配子形成、胚胎形成、种子形态和萌发受到影响。这些超表达NF-Y材料可直接从营养器官形成体细胞胚。NF-YA3和-A8在球形胚到鱼雷胚时期时具有最高的表达量。nf-ya3nf-ya8双突变体胚胎致死，但nf-ya3和nf-ya8单突变体并未表现出明显表型变化，推测这两个基因在拟南芥早期胚胎形成过程中功能冗余。

除影响植物胚胎形成和种子成熟，NF-Y转录因子还调节植物的营养生长或/和生殖生长。过表达AtNF-YB2通过刺激细胞***和细胞伸长来促进初生根伸长。在豆类模式植物蒺藜状苜蓿中，MtHAP2-1在根瘤分生区表达，对根瘤细胞的分化起重要作用。过表达菜豆PvNF-YC1和通过RNAi干扰该基因表达的研究揭示了NF-Y在根瘤器官形成过程中起着重要作用。在青扦中，Yu等发现一个NF-YC蛋白通过与PwFKBP12相互作用调节花粉管的生长方向。

已有工作报道NF-Y调节植物耐旱性。在拟南芥和玉米中分别过表达AtNF-YB1及其玉米同源基因ZmNF-YB2，在干旱条件下转基因植株长势和成活率优于非转基因植株的。芯片检测结果表明，AtNF-YB1表达变化不影响脱水-响应元件结合蛋白(dehydration-responsive element binding proteins)或ABA-依赖性的抗旱通路，暗示AtNF-YB1可能通过一个不依赖ABA信号抗旱途径起作用。多项工作表明NF-Y与bZIP互作，而bZIP蛋白参与ABA信号通路。

AtNF-YA5基因受干旱、渗透胁迫和盐胁迫诱导上调表达。AtNF-YA5的转录调控受依赖ABA机制调控，miR169参与其转录后修饰。在干旱条件下，miR169下调表达，该过程依赖ABA。35S::miR169和nf-ya5突变体植株对干旱胁迫更敏感。AtNF-YA5调控保卫细胞气孔的大小，AtNF-YA5还通过激活其他细胞中胁迫响应基因的表达，如氧化胁迫响应相关基因，以提高植株的耐旱性。除AtNF-YA5外，过表达其他AtNF-YA基因如YA2、YA3、YA7、YA10也可提高植株对干旱的耐受性^[148]。11个小麦NF-Y基因在干旱条件下表达水平与正常条件下的表达水平相比具有显著差异，其中8个受干旱下调表达，3个上调表达。水稻一个NF-YA基因(OsHAP2E)是miR169的靶标，受盐胁迫诱导表达，且可能受依赖ABA的通路调控。OsNF-YA7受干旱胁迫诱导表达，但其表达不响应ABA。过表达OsNF-YA7水稻植株的耐旱性得以提高。分析OsNF-YA7启动子发现有3个DRE/CRT元件，该元件受不依赖ABA的干旱调节转录因子OsDREB2调控。因此推测OsNF-YA7主要通过不依赖ABA的途径调节植株的耐旱性。干旱胁迫降低OsNF-YA2的转录表达水平，osnf-ya2***缺失突变体的耐旱性提高，表明这个基因可能是水稻中干旱的负调控因子。在拟南芥中过表达小麦NF-YA基因TaNF-YA10-1可提高植株的耐旱性、促进根系及植株的生长，但TaNF-YA10过表达植株对盐胁迫更敏感，表明该基因在响应干旱胁迫及盐胁迫中的调节功能不同。

已有多项工作报道NF-Y转录因子调控植物对热和冷胁迫的响应。在拟南芥中过表达AtNF-YA2或AtNF-YC1可提高植株的冷胁迫抗性。转录组分析结果发现在AtNF-YA2过表达植株中一些非生物胁迫响应基因下调表达，但这些基因的下调会提高AtNF-YA2过表达植株的抗冷性的机制还不清楚。AtNF-YC1可能通过依赖C-REPEAT BINDING FACTORs(CBFs)的途径调节抗冻胁迫。

热胁迫对作物产量的影响日益严重，这是植物科学目前关注的研究课题。Sato等发现DREB2A可与DNA POLYMERASE II SUBUNIT B3-1(DPB3-1/NF-YC10)互作，尤其在热胁迫条件下。DPB3-1/NF-YC10可与NF-YA2、NF-YB3形成三聚体，调节与DREB2A介导的热胁迫相关基因的表达。过表达DPB3-1/NF-YC10提高热胁迫响应基因HEAT SHOCK TRANSCRIPTIONFACTOR A2(HSFA2)的表达水平，而在nf-yc10突变体中HSFA2的表达水平下调^[158]。过表达NF-YC10不影响拟南芥植株的生长，在水稻中过表达拟南芥AtNF-YC10可提高水稻植株耐热性而不影响植株的生长和发育。NF-YC10属于单源群，在陆地植物中高度保守，因此可作为创建热胁迫抗性作物的候选基因。

