CN107982536B - 一种药物作用靶点的组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种药物作用靶点的组合物和应用，组合物包括载体和以FKBP10及PCOLCE基因和/或其编码的蛋白作为药物作用靶点的药物。本发明系通过干预FKBP10及PCOLCE以抑制组织纤维化的形成，抑制皮肤成纤维细胞度增殖、分化、抗凋亡、分泌大量细胞外基质等生物学行为，从而达到治疗纤维化相关疾病的效果。

Description

一种药物作用靶点的组合物和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种药物作用靶点的组合物和应用。
背景技术
病理性瘢痕是存在于全世界范围内的一种皮肤纤维化疾病，在不同种族中其发病率有所差异，以往的报道提到白种人群中的病理性瘢痕发病率在5％～37％，常规手术后病人中的发病率为36～64%，而在深度烧伤病人中的发病率可高达91%。病理性瘢痕是由创伤炎性反应等引起，以成纤维细胞（fibroblast, Fb）增殖失控和胶原等大量细胞外基质（extra cellular matrix, ECM）过度产生和沉积为特征的人类真皮区特有的纤维代谢性疾病，在临床上表现为不超过伤口范围的高出皮肤表面的瘢痕组织，早期充血明显，可伴有疼痛或瘙痒，位于关节部位则可能会引起活动功能障碍。病理性瘢痕产生的不雅外观和不适症状让患者身心都承受着巨大的压力，预防瘢痕不仅是医学问题，也是一个社会问题，其防治对临床工作者来说更是一个挑战。目前病理性瘢痕的治疗和预防方法有多种，主要集中在上皮覆盖创面后，在瘢痕形成前和尚未成熟的阶段尽量去除各种造成瘢痕增生的因素，防止瘢痕对机体造成各种畸形和功能障碍，包括皮质类固醇激素、他克莫司、他汀类药物、他莫昔芬、激光、放射治疗、压力预防、硅胶制品预防等，但防治效果十分有限。因此，寻找新的治疗方法仍具有较高的学术与商业价值。
病理性瘢痕的发病机制目前尚在研究中，参与的致病因素主要包括ECM代谢异常、细胞因子（如TGF-β、血小板源性生长因子和***）、低氧和自由基、基因水平变化等，其中以ECM代谢异常为最主要致病因素。正常情况下，人体内ECM的合成和分解处于动态平衡，从而维持着相对稳定。在创伤愈合的过程中，如果ECM合成明显增多则会形成病理性瘢痕或瘢痕疙瘩。因此，抑制ECM中胶原的过度沉积可被认为是防治病理性瘢痕的重要目标。
FKBP10是一种免疫亲和素，属于免疫亲和素FKBP亚家族，其定位于成纤维细胞中粗面内质网上的蛋白，是一种参与I型胶原的转录后修饰的酶，它能辅助前体胶原折叠形成成熟I型胶原，且与I型胶原的分泌量成正相关。在人体内FKBP10的突变与成骨不全症（osteogenesis imperfect, OI）关系密切，患者因FKBP10缺乏，导致皮肤成纤维细胞及骨组织内I型胶原合成及分泌不足，从而表现出皮肤脆弱缺乏弹性、易骨折、关键屈曲困难等一系列结蹄组织相关症状，而FKBP10在人病理性瘢痕中的表达量显著高于正常皮肤。
PCOLCE是一种可与I型前体胶原结合，并对其进行剪切和修饰的酶。I型前体胶原在经PCOLCE剪切后，其C端蛋白酶活性显著增加，并完成N端与C端的剪切，从而完成胶原三聚反应，聚合形成成熟的胶原纤维。PCOLCE与细胞外基质的降解关系密切，并在增生性瘢痕中的表达显著高于正常皮肤。
现有的预防和治疗病理性瘢痕方法的局限性：手术疗法，复发率高且无法适用于大面积瘢痕的患者；加压治疗及硅胶制品治疗，对大面积烧伤患者效果较好，但仅用于早期预防，对已形成的瘢痕治疗效果有限；放射治疗，对患者全身和局部有一定辐射伤害；冷冻治疗，仅适用于面积较小的瘢痕，且治疗可引起皮肤色素加深、皮肤轻度萎缩等并发症；糖皮质激素治疗，可产生皮肤萎缩、色素脱失、毛细血管扩张、女性***、注射部位溃烂或钙化等并发症；激光疗法，临床有效率较低，易诱发新的瘢痕；抗肿瘤药物治疗，对正常细胞代谢影响较大，临床价值尚不确切；他克莫司、他汀类药物、他莫昔芬等药物，临床疗效有限，治疗靶点尚不确切。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种药物作用靶点的组合物和应用，该组合物系通过干预FKBP10及PCOLCE以抑制组织纤维化的形成，抑制皮肤成纤维细胞度增殖、分化、抗凋亡、分泌大量细胞外基质等生物学行为，从而达到治疗纤维化相关疾病的效果。
