CN107980825B

CN107980825B - 来源于植物的抑藻剂及其制备方法

Info

Publication number: CN107980825B
Application number: CN201711222772.XA
Authority: CN
Inventors: 张庭廷; 陈波; 施媚; 闫浩
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Hefei Qianjincao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2037-11-28
Also published as: CN107980825A

Abstract

本发明公开了来源于植物的抑藻剂及其制备方法，所述的抑藻剂为秸秆的发酵液。本发明与现有技术相比，现在一般的抑藻剂都是化学杀藻剂，对环境有害，会造成二次污染。本发明中的抑藻剂原料来自植物的秸秆，生态安全性好，且易分解，不会造成二次污染。

Description

来源于植物的抑藻剂及其制备方法

技术领域

本发明属于抑藻剂及其制备方法，特别属于来源于植物的抑藻剂及其制备方法。

背景技术

随着社会、经济的快速发展，各种污染物的排放也日益加重，这使得水体富营养化日趋严重，水华频繁爆发严重影响了生态平衡，使我国的水质性缺水现象日渐加剧。铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是形成水华的蓝藻优势种群之一，具有极强的生态学竞争优势，至今其迅速繁殖依然是全球性的问题，而且其产生的微囊藻毒素危害极大，所以探索发现一种高效的，经济的，生态风险小的抑藻方法是当前治理的突破点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题第1个是提供一种抑藻效果好的来源于植物的抑藻剂。

本发明所要解决的技术问题第2个是上述抑藻剂的制备方法。

本发明解决技术问题的技术方案为：来源于植物的抑藻剂，所述的抑藻剂为秸杆的发酵液。

所述的秸杆为水稻秸秆分蘖枝。

所述的水稻秸杆分蘖枝为水稻收获后剩余根部重新生长分蘖出的青绿色分蘖枝。

所述的藻为铜绿微囊藻、蛋白核小球藻及斜生栅藻。

优选的藻为铜绿微囊藻。

所述的藻密度为1-9*10⁶个/毫升。

所述的抑藻剂的制备方法为：将水稻秸杆分蘖枝于在自然条件下风干，粉碎过40目筛网，将粉碎好的秸杆于121℃高压蒸汽灭菌 20min；冷却至室温，按照料水比(1:8-10)加入超纯水；再按照料水总重量的1-1.2％添加纤维素酶和0.5-0.6％添加乳酸菌；充分混合后，密闭，置于35℃厌氧发酵不小于10d，每天摇动3～4次，发酵好后，先用定性滤纸抽滤得到发酵液，再用0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物，于4℃保存即可。

秸秆分蘖枝是水稻收获后重新分孽出的青绿色分蘖枝，其一般不再抽穗结实，所以秸秆积累大量有机物质，在发酵过程会生成和释放多种具有化感作用的次生代谢物，这些物质具有抑制藻类生长的作用。

本发明与现有技术相比，现在一般的抑藻剂都是化学杀藻剂，对环境有害，会造成二次污染。本发明中的抑藻剂原料来自植物的秸杆，生态安全性好，且易分解，不会造成二次污染。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

本发明中所用藻种铜绿微囊藻(FACHB-942)购于中国科学院武汉水生生物研究所，使用BG-11培养基培养。

培养条件：温度25℃，光照强度4000lx，光暗周期为12h： 12h，扩大培养一周，使铜绿微囊藻达到对数生长期，用BG-11培养基稀释成初始藻密度为3.6×10⁶个/mL，通常的试验用基数为10⁵个 /mL的初始藻密度，由于该抑藻剂效果较好，所以初始密度相应的设置成10⁶个/mL。

斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)由安徽师范大学席贻龙教授实验室惠赠；

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)由安徽师范大学程双怀副教授实验室惠赠；

斜生栅藻、蛋白核小球藻的培养条件：温度25℃，光照强度 4000lx，光暗周期为12h：12h，扩大培养一周，使其进入对数生长期。

农作物废弃秸秆采自芜湖市周边农田；

纤维素酶(食品级)购自南宁庞博生物工程有限公司；

乳酸菌(食品级)购自佰生优生物科技有限公司。

实施例1：

将水稻秸杆分蘖枝(QSD)于在自然条件下风干，粉碎过40目筛网，将粉碎好的秸杆于121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至室温，按照料水比(1:8)加入超纯水；再按照料水总重量的1％添加纤维素酶和0.5％添加乳酸菌；充分混合后，密闭，置于35℃厌氧发酵 10天，每天摇动3～4次，发酵好后，先用定性滤纸抽滤得到发酵液，再用0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物，于4℃保存即可。