NF-Y转录因子还参与内质网(ER)应激响应。拟南芥中，NF-YC2、NF-YA4、和NF-YB3与bZIP28形成一个转录复合体，上调内质网应激相关基因的表达，阻止错误折叠及未折叠蛋白在内质网的积累，缓解蛋白质合成的下降。虽然现有生物信息学分析结果及芯片数据可知，NF-Y基因家族成员的表达受多种胁迫的调控，但对于植物具体抗逆的作用及其机制研究甚少。

在诸多报道中，植物NF-YA基因家族的表达模式具有时空特异性。拟南芥NF-YA家族成员在不同组织中的表达分析发现，某些成员之间有共同的器官表达模式，如AtNF-YA4和AtNF-YA7在叶和花中的表达模式类似，暗示它们的功能冗余。Zhang等对50个ZmNF-Y基因进行***的鉴定，并利用芯片数据分析了其表达模式，得出一些ZmNF-Y家族成员在营养器官及生殖器官中呈现特异性表达，且不同成员间对生物胁迫和非生物胁迫的响应也存在差异。通过分别接种病原菌串珠镰刀菌、丝黑穗病菌和草坪炭疽菌，分析ZmNF-Y对生物胁迫的响应，发现ZmNF-YA3、ZmNF-YA8和ZmNF-YA12上调表达，而ZmNF-YA1下调表达。栾明达等对7个受成熟miR169调控的ZmNF-YA进行亚细胞定位分析，发现这些ZmNF-YA均定位于细胞核中，但缺乏转录激活的能力。对ZmNF-YA和miR169响应逆境胁迫的表达模式进行分析，发现在玉米叶片中，ZmNF-YA和miR169的表达响应PEG、ABA和盐胁迫，但两者之间并未出现预期的负相关关系。在玉米根部，短期胁迫(0-48小时)引起miR169的表达下调，而长期胁迫(15天)上调miR169的表达，并且大部分ZmNF-YA在短期胁迫时与miR169表现出相反的表达变化。在响应逆境胁迫时，miR169表达水平与玉米根的伸长呈正相关的关系，而ZmNF-YA14与根的伸长呈现负相关关系，即miR169/ZmNF-YA14调控模块可能参与了玉米根响应逆境胁迫的调控过程。此外，过表达ZmNF-YA14上调过氧化物酶相关基因的表达量、积极清除细胞内活性氧的积累，增强玉米对盐胁迫的抗性。

玉米NF-Y家族基因数量大，检索玉米基因组序列，发现玉米NF-YA家族可能成员36个、NF-YB成员28个、NF-YC成员25个。但这些NF-Y家族基因的功能研究尚处起步阶段，检索只见到玉米ZmNF-YB2基因过表达提高了植株的耐旱性的研究报道和孟山都公司申请的专利。有关玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的具体应用鲜见报道。

发明内容

针对目前的研究现状，本发明提供了一种玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用。利用ZmNF-YA1基因通过基因表达调控来参与植物抗逆性调节，对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。

本发明所述玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用，是从玉米中鉴别和克隆出ZmNF-YA1序列，以全长或部分序列构建融合基因，后者的启动子连接在目标基因编码框(以正义形式)或RNAi结构之前，然后将融合基因***到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株进行性状鉴定，从中筛选出目标性状明显改变的转基因植株及其后代，创造出在植物育种中具有应用前景的新种质和新品种。具体方案如下：

一种玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用，其特征是：从玉米中克隆出ZmNF-YA1基因，以正义或反义形式或RNAi结构形式将该基因重组到植物表达载体中，形成融合基因；利用转基因技术将重组基因导入植株；通过检测转基因表达和对植株进行抗逆性测定，筛选出对逆境抗性提高或降低的转基因植株及后代，创造出在植物育种中具有应用价值的新种质；其中，所述ZmNF-YA1基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用中：所述ZmNF-YA1基因有cDNA形式或基因组基因形式，其编码序列以正义形式或反义形式或RNAi结构形式***植物表达载体，构建成融合基因；启动子为胁迫诱导型启动子或组成型启动子。