本发明的一种药物作用靶点的组合物，包括载体和以FKBP10及PCOLCE基因和/或其编码的蛋白作为药物作用靶点的药物。
所述以FKBP10及PCOLCE基因和/或其编码的蛋白作为药物作用靶点的药物为FKBP10及PCOLCE基因和/或其编码的蛋白的抑制剂。
所述以FKBP10及PCOLCE基因和/或其编码的蛋白作为药物作用靶点的药物包括但不限于干预FKBP10及PCOLCE基因和/或其编码蛋白的表达与功能的中和性抗体、小分子药物、小核苷酸、微小核糖核酸、反义分子或多肽。
所述干预方式包括同时干预FKBP10及PCOLCE基因和/或其编码的蛋白，或先干预FKBP10基因和/或其编码的蛋白之后再干预PCOLCE基因和/或其编码的蛋白。
所述以FKBP10及PCOLCE基因和/或其编码的蛋白作为药物作用靶点的药物的给药方式为局部注射或涂抹给药。
所述载体包括但不限于组氨酸多肽、赖氨酸多肽、分支状的组氨酸-赖氨酸共聚多肽、阳离子聚合物、硅纳米颗粒、脂质载体或病毒载体。其他药学上可接受的载体皆可。
本发明的一种药物作用靶点的组合物的应用，其特征在于：所述组合物用于制备治疗纤维化相关疾病的药物。
有益效果
（1）本发明系通过干预FKBP10及PCOLCE以抑制组织纤维化的形成，抑制皮肤成纤维细胞度增殖、分化、抗凋亡、分泌大量细胞外基质等生物学行为，从而达到治疗纤维化相关疾病的效果，例如病理性瘢痕；
（2）本发明涉及的药物相对于他克莫司、他汀类药物、他莫昔芬等药物而言，治疗靶点明确，规避了治疗机制不明、效率低、易引起副作用等缺点；
（3）相对于糖皮质激素类药物，本发明涉及的药物规避了激素可能带来的一系列副作用；
（4）相对于抗肿瘤类药物和放射疗法，本发明涉及的药物规避了损伤人体正常细胞的可能；
（5）相对于激光治疗，本发明规避了治疗深度浅的缺点以及诱发新瘢痕形成的可能性；
（6）相对于手术治疗和冷冻疗法，本发明涉及的药物可治疗大面积的病理性瘢痕，规避了治疗范围小这一缺陷；
（7）相对于加压疗法和硅胶疗法，本发明涉及的药物可在病理性瘢痕形成后再进行治疗，规避了仅能进行早期预防这一局限性；
（8）本发明涉及的药物相对于目前现行药物具有成本上的显著优势，合成成本较低。
附图说明
图1为人增生性瘢痕与正常皮肤中FKBP10及PCOLCE表达差异的比较；
图2为敲减FKBP10和/或PCOLCE表达可抑制人增生性瘢痕成纤维细胞中纤维化标记物的表达；
图3为针对人FKBP10和/或PCOLCE的小核苷酸干扰可抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的活性；
图4为针对小鼠FKBP10和/或PCOLCE的小核苷酸干扰可抑制小鼠增生性瘢痕的形成；其中， A：人增生性瘢痕和正常皮肤HE染色；B：小鼠模型在各干预方式下HE染色；C：小鼠模型在各干预方式下Masson染色；D：小鼠模型Masson染色中胶原含量统计图；
图5为针对小鼠FKBP10和/或PCOLCE的小核苷酸干扰可抑制小鼠皮肤纤维化标记物的表达。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
干预FKBP10及PCOLCE基因和/或其编码的蛋白的表达与功能的方式较多，如中和性抗体、小分子药物、小核苷酸，微小核糖核酸，多肽等，本实施例以小核苷酸药物为例，以人增生性瘢痕成纤维细胞（HHSF）为靶细胞，证实对FKBP10及PCOLCE的表达进行干预能抑制HHSF的活性，并减少纤维化相关标记物的表达。另外，通过建立小鼠增生性瘢痕模型，对局部皮肤进行小核苷酸注射，证实对FKBP10及PCOLCE进行干扰能抑制小鼠增生性瘢痕的形成。
实施例1
1.实验材料
1.1 小核苷酸序列
小核苷酸（Small interfering RNA , siRNA）：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是指内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。
它针对人FKBP10mRNA的序列为：
正义链：5’-GAAGGAAGAUUAUCAUCCCUCCAUU-3’；