实施例2：

将水稻秸杆分蘖枝于在自然条件下风干，粉碎过40目筛网，将粉碎好的秸杆于121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至室温，按照料水比(1:9)加入超纯水；再按照料水总重量的1.1％添加纤维素酶和 0.55％添加乳酸菌；充分混合后，密闭，置于35℃厌氧发酵20d，每天摇动3～4次，发酵好后，先用定性滤纸抽滤得到发酵液，再用 0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物，于4℃保存即可。

实施例3：

将水稻秸杆分蘖枝于在自然条件下风干，粉碎过40目筛网，将粉碎好的秸杆于121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至室温，按照料水比(1:10)加入超纯水；再按照料水总重量的1.2％添加纤维素酶和 0.6％添加乳酸菌；充分混合后，密闭，置于35℃厌氧发酵30d，每天摇动3～4次，发酵好后，先用定性滤纸抽滤得到发酵液，再用 0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物，于4℃保存即可。

实施例4

除水稻秸杆分蘖枝(QSD)由水稻秸秆(HSD)替换外，其余与实施例1相同。

实施例5

除水稻秸杆分蘖枝由大麦秸杆(DM)替换外，其余与实施例1 相同。

实施例6

除水稻秸杆分蘖枝由玉米秸杆(YM)替换外，其余与实施例1 相同。

实施例7

除水稻秸杆分蘖枝由甘蔗皮(GZP)替换外，其余与实施例1 相同。

实施例8

除水稻秸杆分蘖枝由红薯茎(HS)替换外，其余与实施例1相同。

实施例9

将培养到对数期的铜绿微囊藻用BG-11培养基稀释到初始密度为6.0×10⁶cells/ml,取100ml藻液加入到灭完菌的250ml锥形瓶中，按1.25％(v/v)添加实施例1、4、5、6、7、8所制的发酵液，同时设置空白对照组，每组设置3个重复，放置于光照强度4000Lx，光暗比12h:12h，温度(25±1)℃条件下培养。用血球计数板对铜绿微囊藻藻细胞进行计数，每24h计数一次，统计至168h。

藻密度：通过血球计数板计数法，计算出藻密度；比较不同处理组藻细胞密度的差异及变化趋势来反映发酵液对铜绿微囊藻生长的影响。

抑制率：通过抑制率公式计算出百分抑制率，公式为：

IR(％)＝(1-N/N₀)×100％

其中：IR表示抑制率；N表示不同处理组的藻密度 (cells/ml)；N0表示同期对照组的藻密度(cells/ml)。

采用Excel 2003进行数据初处理，通过SPSS 21.0软件对各组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用最小显著性差异 (LSD)方法进行多重比较检验，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01 表示有极显著差异,使用Probit过程计算时间序列上的ET50。

实施例1、4、5、6、7、8所制的发酵液对铜绿微囊藻藻细胞密度的影响由表1所示：

表1：

注：*表示与同期对照组具有差异性，**表示与同期对照组具有极显著差异性；

由表1所示：当初始添加量为1.25％(v/v)时，六种发酵液对铜绿微囊藻均有不同程度的抑制作用，试验前120h各实验组与同期对照组相比均具有极显著差异性(p<0.01)。其中HS、YM、HSD发酵液在前96h表现出一定的抑制效果，但在后续的实验中发现，这三种发酵液虽在一定程度上还起着控制铜绿微囊藻生长的作用，不过出现抑藻能力下降的情况，这是由于发酵液中有效控藻成分消耗和藻适应了胁迫环境后造成的。

实施例1、4、5、6、7、8所制的发酵液对铜绿微囊藻的抑制率由表2所示

表2

注：表中数据为平均值±SD(n＝3)

同一列，相同小写字母表示在0.05水平上无显著性差异；不同小写字母表示在0.05水平上有显著性差异。

同一行，相同大写字母表示在0.05水平上无显著性差异；不同大写字母表示在0.05水平上有显著性差异。

表3 1.25％不同发酵液Probit回归和ET₅₀估算

注：X使用底数为10的对数转换。

由表3可以看出QSD对铜绿微囊藻具有持续高效的抑制作用，在实验周期内最高可达到97.96％，且在时间序列上具有显著差异性 (p<0.05)；同时DM和GZP也都表现出了不错的抑制能力，抑制率都在80％以上；同时在发酵液之间也表现出了显著差异性 (p<0.05)。由表3可知抑制能力强弱的顺序为QSD＞DM＞HSD＞ YM＞GZP＞HS，但注意到HSD和YM的持续抑制能力弱，后期衰减程度大。综合以上结果最终得出不同发酵液对铜绿微囊藻抑制效应的强弱顺序QSD＞DM＞GZP＞YM＞HSD＞HS。