其中：所述植物抗逆性包括耐旱性、耐盐性或耐热性；所述植物是玉米、小麦或早熟禾。

ZmNF-YA1基因的表达分析

在玉米耐旱机理研究中，以耐旱自交系Q319和干旱敏感自交系65232为材料，采用芯片杂交技术比较苗期干旱处理(用18％PEG溶液浇灌沙培的3叶期玉米幼苗，分别在处理后12h、24h、48h和恢复浇水后24h)对不同基因型转录组影响，选出了一批在不同基因型中变化趋势不同的转录因子。然后，采用定量RT-PCR技术对这些基因的表达强度进行验证。从中选出ZmNF-YA1/GRMZM2G000686基因进行研究。在适宜生长条件下ZmNF-YA1在根中表达丰度大幅度高于叶片的。在根中，耐旱自交系Q319的表达量是干旱敏感自交系65232的2.5倍；在叶中，Q319和65232的表达量相近，约为65232根中的1/4。渗透胁迫处理24h时，在耐旱自交系Q319的根中，表达丰度下降，约为处理前的70％，而在65232的根中表达量显著上升，并高于Q319的；在叶中,Q319和65232的变化呈相反趋势，即Q319明显上升，65232下降到低于处理前根中的1/10水平。渗透胁迫处理48h，在根中ZmNF-YA1的表达丰度在Q319中同24h时相比略有增加，而65232则显著下降，略高于处理前的水平；在叶中，Q319的ZmNF-YA4的表达丰度同24h时相比大幅度增加，约为处理前的4倍，而65232只呈现小幅上升。复水24h，ZmNF-YA1在65232和Q319根中的转录本丰度几乎相等，略高于未处理前65232根的表达水平；在叶中，Q319的表达丰度下降到低于处理前水平，而65232的表达丰度略有上升，且丰度高于Q319的。即ZmNF-YA1的表达在Q319根中是渗透胁迫抑制的，在Q319叶中是渗透胁迫诱导；而在65232根中是渗透胁迫诱导的，在65232的叶中是渗透胁迫抑制的。即它们对渗透胁迫反应有明显差异，可能与其抗旱性关联。

转基因玉米的产生

将ZmNF-YA1基因编码框分别与脱水胁迫诱导的启动子Prd29A融合，重组到植物表达载体中，构建出载体pCambia1300-Prd29A::ZmNF-YA4-PCaMV35S::bar，采用农杆菌介导法或基因枪轰击法将该质粒的T-DNA区转入玉米骨干自交系，转化苗移栽成活后套袋自交，收获种子。通过除草剂筛选和分子生物学检测方法(PCR、Southern blotting、RT-PCR)检测转转化植株后代，获得了转基因植株。同时，依据ZmNF-YA1基因特异序列,构建出RNAi结构并重组到植物表达载体中，进行玉米遗传转化，获得转基因玉米植株。通过连续3代的自交和分子鉴定，产生了转基因纯合株系。在正常栽培条件下转基因玉米植株形态和生长发育正常，过表达株系ZmNF-YA1表达强度显著高于未转基因植株的，而转RNAi结构株系的ZmNF-YA1表达强度显著低于未转基因植株的。

若采用基因枪轰击法，取玉米(Zea mays L.)自交系植株在自交授粉后9-15天幼胚(1.0-1.5mm大小)，接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松脆、淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养基每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈伤组织作为遗传转化的受体材料。

采用常规方法制备基因枪弹丸。即称取1.0μm大小的金粉，经70％乙醇洗涤后静置15分钟，离心去除上清液；再用无菌水彻底清洗3次，然后50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)贮存备用。使用时涡旋5分钟打破金粉凝集，依次加入5μl质粒T-DNA(1μg/μl)、50μl12.5M CaCl₂、20μl 0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2～3分钟，静置1分钟。离心弃上清液后，加70％乙醇静置。然后离心弃上清液，再用无水乙醇重悬，取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的培养基，然后将愈伤组织高密度放入培养皿中每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6--9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。将材料转入加有选择剂(如0.1％除草剂草丁膦)的培养基上进行筛选。连续筛选三代，每代15天。继代时淘汰变粘死亡的组织块。经过筛选的抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光照16小时/天下恢复培养1代后，转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约10cm高时栽到大田中，自交结实。

转基因玉米植株的性状检测及利用

对通过连续套袋自交继代得到的转基因纯合植株，首先确定了在正常栽培条件下转基因植株生长发育正常，进而分析转基因植株和对照植株在胁迫条件下的抗性差异。

耐热性实验：将在28℃(照光,13h/d)/22℃(暗,11h/d)下生长的转基因纯合的玉米植株移入36℃(照光)下生长2h,再在39℃下连续热处理4天(照光13h/d，暗11h/d)，然后在28℃下恢复生长。在热处理后，未转基因对照(wt)几乎全部死亡。而经过热胁迫处理转RNAi结构株系的草地早熟禾与未转基因植株相比耐热性显著提高，非转基因植株几乎全部死亡，转基因抑制表达株系受害不明显，即耐热性显著优于对照的。