反义链：5’-AAUGGAGGGAUGAUAAUCUUCCUUC-3’；
它针对小鼠FKBP10 mRNA的序列为：
正义链：5’-CCACACCUACAAUACCUAUTT-3’；
反义链：5’-AUAGGUAUUGUAGGUGUGGTT-3’；
它针对人PCOLCE mRNA的序列为：
正义链：5’-CCUUCCUCCAGAGAGCUUU-3’；
反义链：5’-AAAGCUCUCUGGAGGAAGG-3’；
它针对小鼠PCOLCE mRNA的序列为：
正义链：5’-CCUGGCAACCAAGUGACUU-3’；
反义链：5’-GGACCGUUGGUUCACUGAA-3’。
1.2小核苷酸/组氨酸-赖氨酸聚合物（HKP）纳米颗粒/甲基纤维素溶液配制方法
已用作siRNA转染载体的组氨酸-赖氨酸聚合物（HKP）具有赖氨酸骨架，该赖氨酸骨架包括含有多重组氨酸、赖氨酸或天冬氨酸的支链。将HKP溶于DEPC水制成DEPC水溶液，然后以质量比为4:1、体积比为1:1与siRNA（购自上海吉玛制药技术有限公司）水溶液混合，形成平均直径为150-200nm的纳米颗粒。HKP-siRNA水溶液为半透明状，没有明显的沉淀物聚集，可以在4℃下储存至少三个月。
1.3 小核苷酸针剂配制方法
体内实验小核苷酸针剂的配制：用DEPC-5%葡萄糖溶液溶解经过特殊修饰的siRNA（购自锐博生物科技有限公司）和HKP，分别制成siRNA水溶液和HKP水溶液，然后以质量比为4:1、体积比为1:1与siRNA水溶液混合，形成平均直径为150-200nm的纳米颗粒。HKP-siRNA水溶液为半透明状，没有明显的沉淀物聚集，可以在4℃下储存至少三个月。
2.实验方法
2.1人成纤维细胞的提取和培养
取临床标本（人增生性瘢痕、瘢痕疙瘩或正常皮肤）用Dispase II（2mg/ml, LifeTechnologies,ThermoFisher）浸泡，4℃过夜，并剥离、去除表皮。无菌环境下切碎组织，用4mg/ml胶原酶浸泡，摇床37℃消化2-4小时，滤网过滤细胞悬液，1500rpm离心5min，去除上清，并用培养基重悬细胞沉淀，接种至DMEM培养基。每2天换液一次。常规传代。
2.2小鼠增生性瘢痕模型的建立
将12周龄的C57/BL6小鼠麻醉，背部备皮，做一1cm纵行切口，将注满博来霉素溶液（2.8 mg/ml）的微型渗透胶囊(Alzet Model 1004; Durect Corp., Cupertino, CA,U.S.A.)埋置在皮下。缝合切口。56天后安乐死小鼠，并取材。
2.3小核苷酸针剂注射
小鼠瘢痕建立开始的当天，即开始小核苷酸针剂注射，注射方法为皮内注射。对照组、FKBP10siRNA单独给药组、PCOLCE siRNA单独给药组的小鼠，每3天注射一次，至模型建立第56天取材为止。FKBP10siRNA +PCOLCE siRNA同时给药组，配制注射针剂中FKBP10siRNA终浓度为200 μg/ml，PCOLCE siRNA终浓度为50μg/ml，两者分别与HKP制成HKP-siRNA溶液后混合注射，每3天注射一次，至模型建立第56天取材为止。FKBP10siRNA +(24 h) PCOLCE siRNA给药组，于第一天注射FKBP10siRNA (200 μg/ml)，24h后进行PCOLCEsiRNA (50μg/ml)注射，两种药分别按每3天注射一次的规律交替进行，至模型建立第56天取材为止。
2.4 体外培养细胞的siRNA转染
待细胞密度至约70%时，对细胞进行换液，并加入HKP-siRNA水溶液（方法参照1.2部分）。对照组、FKBP10siRNA单独给药组、PCOLCE siRNA单独给药组的细胞，培养液中siRNA终浓度为50nM，培养24 h后进行检测。FKBP10siRNA +PCOLCE siRNA同时干预组的细胞，培养液中FKBP10siRNA终浓度为50nM，PCOLCE siRNA终浓度为25nM，两者分别与HKP制成HKP-siRNA溶液后于培养液中混合，培养24 h后进行检测。FKBP10siRNA +(24 h) PCOLCE siRNA干预组的细胞，先配制FKBP10siRNA终浓度为50nM的培养液培养细胞，24 h后换成PCOLCEsiRNA终浓度为50nM的培养液培养细胞，继续培养24 h后进行检测。
