CN107980825B - 来源于植物的抑藻剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了来源于植物的抑藻剂及其制备方法,所述的抑藻剂为秸秆的发酵液。本发明与现有技术相比,现在一般的抑藻剂都是化学杀藻剂,对环境有害,会造成二次污染。本发明中的抑藻剂原料来自植物的秸秆,生态安全性好,且易分解,不会造成二次污染。
Description
技术领域
本发明属于抑藻剂及其制备方法,特别属于来源于植物的抑藻剂 及其制备方法。
背景技术
随着社会、经济的快速发展,各种污染物的排放也日益加重, 这使得水体富营养化日趋严重,水华频繁爆发严重影响了生态平 衡,使我国的水质性缺水现象日渐加剧。铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是形成水华的蓝藻优势种群之一,具有极强的生态学竞 争优势,至今其迅速繁殖依然是全球性的问题,而且其产生的微囊 藻毒素危害极大,所以探索发现一种高效的,经济的,生态风险小 的抑藻方法是当前治理的突破点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题第1个是提供一种抑藻效果好的来 源于植物的抑藻剂。
本发明所要解决的技术问题第2个是上述抑藻剂的制备方法。
本发明解决技术问题的技术方案为:来源于植物的抑藻剂,所 述的抑藻剂为秸杆的发酵液。
所述的秸杆为水稻秸秆分蘖枝。
所述的水稻秸杆分蘖枝为水稻收获后剩余根部重新生长分蘖出 的青绿色分蘖枝。
所述的藻为铜绿微囊藻、蛋白核小球藻及斜生栅藻。
优选的藻为铜绿微囊藻。
所述的藻密度为1-9*106个/毫升。
所述的抑藻剂的制备方法为:将水稻秸杆分蘖枝于在自然条件 下风干,粉碎过40目筛网,将粉碎好的秸杆于121℃高压蒸汽灭菌 20min;冷却至室温,按照料水比(1:8-10)加入超纯水;再按照料 水总重量的1-1.2%添加纤维素酶和0.5-0.6%添加乳酸菌;充分混合 后,密闭,置于35℃厌氧发酵不小于10d,每天摇动3~4次,发酵 好后,先用定性滤纸抽滤得到发酵液,再用0.22μm微孔滤膜过滤除 去微生物,于4℃保存即可。
秸秆分蘖枝是水稻收获后重新分孽出的青绿色分蘖枝,其一般 不再抽穗结实,所以秸秆积累大量有机物质,在发酵过程会生成和 释放多种具有化感作用的次生代谢物,这些物质具有抑制藻类生长 的作用。
本发明与现有技术相比,现在一般的抑藻剂都是化学杀藻剂, 对环境有害,会造成二次污染。本发明中的抑藻剂原料来自植物的 秸杆,生态安全性好,且易分解,不会造成二次污染。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明。
本发明中所用藻种铜绿微囊藻(FACHB-942)购于中国科学院 武汉水生生物研究所,使用BG-11培养基培养。
培养条件:温度25℃,光照强度4000lx,光暗周期为12h: 12h,扩大培养一周,使铜绿微囊藻达到对数生长期,用BG-11培养 基稀释成初始藻密度为3.6×106个/mL,通常的试验用基数为105个 /mL的初始藻密度,由于该抑藻剂效果较好,所以初始密度相应的 设置成106个/mL。
斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)由安徽师范大学席贻龙教授 实验室惠赠;
蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)由安徽师范大学程双怀 副教授实验室惠赠;