耐冷性实验：将在28℃(照光,13h/d)/22℃(暗,11h/d)下生长的转基因纯合的玉米植株在16℃(照光13h/d)、10℃下(照光13h/d)下依次生长1天,然后在4℃下连续冷处理3天(照光13h/d)，然后在28℃下恢复生长。在冷处理中，未转基因对照(wt)生长慢，处理后明显小于转基因株系的；在4℃处理1天，少数转基因过表达植株与未转基因对照叶片受损，叶尖往往萎蔫，而转RNAi结构玉米植株对冷害敏感，受损较重；4℃处理3天后恢复生长1天，转基因过表达株系受害程度明显低于对照的，其中部分株系只出现叶尖萎蔫，而转RNAi结构玉米植株受损重，小苗几乎全部死亡。

耐旱性实验：取充分干燥后分别转ZmNF-YA1基因和它的RNAi结构或反义形式的纯合株系的成熟种子播种在土盘中，置适宜条件下生长。植株4叶期时停止浇水，干旱处理一周，然后恢复浇水，观测植株生长状况和成活率，确定植株的抗旱性。结果表明，无论在苗期或拔节期降低ZmNF-YA1基因表达降低了植株抗旱性，而ZmNF-YA1基因过表达明显提高了植株的抗旱性。

将转ZmNF-YA1基因和其RNAi结构或反义形式的玉米及未转基因的对照自交系种子播在的花盆和大田，分别在苗期雌雄穗发育期(9～13叶期)、开花授粉期和灌浆期进行干旱胁迫处理，即通过控制浇水和避免雨淋，保持土壤相对含水量在55-60％左右，持续时间15天，并进行转基因植株性状观察和生理指标的检测，开放授粉，收获果穗并考种。发现转ZmNF-YA1过表达株系抗旱性显著高于未转基因对照和转RNAi结构的或反义形式的，不仅植株受害症状轻，胁迫解除后恢复生长快，而且单株籽粒产量等经济性状显著优于未转基因对照和转RNAi结构的；而转RNAi结构或反义形式的的植株抗旱性及籽粒产量明显差于未转基因对照的。转基因草地早熟禾植株抗性检测及植株筛选见实施例3和实施例4。

通过抗性检测试验，胁迫诱导型启动子启动转基因过表达植株的耐旱、耐热性和耐冷性比未转基因对照显著提高。在此基础上，综合多方面的测试结果，选出优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。

具体实施方式

实施例1：转ZmNF-YA1基因创造玉米耐旱耐盐自交系

1)受体***的建立以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、昌7-2、DH4866等。种子用70％乙醇浸泡8分钟，再用0.1％氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件(25-28℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。

2)玉米茎尖转化和植株再生构建携带玉米核因子基因ZmNF-YA1全序列的融合基因(正义形式)，转基因ZmNF-YA1用胁迫诱导型启动子RD29A/B或CaMV35RNA启动子或玉米Ubiquitin启动子启动。再将融合基因重组到T-DNA区带有植物除草剂抗性基因bar的根瘤农杆菌应Mini--Ti质粒中，获得遗传转化载体。

将带有双元载体(Mini--Ti质粒带有选择剂抗性基因和ZmNF-YA1基因)的根瘤农杆菌(如LBA4404等)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone,As)100μmol/l的1/2浓度的液体改良MS培养基悬浮，稀释5--20倍用于转化。转化时将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0.5×105Pa大气压下处理8-12分钟。再将浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

3)转基因植株的抗性检测和选择利用

转化植株长出3片叶后，喷洒0.12％除草剂草丁膦水溶液，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后4天后停止生长，9天后开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。取移栽成活植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。而后将转基因植株(T0)套袋自交结实。将来自不同T0植株的T1种子播在温室或具有防护设施的田间，喷洒喷洒0.18％除草剂草丁膦水溶液，观测植株抗性。T1代筛选出的抗除草剂植株继续套袋自交，对其子代继续进行分子生物学鉴定和抗性检测。通过数代自交纯合和抗性检测及选择，最终获得转基因玉米纯合系。在抗旱性鉴定及选择中，转基因株系分别种植与花盆、温室和大田，在3叶期、拔节期及开花前期、抽雄及散粉期、灌浆期进行干旱胁迫处理，测定生理参数的变化和籽粒产量，筛选出抗旱性强、籽粒产量比未转基因对照材料显著增加、且在适宜栽培条件下与受体自交系的籽粒产量略有提高的株系。该株系可用于配制玉米抗旱抗除草剂杂交种。

将纯合的转基因株系的种子播种在装满沙子的花盆中，浇灌0.5％或0.7％NaCl的水溶液，出苗后浇灌添加有0.5％或0.7％NaCl的1/3MS培养基无机盐溶液，统计出苗率、叶片坏死程度，5叶期植株成活率，从中选出耐盐性优良的转基因株系用于自交系选育和新品种培育。