2.5 实时定量PCR
用Trizol （Invitrogen, Grand Island, NY, USA）提取组织或细胞的总RNA，通过紫外分光光度法对RNA浓度和纯度进行测量（ND-1000, Thermo, Rockford, IL, USA）。用RT-PCR试剂盒（TaKaRa, Shiga, Japan）及ABI HT7900 PCR仪（Applied Biosystems,Foster City, CA, USA）对提取的总RNA进行逆转录反应，合成cDNA。以上述cDNA为模板进行实时定量PCR，20μl反应体系：
MIX（SYBR Premix Ex Taq）：10μl；
上游引物：0.4μl；
下游引物：0.4μl；
ROX II：0.4μl；
cDNA：2μl；
去离子水：6.8μl。
各反应管配齐，短暂离心混匀后置于PCR 反应仪中运行（Applied Biosystems）。反应条件：95℃10s热启动后进入40个循环的反应：95℃15s，60℃30m，72℃30m。反应结束后用分析软件以ΔΔCT Relative Quantitation法分析结果。每个样本做三个平行副孔，并以GADPH引物作为内参。
2.6 免疫组化/荧光染色
临床标本、动物组织取材后常规固定、脱水、石蜡包埋，并制备6μm切片。脱蜡后切片以1%羊血清进行封闭，并一抗4℃孵育过夜。以BSA清洗切片后，用带有辣根过氧化物酶或荧光标记的二抗进行孵育，37℃孵育2小时。显色，并进行拍照。
2.7 CCK-8细胞活性检测
对于体外培养的细胞，采用CCK-8法对细胞的增殖活性进行检测。CCK-8试剂盒购自Dojindo(Tokyo,Japan)实验步骤按照试剂盒说明书严格进行。
3.实验结果
3.1 人增生性瘢痕与正常皮肤中FKBP10及PCOLCE表达差异的比较。
对临床样本（人增生性瘢痕、正常皮肤）进行免疫组化检测。免疫组化结果显示，人增生性瘢痕中的FKBP10及PCOLCE的表达量均显著高于正常皮肤（p< 0.001）（图1）。
3.2 敲减FKBP10和/或PCOLCE表达可抑制人增生性瘢痕成纤维细胞中纤维化标记物的表达
分离并培养人增生性瘢痕成纤维细胞。采用RNAi技术对人增生性瘢痕成纤维细胞中的FKBP10和/或PCOLCE进行敲减，并采用实时定量PCR（q-PCR）对纤维化标记物COL1A、COL3A、FN、α-SMA和TGF-β1的mRNA水平进行检测。q-PCR结果显示，对FKBP10及/或PCOLCE进行敲减均可显著降低纤维化标记物COL1A、COL3A、FN、α-SMA和TGF-β1的表达（p< 0.001）。其中，同时干扰FKBP10、PCOLCE两个靶点以及先干扰FKBP10并于24h后干扰PCOLCE靶点，这两种方法处理的细胞中纤维化标记物的表达，低于单独干扰FKBP10或PCOLCE组细胞中纤维化标记物的表达，即干预FKBP10和PCOLCE双靶点的效果优于单独干预这两个靶点其中之一的效果（图2）。
3.3 针对人FKBP10和/或PCOLCE的小核苷酸干扰可抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的活性
分离并培养人增生性瘢痕成纤维细胞，用小核苷酸对其中FKBP10和/或PCOLCE的表达进行干扰，采用CCK-8法对人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖活性进行检测。结果显示，敲减FKBP10和/或PCOLCE后的细胞，其增殖活性在干预后的5d和7d均显著低于对照组。同时干扰FKBP10、PCOLCE两个靶点以及先干扰FKBP10并于24h后干扰PCOLCE靶点，这两种方法处理的细胞，其增殖活性低于单独干扰FKBP10或PCOLCE组细胞，即干预FKBP10和PCOLCE双靶点的效果优于单独干预这两个靶点其中之一的效果（图3）。
3.4 针对小鼠FKBP10和/或PCOLCE的小核苷酸干扰可抑制小鼠增生性瘢痕的形成
