CN107982568A - 可降解生物辅料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种可降解生物辅料及其制备方法和应用。本发明的可降解生物辅料，包括抗菌丝素膜、壳聚糖、成纤维细胞生长因子和水介质；所述抗菌丝素膜为抗菌肽改性的丝素蛋白膜；所述抗菌肽的序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的可降解生物辅料生物相容性，无毒、无刺激、不易引起机体的过敏反应，可在体外或体内被降解吸收，使用后无需从伤口移除，具有持久的杀菌、止血和快速促进伤口愈合的功效。

Description

可降解生物辅料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种可降解生物辅料及其制备方法和应用。

背景技术

人体体表开放性外伤一般涉及皮肤、皮下组织和肌肉等组织器官的损伤。如何促进人体体表开放性外伤伤口的愈合是日常生活中最常见的问题之一。对于这一问题的解决，在外科临床上有很多的方案。然而，随着社会的发展，人们对医疗健康的质量要求永无止境。对于经医疗机构如医院处理的病例，外伤愈合基本都有保障。但是，对于一些比较轻微程度的外伤，出于节省治疗费用等原因，人们一般选择自行愈合的态度。所以，寻求更简便、效果更好、成本更低的治疗措施是永远的发展方向。目前，生物活性物质如种子细胞和生长因子等的介入，是目前相关研究的前沿热点问题之一。

目前用于生物医用领域的天然高分子主要包括多糖类和蛋白质类等，其中壳聚糖、丝素蛋白等在创面修复领域应用最为广泛。近十年来，丝素蛋白在纯化方面取得显著成功，被广泛应用到了生物材料，它们不仅具有很好的强度，而且展现出极佳的生物相容性。因此，基于丝素蛋白和壳聚糖的生物材料应用于创面修复和人造皮肤的理论依据已经得到证实，具备很好的前景，将成为未来培养人造皮肤最好的支架之一。丝素蛋白，是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70％-80％，含有18种氨基酸，其中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)约占总组成的80％以上。丝素本身具有良好的机械性能和理化性质，如良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等，而且经过不同处理可以得到不同的形态，如纤维、溶液、粉、膜以及凝胶等。

目前医用敷料生物活性保持时间较短，所以开发一种如何持久抑菌和快速促进伤口愈合的可降解生物辅料具有很重要的临床意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可降解生物辅料及其制备方法和应用，本发明的可降解生物辅料无毒性、无刺激，生物相容性好，具有持久的杀菌、止血和快速促进伤口愈合的功效。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种可降解生物辅料，所述组合物包括抗菌丝素膜、壳聚糖、成纤维细胞生长因子和水介质；所述抗菌丝素膜为抗菌肽改性的丝素蛋白膜；所述抗菌肽的序列如SEQ ID NO:1所示。

所述抗菌肽的序列为末端酰胺化的序列。氨基酸序列为：

Leu-Leu-Gly-Asp-Phe-Phe-Arg-Lys-Ser-Lys-Glu-Lys-Ile-Gly-Lys-Glu-Phe-Lys-Arg-Ile-Val-Gln-Arg-Ile-Lys-Asp-Phe-Leu-Arg-AsnLeu-Val-Pro-Arg-Thr-Glu-Ser-NH₂。

所述抗菌肽为LL-37，LL-37是人体内发现的唯一一种Cathelicidin类抗菌肽，LL-37除了直接杀菌作用外，还能调节免疫和炎症介质的释放、引起免疫细胞分化及趋化、伤口愈合、细胞因子和组氨酸释放、中和内毒素和抗肿瘤等作用。LL-37的直接杀菌作用并不是它最重要的免疫方式，后几种作用才是LL-37参与免疫反应的主要途径。

经过抗菌肽改性丝素蛋白膜得到的抗菌丝素膜具有持久的杀菌和促进愈合的功能。

壳聚糖(CTS)是自然界中唯一含有氨基的阳离子多糖，能吸引带负电荷的血小板和红细胞，由于氨基的亲水性，能够增加纤维蛋白原的吸附数量，从而增加血小板黏附，壳聚糖具有促进组织再生、抑菌的特性，无毒，可生物降解，与生物组织的兼容性好。

在人体伤口愈合的过程中，成纤维细胞分泌胶原是伤口皮肤愈合的根本原因。所以，凡是促进皮肤成纤维细胞生长和分泌作用的因素均为备选的有利因素。成纤维细胞生长因子(FGF)不但可以有力的促进成纤维细胞的生长和分泌作用，同时，对肌肉等组织也有很强的促损伤修复功能。目前，FGF已经获我国Ⅰ类新药批文，这就为其在生物医药领域的广泛应用铺平了道路。