实施例2：转ZmNF-YA1基因创造玉米耐热自交系

1.玉米转基因植株的获得

玉米优良自交系的种子萌发、质粒构建和遗传转化同实施例1。转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂(Hoechst Schering AgrEvo GmbH,含有除草剂glufosinateammonium)水溶液，浓度为9.6ml—10.8ml 以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后4天后停止生长，9天后开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。

2.转基因植株纯合和后代分析

T1代植株长到3叶期用10.8ml 水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交结籽外，采用PCR技术检测外源基因进行Southernblotting验证，并采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系测定植株在不同温度(28～39℃)和光强下净光合速率的变化，测定单株产量和生物量，并以未转基因植株为对照。选出优良的转基因株系后在大田栽培条件下进行玉米产量性状的观测和比较，选择高产高光效株系进入耐热性鉴定试验和玉米育种实验。

3.转基因株系耐热性鉴定试验

苗期耐热性试验：将在28℃(照光,13h/d)/22℃(暗,11h/d)下生长的转基因纯合的玉米植株移入36℃(照光)下生长2h,再在39℃下连续热处理4天(照光13h/d，暗11h/d)，然后在28℃下恢复生长。在热处理后，未转基因对照(wt)几乎全部死亡，而转基因株系中只有个别株系与未转基因对照差距不大，而绝大多数株系的耐热性显著优于对照的，其中部分转基因株系受害不明显，即为初步入选的转基因耐热株系。

授粉及灌浆初期耐热试验：将初步入选的转基因耐热株系的种子播种在温室，在适宜生长条件下生长到授粉期，然后将温室温度调整为36℃(照光,13h/d)/30℃(暗,11h/d)下生长7天，然后将温度调整为38℃(照光,13h/d)/30℃(暗,11h/d)下生长7天，20天后统计绿叶数和果穗数。收获后观测果穗发育状况、结籽率、百粒重等参数，筛选出耐热性优良的转基因株系。

实施例3：转ZmNF-YA1基因创造耐旱耐盐早熟禾

以草地早熟禾(Poa pratensis L)的不同品种，如奖品、新歌来得、橄榄球－A、午夜等的种子苗茎尖为试验材料，诱导其基部愈伤化膨大，切取膨大组织，放在继代及成丛培养基上诱导发生丛生芽，后者在继代及成丛培养基上持续增生，提供转基因的受体材料。采用农杆菌介导法将外源基因导入受体细胞，经选择获得转化细胞及植株。在农杆菌介导的遗传转化中，采用表面活性剂Silwet L-77处理和减压处理有效提高了转化频率，建立起一个高效的基因型制约小的早熟禾转基因技术体系。具体操作如下。

配制各种培养基

基本培养基：为改良MS培养基(MS培养基无机盐、盐酸硫胺素10.0mg L^-1，盐酸吡哆醇1.0mg L^-1，烟酸1.0mg L^-1，甘氨酸2.0mg L^-1，肌醇100.0mg L^-1，生物素0.05mg L^-1，酪蛋白水解物500mg L^-1),蔗糖30g L^-1,琼脂粉6.5g L^-1，pH 5.8--6.0。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。

诱导培养基：附加不同植物生长调节物质(激素)组合的基本培养基。对于多数早熟禾基因型而言，2,4-D浓度为0.01-1.0mg.L^-1，6-苄基嘌呤(6-BA)或激动素或玉米素浓度0－5mg.L^-1。采用固体培养基。最适的激素浓度因培养材料的基因型不同而在此范围内变动。

继代及成丛培养基：固体培养基，基本培养基中加入不同组合的植物生长调节物质，2,4-D浓度一般为0-0.2mg L^-1，6-BA或激动素或玉米素浓度为0－3mg L^-1，因早熟禾基因型而变动。

生根培养基：基本培养基加0.002-2.0mg L^-1萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)或吲哚乙酸(IAA)，采用固体培养基，用于无根小苗生根或壮苗培养。最适的激素浓度因培养材料的基因型不同而在此范围内变动。

种子灭菌和萌发及丛生芽块诱导

种子用70％酒精灭菌4-5分钟，0.2％升汞10－15分钟，无菌水冲洗3-5次。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子播种在湿润的无菌滤纸上，培养皿封口后放在黑暗或弱光条件下于20-28℃萌发。10-15天间切取茎尖放在诱导培养基(加入2,4-D0.2mg L^-1，6-BA 2mg L^-1)上培养，诱导基部膨大，膨大率为100％。在诱导培养基上培养20天后，切下茎尖基部膨大组织(直径1－3mm)转入继代及成丛培养基(取2,4-D 0.1mg L^-1，6-BA 2mg L^-1)上诱导丛生芽发生，15－20天后，多数膨大基部分化出丛生芽，成丛率为75％左右，每丛芽数多为15-20个。将丛生芽块分割后转入继代及成丛培养基上，丛生芽块细胞迅速增生，一般15天继代培养一次。若要获得较大小苗，去掉继代及成丛培养基中去掉2,4-D，保留2mg L-16-BA。在24±2℃、500－1000Lx光照(14h/d)下培养离体茎尖和茎尖基部膨大物及丛生芽块可再生完整植株。