斜生栅藻、蛋白核小球藻的培养条件:温度25℃,光照强度 4000lx,光暗周期为12h:12h,扩大培养一周,使其进入对数生长 期。
农作物废弃秸秆采自芜湖市周边农田;
纤维素酶(食品级)购自南宁庞博生物工程有限公司;
乳酸菌(食品级)购自佰生优生物科技有限公司。
实施例1:
将水稻秸杆分蘖枝(QSD)于在自然条件下风干,粉碎过40目 筛网,将粉碎好的秸杆于121℃高压蒸汽灭菌20min;冷却至室温, 按照料水比(1:8)加入超纯水;再按照料水总重量的1%添加纤维 素酶和0.5%添加乳酸菌;充分混合后,密闭,置于35℃厌氧发酵 10天,每天摇动3~4次,发酵好后,先用定性滤纸抽滤得到发酵 液,再用0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物,于4℃保存即可。
实施例2:
将水稻秸杆分蘖枝于在自然条件下风干,粉碎过40目筛网,将 粉碎好的秸杆于121℃高压蒸汽灭菌20min;冷却至室温,按照料水 比(1:9)加入超纯水;再按照料水总重量的1.1%添加纤维素酶和 0.55%添加乳酸菌;充分混合后,密闭,置于35℃厌氧发酵20d,每天摇动3~4次,发酵好后,先用定性滤纸抽滤得到发酵液,再用 0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物,于4℃保存即可。
实施例3:
将水稻秸杆分蘖枝于在自然条件下风干,粉碎过40目筛网,将 粉碎好的秸杆于121℃高压蒸汽灭菌20min;冷却至室温,按照料水 比(1:10)加入超纯水;再按照料水总重量的1.2%添加纤维素酶和 0.6%添加乳酸菌;充分混合后,密闭,置于35℃厌氧发酵30d,每 天摇动3~4次,发酵好后,先用定性滤纸抽滤得到发酵液,再用 0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物,于4℃保存即可。
实施例4
除水稻秸杆分蘖枝(QSD)由水稻秸秆(HSD)替换外,其余与实施 例1相同。
实施例5
除水稻秸杆分蘖枝由大麦秸杆(DM)替换外,其余与实施例1 相同。
实施例6
除水稻秸杆分蘖枝由玉米秸杆(YM)替换外,其余与实施例1 相同。
实施例7
除水稻秸杆分蘖枝由甘蔗皮(GZP)替换外,其余与实施例1 相同。
实施例8
除水稻秸杆分蘖枝由红薯茎(HS)替换外,其余与实施例1相 同。
实施例9
将培养到对数期的铜绿微囊藻用BG-11培养基稀释到初始密度 为6.0×106cells/ml,取100ml藻液加入到灭完菌的250ml锥形瓶中, 按1.25%(v/v)添加实施例1、4、5、6、7、8所制的发酵液,同时 设置空白对照组,每组设置3个重复,放置于光照强度4000Lx,光 暗比12h:12h,温度(25±1)℃条件下培养。用血球计数板对铜绿微 囊藻藻细胞进行计数,每24h计数一次,统计至168h。
藻密度:通过血球计数板计数法,计算出藻密度;比较不同处 理组藻细胞密度的差异及变化趋势来反映发酵液对铜绿微囊藻生长 的影响。
抑制率:通过抑制率公式计算出百分抑制率,公式为:
IR(%)=(1-N/N0)×100%
其中:IR表示抑制率;N表示不同处理组的藻密度 (cells/ml);N0表示同期对照组的藻密度(cells/ml)。
采用Excel 2003进行数据初处理,通过SPSS 21.0软件对各组间 差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA),并用最小显著性差异 (LSD)方法进行多重比较检验,P<0.05表示有显著性差异,P<0.01 表示有极显著差异,使用Probit过程计算时间序列上的ET50。
