CN107974470B - 一种提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法，先将被孢霉进行正常的有氧恒温培养，当发酵液中的溶氧浓度低于预设阈值时，将发酵罐中的部分发酵清液排出至过滤器处理，将排出的发酵清液通入空气，将含有饱和空气的发酵清液通过水幕器喷淋输送回发酵罐，不足的发酵清液部分用无菌水补齐，当发酵罐中发酵液溶氧浓度变化不明显，且持续维持在预设阈值以上时，停止发酵清液的循环，继续培养至葡萄糖消耗完，停止发酵。本发明方法可维持高的菌体浓度，显著提高生长率及多不饱和脂肪酸油脂产率，且解决了被孢霉发酵过程中的菌体挂壁问题。该方法可普遍适用于好氧丝状菌的发酵生产，具有很好的工业应用前景。

Description

一种提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，更具体的说，涉及一种提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸，具有重要的生理功能，被广泛应用于营养品、医药和化妆品，尤其是婴幼儿食品和营养品领域。利用微生物发酵法生产多不饱和脂肪酸成为研究热点，多不饱和脂肪酸是一种胞内产物，产量与菌体生物量直接相关，提高菌体生物量对于提高多不饱和脂肪酸产量具有重要的意义。被孢霉(Mortierella)是常用于生产多不饱和脂肪酸的重要菌种，其中，高山被孢霉是用于生产ARA油脂的主要菌种，深黄被孢霉和拉曼被孢霉是用于生产γ-亚麻酸的主要菌种。被孢霉是好氧的丝状菌，丝状菌发酵具有的共同特性，即发酵过程容易结团，发酵液黏度较大，导致发酵过程氧传质困难，严重限制了发酵液中的溶氧水平，且发酵过程菌体易挂壁，显著降低菌体生物量。针对上述问题，申请号CN 201410556081.3的专利公开了一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，建立了溶氧阶段调控的发酵技术，虽可明显提高被孢霉多不饱和脂肪酸的含量和含量，但因发酵前期和发酵后期都需要维持较高的溶氧浓度，菌体密度高，氧传质困难，导致能耗相对较高。因此，通过常规的加大搅拌转速和增加通气量均很难有效提高发酵液中的溶氧浓度，且显著增加了能耗。因此，发酵液中的溶氧成为限制丝状菌的菌体生长和产物合成的重要因素之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一种提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法，解决现有被孢霉发酵过程中菌体易挂壁、溶氧浓度低、菌体密度进一步提高受限，从而导致多不饱和脂肪酸油脂产率低的问题。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案为：提供一种提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法，包括如下步骤：
S100.将制备好的被孢霉菌体种子液接入发酵培养基，有氧恒温培养，发酵过程中监测溶氧浓度；
S200.当溶氧浓度低于预设阈值时，发酵罐中的发酵液通过无菌的第一滤膜过滤，菌丝体留在发酵罐，发酵清液排出，当发酵罐中的发酵清液排出了总体积的20～40％时停止排放；排出的发酵清液送入无菌的第二滤膜过滤，过滤后的发酵清液，通入无菌空气，再次送回发酵罐作为培养基继续使用；
S300.当发酵液中的溶氧浓度再次低于所述预设阈值时，重复步骤S200，直至发酵罐中葡萄糖消耗完，结束发酵。
在本发明的提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法中，所述步骤S100中，所述有氧恒温培养的条件为：200～400rpm，通气量0.8～1.5vvm，25～30℃恒温培养。
在本发明的提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法中，所述步骤S200中，第一滤膜过滤使得被孢霉的菌丝体与发酵清液分离，菌丝体仍然留在发酵罐，发酵清液排出；发酵清液经过无菌的第二滤膜过滤，消除杂菌影响，通入无菌空气使其达到氧饱和状态，消除发酵体系中溶氧对于菌体密度的限制，且发酵清液通过水幕器喷淋方式送回发酵罐，解决了菌体挂壁的问题，从而显著提高了被孢霉菌体生物量及多不饱和脂肪酸油脂产量。
在本发明的提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法中，所述步骤S200中，所述预设阈值的取值位于10～20％氧的饱和百分比范围内。
在本发明的提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法中，所述步骤S200中，所述第一滤膜的孔径为50～200μm，所述第二滤膜的孔径小于0.22μm。
在本发明的提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法中，所述步骤S200中，返回的发酵清液体积需等同于排出的发酵清液体积，不足部分采用无菌水补齐。