本发明的可降解生物辅料无毒性、无刺激，生物相容性好，具有持久的杀菌、止血和快速促进伤口愈合的功效。

进一步，所述抗菌丝素膜与壳聚糖的质量比为2～5:1～2。

进一步，所述成纤维细胞生长因子的浓度为0.005-0.02ug/ml。

本发明的目的之二在于提供一种所述的可降解生物辅料在制备用于促进伤口愈合的可降解生物辅料中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种所述的可降解生物辅料的制备方法，包括以下步骤：

1)取丝素蛋白溶液干燥处理后，得丝素蛋白膜，将丝素蛋白膜经乙醇溶液处理后，得不溶于水的丝素；

2)将步骤1)得到的丝素经过活化后与溶于PBS缓冲液中的所述抗菌肽反应1.5～3h，反应完后，用去离子水除去未反应的抗菌肽，得抗菌丝素膜；

3)将壳聚糖与成纤维细胞生长因子溶于水介质中，得混合溶液；

4)将步骤2)得到的抗菌丝素膜与步骤3)得到的混合溶液混合均匀，得可降解生物辅料。

进一步，步骤1)中乙醇溶液为积分数为50～100％的乙醇溶液。

进一步，步骤2)中所述丝素蛋白膜与步骤2)所述抗菌肽的质量比为10～25：0.1。

进一步，步骤2)中丝素经过EDC和NHS的混合溶液活化处理。

N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用于合成氨基酸保护剂、半合成卡那霉素及医药中间体，常和碳化二亚胺连用用作交联剂。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)是个可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶连物的制取。

进一步，步骤2)中PBS缓冲液为Na₂HPO₄和NaCl的混合溶液，PBS缓冲液的pH值为6.5。

本发明的目的还在于提供一种所述的制备方法制备得到的可降解生物辅料。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供的可降解生物辅料中的抗菌丝素膜经过抗菌肽改性丝素蛋白膜得到的抗菌丝素膜具有持久的杀菌和促进愈合的功能。

2)本发明提供的可降解生物辅料生物相容性，无毒、无刺激、不易引起机体的过敏反应，可在体外或体内被降解吸收，使用后无需从伤口移除，具有持久的杀菌、止血和快速促进伤口愈合的功效。

3)可降解生物辅料可直接作用于一般出血伤口、深部出血伤口及手术操作难以达到的部位出血伤口，可有效对伤口起到保护和缓冲外力作用，使用简单方便。

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1可降解生物辅料的制备方法

所述的可降解生物辅料的制备方法，包括以下步骤：

1)将丝素蛋白溶解在LiBr水溶液中，将所得溶液在蒸馏水中透析1～4d以除去LiBr，制得丝素蛋白水溶液，再将丝素溶液干燥成膜，膜厚度约为20～25μm，将干燥后的丝素膜依次在不同体积分数(100％，80％，60％)的乙醇溶液中浸泡各5min，使丝素膜形成不溶于水的丝素；

2)将所得丝素在PBS缓冲液中(0.1mol/L NaHPO₄，0.5mol/L NaC1，pH＝6.5)浸泡30～45min，再在EDC·HC1/NHS溶液(0.5mg/mL EDC，0.7mg/mL NHS的PBS缓冲液)中于室温浸泡15min，经过EDC/NHS活化后，丝素膜用PBS缓冲液冲洗后，与溶于PBS缓冲液中的抗菌肽于室温反应2h，反应完成后，将丝素膜在PBS缓冲液中浸泡5min，用PBS缓冲液冲洗2次，再用去离子水冲洗1次以除去多余的抗菌肽和其它物质，经干燥，即可得到抗菌丝素膜。

3)将壳聚糖与成纤维细胞生长因子溶于水介质中，得混合溶液；

4)将步骤2)得到的抗菌丝素膜与步骤3)得到的混合溶液混合均匀，得可降解生物辅料。

对比例1

作为对照，将经乙醇处理而未经EDC/NHS活化的丝素膜在多肽溶液(0.1mg/mL)中浸渍2h，清洗并干燥后制得抗菌肽浸渍丝素膜，后再进行步骤3、4的操作得辅料。