草地早熟禾遗传转化

ZmNF-YA1基因克隆和融合基因构建及转化质粒重组同实例1.将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有植物选择标记基因)的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为170-180rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期(OD₆₀₀＝0.4－0.6)。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体基本培养基洗涤，再离心收集。再将菌体用1/2浓度的液体基本培养基悬浮，稀释5～20倍，添加乙酰丁香酮(acetosyringone,As)100μmol L^-1和表面活性剂Silwet L-77(浓度为0.1-0.3％)后用于转化。

将早熟禾丛生芽切至暴露出芽尖生长点，放入上述菌液中浸染并附以0.95-0.10个大气压(0.95×10⁵Pa--1×10⁴Pa)处理，浸染4-8分钟。然后用无菌滤纸吸去菌液，将丛生芽块转入继代及成丛培养基上共培养2－3天，再转到加有抗生素头孢霉素(Cefotaxime)250mgL^-1或羧苄青霉素(Carb)500mgL^-1的培养基上于黑暗中培养，抑制细菌生长。在抑菌培养基上丛生芽块逐渐恢复生长，10－15天后再转入含有选择剂的筛选培养基上筛选。连续筛选3代，每代15-20天。选择剂抗性基因bar或抗生素抗性基因hpt(潮酶素磷酸转移酶基因)。然后将抗性组织块转入继代及成丛培养基上分化小苗。后者在生根培养基上生根长大。生根小苗移入花盆，每5天浇灌一次1/2基本培养基的无机盐溶液，隔天浇水一次。移栽成活的小苗取叶片用于分子生物学检测。经PCR和Southern印迹法分析，转化率(产生转基因植株的芽块数/农杆菌感染的芽块数*100)为2～5％左右。诱导基部膨大对光较敏感。在低2,4-D浓度(<0.1mg.L-1)，光照强度>1000Lx时易分化生根，不易分化成丛，光照弱时(500Lx)膨大较易，不易生根。在较合适的2,4-D浓度时，光强约1000Lx时生长良好(膨大组织为淡黄绿色)，比在500Lx(膨大组织偏向白色)时更易成丛，并且每丛芽数也较多。在高浓度2,4-D时，光照强弱对其影响不是很大，膨大均较大，不易生根，但成丛率低。此阶段应在合适2,4-D浓度光照较强下培养以利于以后成丛。在丛生芽块继代培养的的前5－8天，若光照强度>1000Lx时，组织容易生根，不利于芽的分化，而一旦形成丛生芽后，光照强时易促进分化。所以在继代培养后的前5－8天，丛生芽块在弱光(约500Lx)下培养，当长出几个小芽后放于光照强度>1000Lx下培养，每丛芽数可达15-25个。

筛选剂浓度的确定

将除草剂水溶液过滤灭菌后，加入(培养基温度低于50℃时)去掉酪蛋白水解物的诱导培养基中。草丁膦浓度分别为0.1％、0.15％、0.2％、0.25％，即4个梯度浓度。将诱导出的丛生芽切成单芽后放入含有不同浓度绿黄隆的培养基上培养，每种选择培养基上接种小苗100株以上。每15天继代培养一次，共连续筛选三代。根据筛选后的存活率，确定不同品种小苗的除草剂适宜筛选剂量。如品种奖品的草丁膦选择浓度为0.2％、在此浓度下连续筛选3代，小苗成活率>10％。成活小苗转基因PCR检测一般为阳性。

小苗移栽和转基因植株的筛选

小苗在适宜的生根培养基上诱导生根。当根长2－3cm时，将小苗放在自然光下培养1－2天，然后去掉封口膜炼苗1－2天，于清晨或傍晚移栽入花盆(花盆下为壤土，上部为蛭石)中，5天浇一次1/2基本培养基无机盐溶液，3天浇水一次。移栽苗生长温度为15－25℃。小苗长到4-5个分蘖时，灌足水分，连续干旱1月以上，待植株叶片全部萎蔫一周后恢复浇水，挑选复水后恢复较快的植株进行克隆繁殖。部分克隆苗移栽到装有壤土的花盆中，待植株长到5个左右分蘖时过量浇灌0.3％～0.5％NaCl水溶液，连续浇灌3天，使土壤含盐量达到设定浓度(不高于0.5％NaCl)，然后维持1-3月，挑选存活植株并进行克隆繁殖。同时，通过喷洒浓度不变的除草剂草丁膦水溶液反复筛选转基因植株克隆苗。对耐盐耐旱性优良抗草丁膦的株系进行空间隔离或套袋，使其在隔离条件下结籽。