在本发明的提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法中，所述步骤S200中，通过所述第二滤膜过滤后的发酵清液，通入无菌空气后通过水幕器喷淋送回发酵罐作为培养基继续使用。
在本发明的提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法中，所述被孢霉为高山被孢霉、深黄被孢霉、拉曼被孢霉中的任意一种。
实施本发明，具有如下有益效果：本发明通过将发酵罐中的部分发酵液过滤处理排出，将排出的发酵清液通入空气、富氧发酵清液通过水幕器喷淋方式输送回发酵罐的方式，解决了菌体挂壁的问题，实现了被孢霉菌体的大量生长及多不饱和脂肪酸油脂的大量合成。该方法可普遍适用于被孢霉属的各种被孢霉菌体的发酵生产以及其他好氧丝状菌，如小克银汉霉、腐霉等，具有很好的工业应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，对实施例描述中所使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法较佳实施例的流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
被孢霉为一种极好氧的丝状真菌，发酵液密度大、粘度高，溶氧浓度严重限制了菌体密度进一步提高，且菌体发酵过程中易挂壁，导致菌体密度及多不饱和脂肪酸油脂产量进一步降低，而提高搅拌转速容易打断菌丝体，因此，直接通过搅拌式发酵和气升式发酵搅拌转速的提高及通气量的增大都很难有效改善菌体挂壁及提高发酵液中的溶氧浓度，且显著增加了能耗。本发明的主要创新点在于，使用滤膜过滤的方式得到发酵清液，在罐体外溶解足够量的氧气后，再提高水幕器喷淋的方式回流进入发酵罐供菌体所需，克服了溶氧浓度对于菌体密度的限制，解决了菌体挂壁的问题，以达到提高菌体密度及多不饱和脂肪酸产量的目的。
图1为本发明提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法较佳实施例的流程图，如图1所示，本实施例的生产方法包括如下步骤：
S100.将制备好的被孢霉菌体种子液接入发酵培养基，有氧恒温培养，发酵过程中监测溶氧浓度；优选的，有氧恒温培养的条件为：200～400rpm，通气量0.8～1.5vvm，25～30℃恒温培养。
S200.当溶氧浓度低于预设阈值时，发酵罐中的发酵液通过无菌的第一滤膜过滤，菌丝体留在发酵罐，发酵清液排出，当发酵罐中的发酵清液排出了总体积的20～40％时停止排放；排出的发酵清液送入无菌的第二滤膜过滤，过滤后的发酵清液，通入无菌空气，再次送回发酵罐作为培养基继续使用，返回的发酵清液体积需等同于排出的发酵清液体积，不足部分采用无菌水补齐；优选的，预设阈值的取值位于10～20％氧的饱和百分比范围内；第一滤膜的孔径为50～200μm，第二滤膜的孔径小于0.22μm。
S300.当发酵液中的溶氧浓度再次低于预设阈值时，重复步骤S200，直至发酵罐中葡萄糖消耗完，结束发酵。
本发明可适用于不同种的被孢霉发酵及其对应的培养基，也同样适用于其他好氧丝状菌，如小克银汉霉、腐霉等。
实施例1
本实施例的提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法包括如下步骤：
1)灭菌
将配置好的发酵培养基加入发酵罐，发酵罐、发酵培养基、过滤装置以及连接的管路等进行蒸气灭菌；
2)有氧恒温培养
将制备好的高山被孢霉菌体种子液接入发酵培养基，100L发酵罐，200rpm，通气量1.5vvm，25℃恒温培养，发酵过程中监测溶氧浓度；
3)富氧发酵清液回流
当溶氧浓度低于10％氧的饱和百分比时，发酵罐中的发酵液通过无菌的第一滤膜过滤，第一滤膜的孔径为50～200μm，菌丝体留在发酵罐，发酵清液排出，当发酵罐中的发酵清液排出了总体积的20％时停止排放；排出的发酵清液送入无菌的第二滤膜过滤，第二滤膜的孔径小于0.22μm，过滤后的发酵清液，通入无菌空气，再次通过水幕器喷淋的方式送回发酵罐作为培养基继续使用，返回的发酵清液体积需等同于排出的发酵清液体积，不足部分采用无菌水补齐；
4)维持溶氧浓度继续发酵
当发酵液中的溶氧浓度再次低于10％氧的饱和百分比时，重复富氧发酵清液回流操作，始终维持溶氧浓度高于10％氧的饱和百分比，直至发酵罐中葡萄糖消耗完，结束发酵。
发酵结果：经过上述富氧发酵清液回流操作，生物量41.5g/L，油脂含量57.0％，ARA产量14.8g/L，ARA油脂生产率2.11g/L.d，较不循环发酵的结果ARA油脂生产率1.85g/L提高了14.1％。
实施例2
本实施例的提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法包括如下步骤：
1)灭菌
将配置好的发酵培养基加入发酵罐，发酵罐、发酵培养基、过滤装置以及连接的管路等进行蒸气灭菌；
2)有氧恒温培养