实施例10：

不同发酵时间QSD对铜绿微囊藻生长影响

将培养到对数期的铜绿微囊藻用BG-11培养基稀释到初始密度为6.0×10⁶cells/ml,取100ml藻液加入到灭完菌的250ml锥形瓶中，按1.25％(v/v)添加实施例1、2、3所制的发酵液，同时设置空白对照组，每组设置3个重复，放置于光照强度4000Lx，光暗比 12h:12h，温度(25±1)℃条件下培养。用血球计数板对铜绿微囊藻藻细胞进行计数，每24h计数一次，统计至96h。

实施例1、2、3所制的发酵液对铜绿微囊藻藻细胞密度的影响由表4所示：

表4：

注：**表示与同期对照组具有极显著差异性；

如表4所示：在发酵液添加量同为1.25％(v/v)的条件下，发酵时间为10d(实施例1)、20d(实施例2)和30d(实施例3)的 QSD均表现出抑制铜绿微囊藻生长的作用，各处理组下QSD作用后藻密度均低于同期对照组，且随着作用时间的增加差异愈发显著。处理组不同程度的出现白色絮状物作用24h时，各处理组与对照组就表现出极显著差异性(P﹤0.01)。96h时，30d组基本无结构完整的藻细胞。由此可得出，在相同条件下实验组QSD发酵时间与藻密度呈负相关，即发酵时间越长对铜绿微囊藻生长抑制效果越明显。

实施例1、2、3所制的发酵液对铜绿微囊藻的抑制率由表5所示

表5：

注：表中数据为平均值±SD(n＝3)

由表5可以得出在同一添加量同一时间下，不同发酵液在实验时间序列上都表现出显著差异性(p＜0.05)，表明在实验周期内随着作用时间的延长，抑制作用持续增强；但在同一添加量和同一时间下，20d和30d与10d的发酵液都表现出来显著差异性(p＜0.05)；20d和30d虽未表现出差异性，但从实际效果来看30d的发酵液具有更强的控藻能力。

实施例11：

QSD发酵液对铜绿微囊藻、蛋白核小球藻及斜生栅藻的抑制试验：

采用BG-11培养基培养铜绿微囊藻,蛋白核小球藻和斜生栅藻采用HB4培养基培养,将培养到对数期的铜绿微囊藻用BG-11培养基稀释到初始密度为3.5×10⁶cells/ml，蛋白核小球藻和斜生栅藻的初始藻密度分别为1.4×10⁶cells/ml和1.9×10⁶cells/ml；分别取三种藻各100ml藻液加入到灭完菌的250ml锥形瓶中，然后加入相应量的实施例3所制的QSD发酵液，根据预实验结果设置5个浓度梯度 0.25％、0.5％、0.75％、1％、和1.25％(v/v)，同时设置空白对照组，每组设置3个重复，放置于光照强度4000Lx，光暗比 12h:12h，温度(25±1)℃条件下培养。

用血球计数板对铜绿微囊藻藻细胞进行计数，每24h计数一次，统计至96h。

不同浓度实施例3所制的发酵液对铜绿微囊藻藻细胞密度的影响由表6所示：

表6：

如表6所示：各实验组的藻细胞密度在QSD发酵液作用下均有不同程度的变化。其中最低浓度处理组在整个试验周期内整体上表现出增长的趋势，且在第72h与同期对照组具有显著性差异 (P<0.05),96h与同期对照组具有极显著性差异(P<0.01)；

也可以看出高浓度处理组(0.50％、0.75％、1.00％和1.25％)的藻密度随着处理浓度增加而减少，且都从24h与同期对照组具有极显著性差异(P<0.01)；在96h时相对最大浓度处理(1.00％和 1.25％)组基本无完整藻细胞存在，可以直观体现出出相同抑制效果。

因此，不同QSD发酵液添加量对铜绿微囊藻有不同作用效果；低浓度处理组(0.25％)表现出促进作用；高浓度处理组表现出抑制作用，且浓度越高抑制效果越明显。

不同浓度实施例3所制的发酵液对铜绿微囊藻的抑制率由表7 所示：

表7：

如表7所示：除最低浓度处理组(0.25％)外，QSD发酵液对铜绿微囊藻的生长抑制体现出时间效应和剂量效应；即在同一浓度下，抑制率随着处理时间的延长而增大，在同一时间下，抑制率随着浓度的增大而增大。从第72h开始，高浓度处理组(0.75％、 1.00％和1.25％)抑制率均超过了80％；在96h最大浓度处理组抑制率达到95.66％。由此可得出，在QSD发酵液高浓度处理条件下，铜绿微囊藻的抑制率与处理浓度呈正相关性，即处理浓度越大，对铜绿微囊藻抑制效果越好。