建立经典的小鼠增生性瘢痕模型，来模拟人增生性瘢痕的病理学改变（图4A-C）。对取材后的小鼠瘢痕进行了HE和Masson染色。结果显示，干预FKBP10和/或PCOLCE后，皮肤增生性瘢痕的特征（特征包括：表皮及真皮变厚、皮肤附属器官减少、胶原增多及排列紊乱，等）被显著抑制（p< 0.001）。其中，同时干扰FKBP10、PCOLCE两个靶点以及先干扰FKBP10并于24h后干扰PCOLCE靶点，这两种方法所得效果显著优于单独干预FKBP10或PCOLCE的效果（p< 0.05）。
3.5 针对小鼠FKBP10和/或PCOLCE的小核苷酸干扰可抑制小鼠皮肤纤维化标记物的表达
用小核苷酸对小鼠模型中FKBP10和/或PCOLCE的表达进行干扰，将所得皮肤样本进行q-PCR检测。结果显示，对FKBP10和/或PCOLCE进行干扰，可显著降低胶原I、胶原III、纤连蛋白、α-SMA和TGF-β1的表达（p< 0.001）。其中，同时干扰FKBP10、PCOLCE两个靶点以及先干扰FKBP10并于24h后干扰PCOLCE靶点，这两种方法处理的皮肤中纤维化标记物的表达，低于单独干扰FKBP10或PCOLCE组皮肤中纤维化标记物的表达，即干预FKBP10和PCOLCE双靶点的效果优于单独干预这两个靶点其中之一的效果（图5）。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院
<120> 一种药物作用靶点的组合物和应用
<130> 1
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaggaagau uaucaucccu ccauu 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aauggaggga ugauaaucuu ccuuc 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccacaccuac aauaccuaut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
auagguauug uagguguggt t 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccuuccucca gagagcuuu 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggaaggaggu cucucgaaa 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccuggcaacc aagugacuu 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggaccguugg uucacugaa 19

Claims (5)

1.一种用于制备治疗增生性病理性瘢痕的药物的组合物，其特征在于：包括载体和以FKBP10及PCOLCE基因作为药物作用靶点的药物；其中，药物为小核苷酸，具体如下：
针对人FKBP10mRNA的序列为：
正义链：5’-GAAGGAAGAUUAUCAUCCCUCCAUU-3’；
反义链：5’-AAUGGAGGGAUGAUAAUCUUCCUUC-3’；
针对人PCOLCE mRNA的序列为：
正义链：5’-CCUUCCUCCAGAGAGCUUU-3’；
反义链：5’-AAAGCUCUCUGGAGGAAGG-3’。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：干预方式包括同时干预FKBP10及PCOLCE基因，或先干预FKBP10基因之后再干预PCOLCE基因。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述以FKBP10及PCOLCE基因作为药物作用靶点的药物的给药方式为局部注射或涂抹给药。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述载体为组氨酸多肽、赖氨酸多肽、分支状的组氨酸-赖氨酸共聚多肽、阳离子聚合物、硅纳米颗粒、脂质载体或病毒载体。
5.一种如权利要求1所述的组合物的应用，其特征在于：所述组合物用于制备治疗增生性病理性瘢痕的药物。
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