将收获的转基因植株种子分别播种于花盆中，在4-5叶期时喷洒0.25％浓度的除草剂草丁膦，存活植株植株再次进行耐盐、耐旱性检测，从中筛选出优良的耐盐耐旱转基因稳定株系，后者繁殖后即可用于环境绿化。

实施例4：转ZmNF-YA1RNAi结构或反义形式创造耐热草地早熟禾

将ZmNF-YA1反义形式或RNAi结构分别与脱水胁迫诱导的启动子Prd29A融合，然后重组到植物表达载体中转化草地早熟禾，获得了转基因植株。后者移栽成活后在自然条件下生长到5-6个分蘖时期，喷洒0.25％的草丁膦溶液，存活植株通过无性克隆进行繁殖，并进行转基因分子检测。获得的转基因早熟禾植株通过连续2代的分子鉴定和单株纯合，产生了转基因纯合株系。以转基因植株为材料，分别进行了热、冷胁迫处理，明确了转基因植株与对照植株在抗逆性上存在差异。热处理方法如下。

转基因早熟禾植株移栽2月后，产生大量分蘖形成。挑选整齐一致的转基因的早熟禾植株移栽到花盆和纸杯，待植株生长2月后进行刈割，新叶长至10cm左右时进行耐热性测定。处理时将材料放入人工气候箱，控制光周期12h/d，相对湿度70％。40℃热胁迫处理时，温度按30℃(2h)→32℃(2h)→34℃(2h)→36℃(2h)→38℃(2h)→40℃(3d)→23℃(3d)梯度变化。46℃热胁迫处理时，按30℃(2h)→32℃(2h)→34℃(2h)→36℃(2h)→38℃(2h)→40℃(3h)→46℃(5h)→23℃(7d)梯度变化。处理期间观察材料的生长状况，包括萎蔫程度、存活率、叶色变化，株系间差异等。同时，分别在处理前、40℃处理2h、12h、3d以及恢复3d和46℃处理5h以及恢复10d时测量相关生理参数，包括叶绿素含量、膜损伤、叶绿素荧光，生理学指标的测定按照《现代植物生理学实验指南》(汤章城主编)进行。Fv/Fm值由暗适应半小时后测得。

46℃短期热胁迫处理时，将不同早熟禾植株在46℃处理5h后放在23℃下恢复培养，观察不同处理时期植株的生长情况，测量相关生理指标，如叶绿素含量，膜损伤，叶绿素荧光变化等。经过46℃处理后，降低ZmNF-YA1基因表达株系要好于对照株系，在23℃生长10天后虽全部植株存活，但长势差异很大。非转基因植株长势差，热胁迫受损严重，恢复慢；降低ZmNF-YA1基因表达植株恢复快，分蘖较多，长势强，新生叶片长，显示出它们在热胁迫中受损轻，具有很好的耐热性。在热处理中，叶片Fv/Fm呈下降趋势，在恢复时期逐渐上升。不同早熟禾株系在热处理和恢复的最初2天丙二醛含量上升，未转基因对照明显高于降低ZmNF-YA1基因表达植株的，显示出后者细胞膜脂过氧化程度低。在热胁迫处理和恢复期间，未转基因植株离子外渗率显著高于其降低ZmNF-YA1基因表达株系的，在恢复2天时膜损伤呈现最大值，后者在热胁迫处理及恢复期具有明显高于对照的质膜稳定性，表明降低ZmNF-YA1基因表达明显提高了植株的耐热性。

在40℃长时间热胁迫处理中，处理1天，植株有轻度萎蔫，彼此间差异不大；处理3天，不同株系的植株萎蔫程度出现明显差异，未转基因植株萎蔫较重，降低ZmNF-YA1基因表达株系具有明显提高的耐热性，叶片挺直，失水较少。在恢复处理时，未转基因对照全部死亡，降低ZmNF-YA1基因表达株系抗热好，部分株系的存活率高于70％。40℃胁迫处理3天对植株造成的伤害远大于46℃胁迫处理5小时的，即较长时间热胁迫处理会对早熟禾细胞造成很难修复的损伤。

将耐热性与对照相比有明显提高的株系克隆繁殖，并0.2％喷洒除草剂草丁膦溶液(剂量为大田除草的3倍)，淘汰抗性偏弱的植株。其余植株隔离授粉，按株系混合收籽，用于新品种选育。