不同浓度实施例3所制的发酵液对蛋白核小球藻藻细胞密度的影响由表8所示：

如表8所示：低浓度处理组(0.25％、0.50％和0.75％)在整个试验周期内对蛋白核小球藻都起到了一定的促进生长作用，而高浓度处理组(1.00％和1.25％)表现出抑制蛋白核小球藻生长的作用，且在48h时与同期对照组具有极显著性差异(P<0.01)。这表明QSD发酵液对蛋白核小球藻生长的影响具有选择性，表现出“低促高抑”的现象。在血球计数板计数过程中发现高浓度处理组对蛋白核小球藻的抑制作用表现在“抑制生长”而不是“杀死”藻细胞，这一点与 QSD发酵液对铜绿微囊藻的抑制效果相同。

不同浓度实施例3所制的发酵液对蛋白核小球藻的抑制率由表 9所示：

表9：

从表9中可以看出低浓度处理组的抑制效果不是很理想，甚至出现负值(表示对蛋白核小球藻生长起到促进作用)；高浓度处理组(1.00％和1.25％)起到了抑制作用，最好抑制效果出现在96h (1.25％)，抑制率为83.68％和QSD发酵液对铜绿微囊藻在72h(0.75％和1.00％)相仿。

不同浓度实施例3所制的发酵液对斜生栅藻藻细胞密度的影响由表10所示：

注：**表示与同期对照组具有极显著差异性不同浓度实施例3所制的发酵液对斜生栅藻的抑制率由表11所示：

表11

如表10、11所示：QSD与同期对照组相比对斜生栅藻具有一定抑制能力，但在整个实验周期内斜生栅藻的生物量却有所增加，这说明QSD对斜生栅藻只是起到了控制其快速繁殖的作用，并不是杀死藻细胞。

实施例12：

不同发酵方式QSD克藻实验

将QSD在自然条件下风干，粉碎过40目筛网备用。分别称取4 份30g粉末放入500ml三角烧瓶中封口，121℃高压蒸汽灭菌 20min；灭菌完成完全冷却后，于超净工作台中，按照料水比 (1:10)加入超纯水；再按照总量(330g)的1％添加纤维素酶、 0.5％添加乳酸菌、1％添加纤维素酶和0.5％添加乳酸菌以及空白添加剂组；封口充分混合后置于35℃下厌氧发酵10d，每天摇动3～4 次，最终得到空白发酵剂发酵组(W)、纤维素酶发酵组(X)、乳酸菌发酵组(R)和混合发酵组(X+R)4种不同发酵液，先用定性滤纸抽滤得到发酵液，再将其用0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物，4℃保存备用。

将培养到对数期的铜绿微囊藻用BG-11培养基稀释到初始密度为5.0×10⁶cells/ml,取100ml藻液加入到灭完菌的250ml锥形瓶中，然后加入不同发酵方式得到的QSD发酵液，添加量为1.25％ (v/v)，同时设置空白对照组，每组设置3个重复，放置于光照强度4000Lx，光暗比12h:12h，温度(25±1)℃条件下培养。用血球计数板对铜绿微囊藻藻细胞进行计数，每24h计数一次，统计至 96h。

QSD不同发酵方式发酵液对铜绿微囊藻藻密度的影响由表12所示：

由表12可以看出，各实验组(W、X、R和X+R)的藻细胞密度在试验期间均小于同期对照组，且与同期对照组的差距表现出一定的“时间-抑制”效应，即作用时间越长抑制效果越显著。在作用 24h开始，各处理组与对照组就表现出了极显著差异性(p＜ 0.01)，且(X+R)表现最佳抑制效果。

QSD不同发酵方式发酵液对铜绿微囊藻的抑制率由表13所示：

由表13可以看出W、X、R和X+R在同期实验条件下抑制效果具有差异性(p＜0.05)且发酵方式越复杂所表现出的抑制效果越显著；在同一发酵液处理下，抑制率随着时间的延长而增大，且具有差异性(p＜0.05)。在96h，除无添加发酵剂W组外，其余各组抑制率均超过80％，添加纤维素酶和乳酸菌组合组(X+R)的抑制率更是达到了95.68％，这表明添加发酵剂发酵QSD有助于QSD产出具有显著抑藻效果的物质，进一步提高抑制率。

Claims

1.来源于植物的抑藻剂的制备方法，其特征在于：将水稻秸杆分蘖枝于在自然条件下风干，粉碎过40目筛网，将粉碎好的秸杆于121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至室温，按照料水比(1:8-10)加入超纯水；再按照料水总重量的1-1.2％添加纤维素酶和0.5-0.6％添加乳酸菌；充分混合后，密闭，置于35℃厌氧发酵不小于10d，每天摇动3～4次，发酵好后，先用定性滤纸抽滤得到发酵液，再用0.22μm微孔滤膜过滤除去微生物，于4℃保存即可。