将制备好的深黄被孢霉菌体种子液接入发酵培养基，100L发酵罐，400rpm，通气量0.8vvm，30℃恒温培养，发酵过程中监测溶氧浓度；
3)富氧发酵清液回流
当溶氧浓度低于20％氧的饱和百分比时，发酵罐中的发酵液通过无菌的第一滤膜过滤，第一滤膜的孔径为50～200μm，菌丝体留在发酵罐，发酵清液排出，当发酵罐中的发酵清液排出了总体积的40％时停止排放；排出的发酵清液送入无菌的第二滤膜过滤，第二滤膜的孔径小于0.22μm，过滤后的发酵清液，通入无菌空气，再次通过管路回流的方式送回发酵罐作为培养基继续使用，返回的发酵清液体积需等同于排出的发酵清液体积，不足部分采用无菌水补齐；
4)维持溶氧浓度继续发酵
当发酵液中的溶氧浓度再次低于20％氧的饱和百分比时，重复富氧发酵清液回流操作，始终维持溶氧浓度高于20％氧的饱和百分比，直至发酵罐中葡萄糖消耗完，结束发酵。
发酵结果：
经过上述富氧发酵清液回流操作，生物量32.6g/L，油脂含量30.5％，油脂量9.94g/L，油脂生产率1.42g/L.d，较不循环发酵的油脂生产率1.28g/L提高了10.9％。
实施例3
本实施例的提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法包括如下步骤：
1)灭菌
将配置好的发酵培养基加入发酵罐，发酵罐、发酵培养基、过滤装置以及连接的管路等进行蒸气灭菌；
2)有氧恒温培养
将制备好的拉曼被孢霉菌体种子液接入发酵培养基，100L发酵罐，300rpm，通气量1.0vvm，27℃恒温培养，发酵过程中监测溶氧浓度；
3)富氧发酵清液回流
当溶氧浓度低于17％氧的饱和百分比时，发酵罐中的发酵液通过无菌的第一滤膜过滤，第一滤膜的孔径为50～200μm，菌丝体留在发酵罐，发酵清液排出，当发酵罐中的发酵清液排出了总体积的30％时停止排放；排出的发酵清液送入无菌的第二滤膜过滤，第二滤膜的孔径小于0.22μm，过滤后的发酵清液，通入无菌空气，再次通过水幕器喷淋的方式送回发酵罐作为培养基继续使用，返回的发酵清液体积需等同于排出的发酵清液体积，不足部分采用无菌水补齐；
4)维持溶氧浓度继续发酵
当发酵液中的溶氧浓度再次低于17％氧的饱和百分比时，重复富氧发酵清液回流操作，始终维持溶氧浓度高于17％氧的饱和百分比，直至发酵罐中葡萄糖消耗完，结束发酵。
发酵结果：
经过上述富氧发酵清液回流操作，生物量35.7g/L，油脂含量31.0％，油脂量11.07g/L油脂生产率1.58g/L较不循环发酵的油脂生产率1.43g/L提高了10.5％。
需要特殊说明的是，以上技术方案仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做出改动或修改，这些等价形式同样在本申请所附权利要求书所限定的范围之内。

Claims (6)

1.一种提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S100.将制备好的被孢霉菌体种子液接入发酵培养基，有氧恒温培养，发酵过程中监测溶氧浓度；
S200.当溶氧浓度低于预设阈值时，发酵罐中的发酵液通过无菌的第一滤膜过滤，菌丝体留在发酵罐，发酵清液排出，当发酵罐中的发酵清液排出了总体积的20～40％时停止排放；排出的发酵清液送入无菌的第二滤膜过滤，过滤后的发酵清液，通入无菌空气，再次送回发酵罐作为培养基继续使用；所述预设阈值的取值位于10～20％氧的饱和百分比范围内；
S300.当发酵液中的溶氧浓度再次低于所述预设阈值时，重复步骤S200，直至发酵罐中葡萄糖消耗完，结束发酵。
2.根据权利要求1所述提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法，其特征在于，所述步骤S100中，所述有氧恒温培养的条件为：200～400rpm，通气量0.8～1.5vvm，25～30℃恒温培养。
3.根据权利要求1所述提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法，其特征在于，所述步骤S200中，所述第一滤膜的孔径为50～200μm，所述第二滤膜的孔径小于0.22μm。
4.根据权利要求1所述提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法，其特征在于，所述步骤S200中，返回的发酵清液体积需等同于排出的发酵清液体积，不足部分采用无菌水补齐。
5.根据权利要求1所述提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法，其特征在于，所述步骤S200中，通过所述第二滤膜过滤后的发酵清液，通入无菌空气后通过水幕器喷淋送回发酵罐作为培养基继续使用。
6.根据权利要求1所述提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法，其特征在于，所述被孢霉为高山被孢霉、深黄被孢霉、拉曼被孢霉中任意一种。
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