来自同一品种的不同转基因株系在耐热程度也表现出明显差异，这可能是由于外源基因在转基因植株中整合位点及表达强度不同有关。由胁迫处理后植株恢复速率、存活率和胁迫处理及恢复过程中生理指标的测定值分析判断，在46℃短期热胁迫处理对初选材料相对适宜，周期短，筛选效果较好。在40℃热胁迫处理3天及以上，可有效筛选出耐热性优异的转基因株系，后者可直接用于耐热早熟禾新品种选育。

序列表

<110> 山东大学

<120> 一种玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用

<141> 2018-1-29

<160> 2

<170> PatentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 1270

<212> cDNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 玉米

<222>（1）…（1270）

<223> ZmNF-YA1基因cDNA的核苷酸序列

<400> 1

agagatagga aagggcccaa cagctcaaca gaaaagccaa gcaaaggctg ctgcatactg 60

gaaggccctc tgtctgtgtg cgagcgcaag agaaagggag tcagagagag agagagaggg 120

aggagacctt gcagaggagc gaagcaagca aggtgggaaa gaggcagcag caagggcggc 180

gggctgccgg aaggggaaca tgctccctcc tcatctcaca gagaatggcg cggtgatgat 240

tcagtttggc catcagatgc ctgattacga ctccccggct acccagtcaa ccagtgagac 300

gagccatcaa gaagcgtctg gaatgagcga agggagcctc aacgagcata ataatgacca 360

ttcaggcaac cttgatgggt actcgaagag tgacgaaaac aagatgatgt cagcgttatc 420

cctgggcaat ccggaaacag cttacgcaca taatccgaag cctgaccgta ctcagtcctt 480

cgccatatca tacccatatg ccgatccata ctacggtggc gcggtggcag cagcttatgg 540

cccgcatgct atcatgcacc ctcagctggt tggcatggtt ccgtcctctc gagtgccact 600

gccgatcgag ccagccgctg aagagcccat ctatgtcaac gcgaagcagt accacgctat 660

tctccggagg agacagctcc gtgcaaagct agaggcggaa aacaagctcg tgaaaagccg 720

caagccgtac ctccacgagt ctcggcacct gcacgcgatg aagagagctc ggggaacagg 780

cgggcggttc ctgaacacga agcagcagcc ggagtccccc ggcagcggcg gctcctcgga 840

cgcgcaacgc gtgcccgcga ccgcgagcgg cggcctgttc acgaagcatg agcacagcct 900

gccgcccggc ggtcgccacc actatcacgc gagagggggc ggtgagtagg gagccccgac 960

actggcaact catccttggc ttatcagcga ttcgactcgg ctctccctcg tctgaaactg 1020

aactctctgc aactactgta actgtaacta aactgggtgt gcccggattg gcggtcgttc 1080

tgttctacta ctagtacctg ctacgcgtcg ttgggttggg tctggactag agagcgtgct 1140

ggttctttga tgaacttggc tggacttgag ggtgttgact agcgcgaagc tgagttccat 1200

gtaaaacttt tgcttcaaga ccgatgactg gcggcataat aagtagcagt aataaccatt 1260

cttctgtgtc 1270

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 玉米

<222>（1）…（249）

<223> ZmNF-YA1基因编码的氨基酸序列

<400> 2

MLPPHLTENG AVMIQFGHQM PDYDSPATQS TSETSHQEAS GMSEGSLNEH NNDHSGNLDG 60

YSKSDENKMM SALSLGNPET AYAHNPKPDR TQSFAISYPY ADPYYGGAVA AAYGPHAIMH 120

PQLVGMVPSS RVPLPIEPAA EEPIYVNAKQ YHAILRRRQL RAKLEAENKL VKSRKPYLHE 180

SRHLHAMKRA RGTGGRFLNT KQQPESPGSG GSSDAQRVPA TASGGLFTKH EHSLPPGGRH 240

HYHARGGGE 249

Claims (4)

1.一种玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用，其特征是：从玉米中克隆出ZmNF-YA1基因，以正义或反义形式或RNAi结构形式将该基因重组到植物表达载体中，形成融合基因；利用转基因技术将重组基因导入植株；通过检测转基因表达和对植株进行抗逆性测定，筛选出对逆境抗性提高或降低的转基因植株及后代，创造出在植物育种中具有应用价值的新种质；其中，所述ZmNF-YA1基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用，其特征是：所述ZmNF-YA1基因有cDNA形式或基因组基因形式，其编码序列以正义形式或反义形式或RNAi结构形式***植物表达载体，构建成融合基因；启动子为胁迫诱导型启动子或组成型启动子。

3.如权利要求1所述玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用，其特征是：所述植物抗逆性包括耐旱性、耐盐性或耐热性。

4.如权利要求1所述玉米核因子基因ZmNF-YA1在植物抗逆性改造中的应用，其特征是：所述植物是玉米、小麦或早熟禾。