对比例2

作为对照，可降解生物辅料中未加壳聚糖，其余制备方法与实施例1相同，得辅料。

实施例2可降解生物辅料的效果对比

使用本发明实施例1制备的可降解生物辅料和对比例1，对比例2制备的辅料对创面的出血状况、炎症反应、愈合效果、组织形态特征和细胞增殖情况进行验证，具体方法如下：

选取体重为180-220g的健康大鼠，在其腹腔注射3％戊巴比妥钠，随机分为3组。在大鼠背部脊柱中部两侧各切割两个直径为1.8cm的圆形创面，并破坏少许肌肉组织，止血后备用。随即将实施例1制备的可降解生物辅料和对比例1，对比例2制备的辅料按照使用方法涂布于创面处，次日换药。对照组以生理盐水为阴性对照。于创面制成后1天、3天、5天、7天拍照记录创面愈合情况，HE染色等观察创面组织形态特征和检测细胞增殖情况。

结果如下：

以创面无明显积血积液，局部皮肤未见红肿为佳，表示外用敷料具有良好生物相容性，以有任何积血、积液及红肿为次之，生物相容性较差，按照该方法对本发明实施例1制备的可降解生物辅料和对照辅料使用效果进行评价，结果显示，实施例1制备的降解生物辅料处理创面后1天后就无炎症反应，对比例2制备的辅料次之，对比例1制备的辅料3天后才无炎症反应，本发明实施例1制备的降解生物辅料较对照辅料效果好。

HE染色结果以创面表皮结构完整，较厚，层次清晰，基底细胞成单层排列，结合紧密，表皮钉突较少，真皮层胶原纤维量多，横向排列有序，真皮内有大量的血管生成为效果佳，按照HE染色结果对本发明实施例1制备的降解生物辅料较对照辅料使用效果进行评价，实施例1制备的降解生物辅料愈合效果最好，对比例2制备的辅料次之，对比例1制备的辅料愈合效果最慢。

实施例3可降解生物辅料处理体内伤口效果

实验方法：选取体重为180-220g的健康大鼠，18只，雌雄兼用，造成股动脉出血伤口模型，缝合创口，随机分成3组，每组9只。分别用将实施例1制备的可降解生物辅料和对比例1，对比例2制备的辅料按照使用方法涂布于创面处按压3分钟。观察各组伤口的一般状况如：出血状况、体重变化、创口局部反应及愈合状况。

实验结果：

出血状况：实施例1制备的可降解生物辅料和对比例1较对比例2动物缝合创口的出血少。

愈合情况：与对比例1，对比例2相比实施例1制备的可降解生物辅料愈合要快，愈合情况良好，对比例2次之，对比例1愈合最慢。

其他情况：手术后3天内，动物一般状况良好，皮毛光滑，体重各组间比较无明显差异。

实验结论：实施例1制备的可降解生物辅料可明显减少伤口处继续出血，伤口愈合较快，对动物的一般状态也无不良影响，本发明的可降解生物辅料可有效对伤口起到保护和缓冲外力作用，制止继续出血，利于伤口愈合，并具有良好的安全性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种可降解生物辅料，其特征在于，所述组合物包括抗菌丝素膜、壳聚糖、成纤维细胞生长因子和水介质；所述抗菌丝素膜为抗菌肽改性的丝素蛋白膜；所述抗菌肽的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的可降解生物辅料，其特征在于，所述抗菌丝素膜与壳聚糖的质量比为2～5:1～2。

3.根据权利要求1所述的可降解生物辅料，其特征在于，所述成纤维细胞生长因子的浓度为0.005-0.02ug/ml。

4.权利要求1-3任一项所述的可降解生物辅料在制备用于促进伤口愈合的可降解生物辅料中的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的可降解生物辅料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取丝素蛋白溶液干燥处理后，得丝素蛋白膜，将丝素蛋白膜经乙醇溶液处理后，得不溶于水的丝素；

2)将步骤1)得到的丝素经过活化后与溶于PBS缓冲液中的所述抗菌肽反应1.5～3h，反应完后，用去离子水除去未反应的抗菌肽，得抗菌丝素膜；

3)将壳聚糖与成纤维细胞生长因子溶于水介质中，得混合溶液；

4)将步骤2)得到的抗菌丝素膜与步骤3)得到的混合溶液混合均匀，得可降解生物辅料。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中乙醇溶液为积分数为50～100％的乙醇溶液。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述丝素蛋白膜与步骤2)所述抗菌肽的质量比为10～25：0.1。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中丝素经过EDC和NHS的混合溶液活化处理。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中PBS缓冲液为Na₂HPO₄和NaCl的混合溶液，PBS缓冲液的pH值为6.5。

10.权利要求5所述的制备方法制备得到的可降解生物辅料。