实施例1、4、5、6、7、8所制的发酵液对铜绿微囊藻藻细胞密 度的影响由表1所示:
表1:
注:*表示与同期对照组具有差异性,**表示与同期对照组具有极显著差异性;
由表1所示:当初始添加量为1.25%(v/v)时,六种发酵液对铜 绿微囊藻均有不同程度的抑制作用,试验前120h各实验组与同期对 照组相比均具有极显著差异性(p<0.01)。其中HS、YM、HSD发 酵液在前96h表现出一定的抑制效果,但在后续的实验中发现,这 三种发酵液虽在一定程度上还起着控制铜绿微囊藻生长的作用,不 过出现抑藻能力下降的情况,这是由于发酵液中有效控藻成分消耗 和藻适应了胁迫环境后造成的。
实施例1、4、5、6、7、8所制的发酵液对铜绿微囊藻的抑制率 由表2所示
表2
注:表中数据为平均值±SD(n=3)
同一列,相同小写字母表示在0.05水平上无显著性差异;不同 小写字母表示在0.05水平上有显著性差异。
同一行,相同大写字母表示在0.05水平上无显著性差异;不同 大写字母表示在0.05水平上有显著性差异。
表3 1.25%不同发酵液Probit回归和ET50估算
注:X使用底数为10的对数转换。
由表3可以看出QSD对铜绿微囊藻具有持续高效的抑制作用, 在实验周期内最高可达到97.96%,且在时间序列上具有显著差异性 (p<0.05);同时DM和GZP也都表现出了不错的抑制能力,抑制 率都在80%以上;同时在发酵液之间也表现出了显著差异性 (p<0.05)。由表3可知抑制能力强弱的顺序为QSD>DM>HSD> YM>GZP>HS,但注意到HSD和YM的持续抑制能力弱,后期衰 减程度大。综合以上结果最终得出不同发酵液对铜绿微囊藻抑制效 应的强弱顺序QSD>DM>GZP>YM>HSD>HS。
实施例10:
不同发酵时间QSD对铜绿微囊藻生长影响
将培养到对数期的铜绿微囊藻用BG-11培养基稀释到初始密度 为6.0×106cells/ml,取100ml藻液加入到灭完菌的250ml锥形瓶中, 按1.25%(v/v)添加实施例1、2、3所制的发酵液,同时设置空白 对照组,每组设置3个重复,放置于光照强度4000Lx,光暗比 12h:12h,温度(25±1)℃条件下培养。用血球计数板对铜绿微囊藻 藻细胞进行计数,每24h计数一次,统计至96h。
实施例1、2、3所制的发酵液对铜绿微囊藻藻细胞密度的影响 由表4所示:
表4:
注:**表示与同期对照组具有极显著差异性;
如表4所示:在发酵液添加量同为1.25%(v/v)的条件下,发 酵时间为10d(实施例1)、20d(实施例2)和30d(实施例3)的 QSD均表现出抑制铜绿微囊藻生长的作用,各处理组下QSD作用后 藻密度均低于同期对照组,且随着作用时间的增加差异愈发显著。 处理组不同程度的出现白色絮状物作用24h时,各处理组与对照组 就表现出极显著差异性(P﹤0.01)。96h时,30d组基本无结构完 整的藻细胞。由此可得出,在相同条件下实验组QSD发酵时间与藻 密度呈负相关,即发酵时间越长对铜绿微囊藻生长抑制效果越明 显。
实施例1、2、3所制的发酵液对铜绿微囊藻的抑制率由表5所 示
表5:
注:表中数据为平均值±SD(n=3)
同一列,相同小写字母表示在0.05水平上无显著性差异;不同 小写字母表示在0.05水平上有显著性差异。
同一行,相同大写字母表示在0.05水平上无显著性差异;不同 大写字母表示在0.05水平上有显著性差异。
由表5可以得出在同一添加量同一时间下,不同发酵液在实验 时间序列上都表现出显著差异性(p<0.05),表明在实验周期内随 着作用时间的延长,抑制作用持续增强;但在同一添加量和同一时 间下,20d和30d与10d的发酵液都表现出来显著差异性(p<0.05);20d和30d虽未表现出差异性,但从实际效果来看30d的发酵 液具有更强的控藻能力。
实施例11:
QSD发酵液对铜绿微囊藻、蛋白核小球藻及斜生栅藻的抑制试 验:
采用BG-11培养基培养铜绿微囊藻,蛋白核小球藻和斜生栅藻采 用HB4培养基培养,将培养到对数期的铜绿微囊藻用BG-11培养基 稀释到初始密度为3.5×106cells/ml,蛋白核小球藻和斜生栅藻的初 始藻密度分别为1.4×106cells/ml和1.9×106cells/ml;分别取三种藻 各100ml藻液加入到灭完菌的250ml锥形瓶中,然后加入相应量的 实施例3所制的QSD发酵液,根据预实验结果设置5个浓度梯度 0.25%、0.5%、0.75%、1%、和1.25%(v/v),同时设置空白对照 组,每组设置3个重复,放置于光照强度4000Lx,光暗比 12h:12h,温度(25±1)℃条件下培养。
用血球计数板对铜绿微囊藻藻细胞进行计数,每24h计数一 次,统计至96h。
不同浓度实施例3所制的发酵液对铜绿微囊藻藻细胞密度的影 响由表6所示:
表6:
注:*表示与同期对照组具有差异性,**表示与同期对照组具有极显著差异性;
如表6所示:各实验组的藻细胞密度在QSD发酵液作用下均有 不同程度的变化。其中最低浓度处理组在整个试验周期内整体上表 现出增长的趋势,且在第72h与同期对照组具有显著性差异 (P<0.05),96h与同期对照组具有极显著性差异(P<0.01);
也可以看出高浓度处理组(0.50%、0.75%、1.00%和1.25%)的 藻密度随着处理浓度增加而减少,且都从24h与同期对照组具有极 显著性差异(P<0.01);在96h时相对最大浓度处理(1.00%和 1.25%)组基本无完整藻细胞存在,可以直观体现出出相同抑制效果。
因此,不同QSD发酵液添加量对铜绿微囊藻有不同作用效果; 低浓度处理组(0.25%)表现出促进作用;高浓度处理组表现出抑制 作用,且浓度越高抑制效果越明显。
不同浓度实施例3所制的发酵液对铜绿微囊藻的抑制率由表7 所示:
表7:
如表7所示:除最低浓度处理组(0.25%)外,QSD发酵液对铜 绿微囊藻的生长抑制体现出时间效应和剂量效应;即在同一浓度 下,抑制率随着处理时间的延长而增大,在同一时间下,抑制率随 着浓度的增大而增大。从第72h开始,高浓度处理组(0.75%、 1.00%和1.25%)抑制率均超过了80%;在96h最大浓度处理组抑制 率达到95.66%。由此可得出,在QSD发酵液高浓度处理条件下, 铜绿微囊藻的抑制率与处理浓度呈正相关性,即处理浓度越大,对 铜绿微囊藻抑制效果越好。
不同浓度实施例3所制的发酵液对蛋白核小球藻藻细胞密度的 影响由表8所示:
注:*表示与同期对照组具有差异性,**表示与同期对照组具有极显著差异性;
如表8所示:低浓度处理组(0.25%、0.50%和0.75%)在整个 试验周期内对蛋白核小球藻都起到了一定的促进生长作用,而高浓 度处理组(1.00%和1.25%)表现出抑制蛋白核小球藻生长的作用, 且在48h时与同期对照组具有极显著性差异(P<0.01)。这表明QSD发酵液对蛋白核小球藻生长的影响具有选择性,表现出“低促高 抑”的现象。在血球计数板计数过程中发现高浓度处理组对蛋白核小 球藻的抑制作用表现在“抑制生长”而不是“杀死”藻细胞,这一点与 QSD发酵液对铜绿微囊藻的抑制效果相同。
不同浓度实施例3所制的发酵液对蛋白核小球藻的抑制率由表 9所示:
表9:
从表9中可以看出低浓度处理组的抑制效果不是很理想,甚至 出现负值(表示对蛋白核小球藻生长起到促进作用);高浓度处理 组(1.00%和1.25%)起到了抑制作用,最好抑制效果出现在96h (1.25%),抑制率为83.68%和QSD发酵液对铜绿微囊藻在72h(0.75%和1.00%)相仿。
不同浓度实施例3所制的发酵液对斜生栅藻藻细胞密度的影 响由表10所示:
注:**表示与同期对照组具有极显著差异性 不同浓度实施例3所制的发酵液对斜生栅藻的抑制率由表11所示:
表11
如表10、11所示:QSD与同期对照组相比对斜生栅藻具有一定 抑制能力,但在整个实验周期内斜生栅藻的生物量却有所增加,这 说明QSD对斜生栅藻只是起到了控制其快速繁殖的作用,并不是杀 死藻细胞。
实施例12:
不同发酵方式QSD克藻实验
将QSD在自然条件下风干,粉碎过40目筛网备用。分别称取4 份30g粉末放入500ml三角烧瓶中封口,121℃高压蒸汽灭菌 20min;灭菌完成完全冷却后,于超净工作台中,按照料水比 (1:10)加入超纯水;再按照总量(330g)的1%添加纤维素酶、 0.5%添加乳酸菌、1%添加纤维素酶和0.5%添加乳酸菌以及空白添 加剂组;封口充分混合后置于35℃下厌氧发酵10d,每天摇动3~4 次,最终得到空白发酵剂发酵组(W)、纤维素酶发酵组(X)、 乳酸菌发酵组(R)和混合发酵组(X+R)4种不同发酵液,先用定 性滤纸抽滤得到发酵液,再将其用0.22μm微孔滤膜过滤除去微生 物,4℃保存备用。
将培养到对数期的铜绿微囊藻用BG-11培养基稀释到初始密度 为5.0×106cells/ml,取100ml藻液加入到灭完菌的250ml锥形瓶中, 然后加入不同发酵方式得到的QSD发酵液,添加量为1.25% (v/v),同时设置空白对照组,每组设置3个重复,放置于光照强 度4000Lx,光暗比12h:12h,温度(25±1)℃条件下培养。用血球 计数板对铜绿微囊藻藻细胞进行计数,每24h计数一次,统计至 96h。
QSD不同发酵方式发酵液对铜绿微囊藻藻密度的影响由表12所 示:
由表12可以看出,各实验组(W、X、R和X+R)的藻细胞密 度在试验期间均小于同期对照组,且与同期对照组的差距表现出一 定的“时间-抑制”效应,即作用时间越长抑制效果越显著。在作用 24h开始,各处理组与对照组就表现出了极显著差异性(p< 0.01),且(X+R)表现最佳抑制效果。
QSD不同发酵方式发酵液对铜绿微囊藻的抑制率由表13所 示:
由表13可以看出W、X、R和X+R在同期实验条件下抑制效果 具有差异性(p<0.05)且发酵方式越复杂所表现出的抑制效果越显 著;在同一发酵液处理下,抑制率随着时间的延长而增大,且具有 差异性(p<0.05)。在96h,除无添加发酵剂W组外,其余各组抑 制率均超过80%,添加纤维素酶和乳酸菌组合组(X+R)的抑制率 更是达到了95.68%,这表明添加发酵剂发酵QSD有助于QSD产出 具有显著抑藻效果的物质,进一步提高抑制率。
Claims (1)
1.来源于植物的抑藻剂的制备方法,其特征在于:将水稻秸杆分蘖枝于在自然条件下风干,粉碎过40目筛网,将粉碎好的秸杆于121℃高压蒸汽灭菌20min;冷却至室温,按照料水比(1:8-10)加入超纯水;再按照料水总重量的1-1.2%添加纤维素酶和0.5-0.6%添加乳酸菌;充分混合后,密闭,置于35℃厌氧发酵不小于10d,每天摇动3~4次,发酵好后,先用定性滤纸抽滤得到发酵液,再用0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物,于4℃保存即可。
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